專(zhuān)利名稱(chēng)：從全血樣本中直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從全血樣本中直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種將極微量的核酸樣本擴(kuò)大數(shù)百萬(wàn)甚至數(shù)億倍的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，以其簡(jiǎn)單、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)在生物科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域被廣泛使用。通常，PCR擴(kuò)增需要基因組DNA作為模板，而基因組DNA是從外周血中提取而得。目前常用于提取外周血中DNA的方法有酚/氯仿提取法、鹽析法、碘化鉀法、煮沸裂角軍法等Carpi FM, DiPietro F, Vincenzetti S，et al. Human DNA extraction methods patents and applications. Recent Patents on DNA & Gene Sequences 2011,5(1) 1-7.基于這些方法原理開(kāi)發(fā)了很多商品化的DNA提取試劑盒。盡管如此，提取DNA的操作仍然繁瑣而費(fèi)時(shí)，DNA質(zhì)量也參差不齊，而且容易造成樣本間交叉污染。如果不經(jīng)過(guò)DNA提取，而直接從全血進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則可以大大節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間和成本，同時(shí)避免因繁多步驟造成的樣本間交叉污染。Kogan SC等最早采用簡(jiǎn)單的加熱法將血液樣本煮沸后，取上清液用于PCR擴(kuò)增，取得了不錯(cuò)的結(jié)果Kogan SC, Doherty Μ, Gitschier J. An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequences. Application to hemophilia A. The New England Journal of Medicine 1987,317(16) :985-990. ;;tM，Mercier B,Mercier B,Gaucher C, Feugeas 0, et al. Direct PCR from whole blood, without DNA extraction. Nucleic Acids Research 1990，18 :5908.禾口 Mccusker J 等Mccusker J, Dawson MT，Noone D, et al. Improved method for direct PCR amplification from whole blood. Nucleic Acids Research 1992,20(24) :6747.在PCR擴(kuò)增前分別采用95°C預(yù)加熱或3個(gè)預(yù)變性循環(huán)的方法以消除血液中PCR抑制成分的影響，實(shí)現(xiàn)了從全血直接進(jìn)行DNA擴(kuò)增；Ohhara M等利用超聲技術(shù)對(duì)血液樣本進(jìn)行預(yù)處理之后也實(shí)現(xiàn)了 PCR擴(kuò)增Ohhara Μ, Kurosu Y， Esumi Μ. Direct PCR of whole blood and hair shafts by microwave treatment. Biotechniques 1994,17 :726,728. ] 雖然這些方法以全血為起始模板實(shí)現(xiàn)了 PCR擴(kuò)增， 但仍需對(duì)血液樣本進(jìn)行預(yù)處理，增加了操作步驟，而且條件難以控制、重復(fù)性差、不能形成商品化試劑盒、不利于推廣使用。此外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者還相繼報(bào)道了多種從全血直接進(jìn)行 PCR ±曾的^titYang YG, Kim JY, Song YH, et al. A novel buffer system, AnyDirect, can improve polymerase chain reaction from whole blood without DNA isolation. Clinica Chimica Acta 2007，380 (1-2) :112-117.。然而，這些方法中所加試劑并沒(méi)有完全公開(kāi)。因此，研究和開(kāi)發(fā)全血直接PCR擴(kuò)增法尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒，解決了現(xiàn)有技術(shù)中以全血為起始模板直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)需要對(duì)全血進(jìn)行預(yù)處理造成操作步驟繁瑣等問(wèn)題。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒，其特征在于所述試劑盒的核酸反應(yīng)體系內(nèi)包括用于特異性擴(kuò)增目的基因靶向序列的若干個(gè)引物對(duì)、PCR緩沖液、dNIPs、 MgCl2, Taq DNA聚合酶；且體系內(nèi)三羥甲基氨基甲烷的濃度在25-lOOmmol/L之間，鎂離子濃度在1.5-3. Ommol/L之間，甘油濃度在10% -14%之間。優(yōu)選的，所述核酸反應(yīng)體系內(nèi)三羥甲基氨基甲烷的濃度在25-lOOmmol/L之間，鎂離子濃度在1.5-3. Ommol/L之間，甘油濃度在10% -14%之間。優(yōu)選的，所述核酸反應(yīng)體系內(nèi)三羥甲基氨基甲烷的濃度在40-80mmol/L之間，鎂離子濃度在1. 5-3. Ommol/L之間，甘油濃度在10% -14%之間。最優(yōu)選的，所述核酸反應(yīng)體系內(nèi)三羥甲基氨基甲烷的濃度在50mmol/L，鎂離子濃度在2mmol/L，甘油濃度在10%。優(yōu)選的，所述PCR緩沖液包括Tris. Cl、氯化鉀、硫酸銨、氯化鎂；_20°C下pH值在 8. 0-9. 0 間。所述核酸反應(yīng)體系的終濃度組成為
PCR緩沖液含 25-100mmol/L Tris,50mmol/L KCl ；
dNTPs0. 01 0. 2mmol/L ；
引物序列0. 01 0. 4ymol/L ；
TaqDNA聚合酶0. 01 0. 025U/y L ；
MgCl21. 5-3. 0mmol/L ；
甘油10% -14%。
優(yōu)選的，所述核酸？反應(yīng)體系的終濃度組成為
PCR緩沖液含 25-100mmol/L Tris,50mmol/L KCl ；
dNTPs0. 2mmol/L ；
引物序列0. 4μ mol/L ；
TaqDNA聚合酶0. 025U/y L ；
MgCl21. 5-3. Ommol/L ；
甘油10% -14%。
優(yōu)選的，所述核酸？反應(yīng)體系的終濃度組成為
PCR緩沖液含 50 100mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0)，
50mmol/L KCl ；
dNTPs0. 2mmol/L ；
引物序列0. 4 μ mol/L ；
TaqDNA聚合酶0. 025U/y L ；
MgCl21. 5-2. 5mmol/L ；
甘油10% -12%。
本發(fā)明還提供了-一種從全血樣本中直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，其特征在于所述方
法包括取全血樣本作為起始材料，將全血樣本加入權(quán)利要求1所述的以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒或?qū)?quán)利要求1所述的以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑體系加入全血樣本中，直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。優(yōu)選的，所述方法中全血樣本選自人或動(dòng)物的液體血液或干血。優(yōu)選的，所述方法中液體血液為加入抗凝劑的血液或不加抗凝劑的血液；所述抗凝劑選自乙二胺四乙酸二鈉鹽、乙二胺四乙酸二鉀鹽、乙二胺四乙酸三鉀鹽、草酸鈉、草酸鉀、肝素和枸椽酸鈉的一種或兩種以上的組合。優(yōu)選的，所述方法中干血為加入抗凝劑的血液或不加抗凝劑的血液附著于固體表面干燥形成的血塊。本發(fā)明的又一目的在于提供一種以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒在進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)、鏈置換反應(yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增方面的應(yīng)用。本發(fā)明從全血直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)主要在于核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑中三種因素的比例和濃度。從全血樣本中直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，取全血樣本作為起始材料，加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑，直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物，核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑中三羥甲基氨基甲烷的濃度在25-lOOmmol/L之間，鎂離子濃度在1.5-3. Ommol/L之間，甘油濃度在 10% -14%之間。其中，全血是指來(lái)自于人或動(dòng)物的液體血液或干血。液體血液是指加入抗凝劑的血液或不加抗凝劑的血液；抗凝劑包括乙二胺四乙酸二鈉鹽、乙二胺四乙酸二鉀鹽、乙二胺四乙酸三鉀鹽、草酸鈉、草酸鉀、肝素和枸椽酸鈉等；干血是指加入抗凝劑的血液或不加抗凝劑的血液附著于固體表面干燥形成，如濾紙血、布料血等。本發(fā)明可以從全血直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增，直接的含義是指不經(jīng)過(guò)從血液樣本中提取基因組DNA而進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明采用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑不含鹽酸、聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯(吐溫-20)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、二甲基亞砜、牛血清白蛋白和二硫蘇糖醇等。這種核酸擴(kuò)增技術(shù)可以應(yīng)用在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)、 鏈置換反應(yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)中。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指用于PCR反應(yīng)的混合物，它包括反應(yīng)所需的緩沖液(buffer)、dNTP混合液、引物、MgCl2、Taq酶，有時(shí)也包括用于標(biāo)識(shí)反應(yīng)結(jié)果的熒光染料。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點(diǎn)，在上述條件下可以誘發(fā)合成與核酸鏈相互補(bǔ)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液并在合適的溫度下進(jìn)行上述合成。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長(zhǎng)度取決于該引物的設(shè)計(jì)用途，但在一般在15 25 個(gè)核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不必是反應(yīng)模板的準(zhǔn)確序列，但必須充分互補(bǔ)，已與模板雜交并引發(fā)DNA合成。引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下原則1.引物應(yīng)在核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 2.產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。3.引物長(zhǎng)度一般在15 30堿基之間。4.G+C含量在40% 60%之間。5.堿基要隨機(jī)分布。6.引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。7.引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。8.引物5'端可以修飾。9.引物3'端不可修飾。10.引物3' 端要避開(kāi)密碼子的第3位。11.引物3'端不能選擇A，最好選擇T。12.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，可以通過(guò)Primer Premier 5，Beacon Designer 7軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，將設(shè)計(jì)好的序列通過(guò)人工合成方法得到。引物合成一般使用亞磷酰胺三酯法將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過(guò)3' -5'磷酸二酯鍵連接。其具體步驟可以是1、將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5 ‘-羥基的保護(hù)基團(tuán) DMT，獲得游離的5'-羥基。2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。3、帶帽(cap ping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù) 5'-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。最后通過(guò)氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來(lái)，通過(guò)OPC，PAGE等手段純化引物。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明得到一種利用液體全血或干血樣本為起始材料，不經(jīng)過(guò)從血液樣本中提取基因組DNA而直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法，全血樣本直接加到擴(kuò)增反應(yīng)管，不需進(jìn)行任何預(yù)處理，該方法改進(jìn)常規(guī)核酸擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液以實(shí)現(xiàn)從全血直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增。通過(guò)調(diào)節(jié)PCR緩沖液中三羥甲基氨基甲烷、鎂離子和甘油的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)直接擴(kuò)增。該方法不經(jīng)過(guò)核酸的分離和純化過(guò)程，也不需對(duì)全血樣本進(jìn)行任何前處理，即可從含有大量抑制核酸擴(kuò)增物質(zhì)的全血樣本中高效率地放大目的核酸，可用于檢測(cè)微量全血樣本中的核酸。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為不同濃度的三羥甲基氨基甲烷對(duì)PCR擴(kuò)增的影響；圖2為不同濃度的鎂離子對(duì)PCR擴(kuò)增的影響；圖3為不同濃度的甘油對(duì)PCR擴(kuò)增的影響；圖4為以全血為起始材料采用全血擴(kuò)增緩沖液與多重等位基因特異性擴(kuò)增法同時(shí)測(cè)定三個(gè)與食管癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的結(jié)果圖；圖5為以基因組DNA為起始材料采用全血擴(kuò)增緩沖液與多重等位基因特異性擴(kuò)增法同時(shí)測(cè)定三個(gè)與食管癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠(chǎng)家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1 27 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例使用單一因素優(yōu)化試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)含不同濃度三羥甲基氨基甲烷、鎂離子和甘油的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液對(duì)擴(kuò)增效率的影響；其中實(shí)施例1 9將Tris堿濃度分別控制在 0、10、25、50、75、100、125、150和 200mmol/L，鎂離子濃度采用 2. Ommol/L，甘油濃度為 10%， 其他條件穩(wěn)定；實(shí)施例10 18將鎂離子濃度分別控制在0、0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0、 3. 5和4. Ommol/L ；Tris堿濃度分別控制在50mmol/L，甘油濃度為10%，其他條件穩(wěn)定；實(shí)施例19 27將甘油濃度分別控制在0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%和16%，Tris堿濃度分別控制在50mmol/L，鎂離子濃度采用2. Ommol/L，其他條件穩(wěn)定。1.實(shí)驗(yàn)材料血液樣本，分別用三種不同的抗凝劑(乙二胺四乙酸二鈉鹽、肝素和枸櫞酸鈉)處理；Taq DNA聚合酶和dNTPs (FERMENTASINC, USA)；引物PI、P2由金思特科技(南京)有限公司合成，PAGE級(jí)；瓊脂糖(LP0028A, Oxoid Ltd, UK) ；Tris堿和溴化乙錠 (EtBr)均為上海生工生物公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純。所有溶液均由滅菌去離子水配制。引物 Pl 序列5' -GGA CAT CAC CCT CAC TTA CC-3'；引物 P2 序列5' -TCC TTC CCT CTC TCC TTC TG-3'。儀器PCR擴(kuò)增儀(PTC-200，BIO-RAD Inc，USA) ；P0WERBC6003En 型電泳儀(上海申能博彩生物科技有限公司)；GeneGenius凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE Co Ltd，UK)。2.實(shí)驗(yàn)方法在PCR反應(yīng)液05 μ L)中加入1 μ L抗凝劑處理的人外周血，利用引物Pl和Ρ2擴(kuò)增CCNDl基因片段，產(chǎn)物長(zhǎng)度為194bp。反應(yīng)其他條件反應(yīng)體系中加入Tris、MgCl2、甘油、0. 5-5 μ L抗凝血、50mmol/L 1((1、引物卩1和卩2各0.4“11101/1、0.211111101/1 dNITs 和 0. 625UTaq DNA 聚合酶。放入PCR儀中，94°C預(yù)變性IOmin ；然后以94°C變性20s，55°C退火30s，72°C延伸 45s，循環(huán)40次；最后72°C延伸7min使反應(yīng)完全；16°C保存。反應(yīng)完成后，取反應(yīng)產(chǎn)物3 μ L 在2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(1ΧΤΑΕ電泳緩沖液，8V/cm恒壓電泳lOmin)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖1所示。圖1 3分別為不同濃度的三羥甲基氨基甲烷、 鎂離子和甘油對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。圖1中泳道1 9，Tris堿濃度分別為0、10、25、50、75、 100、125、150 和 200mmol/L ；圖 2 中泳道 10 18，鎂離子濃度分別為 0,0. 5,1. 0,1. 5,2. 0、 2. 5,3. 0,3. 5和4. 0mmol/L ；圖3中泳道19 24的甘油濃度分別為0、2%、4%、6%、8%、 10%、12%、14%和16%。箭頭所指條帶為目的擴(kuò)增片段；M表示DNA marker。當(dāng)1Tris堿濃度為25 100mmol/L(圖1泳道3 6)時(shí)能擴(kuò)增出目的DNA片段； 當(dāng)MgCl2濃度為1. 5 3. 0mmol/L (圖2泳道13 16)時(shí)能擴(kuò)增出目的DNA片段；當(dāng)甘油濃度為10% 14% (圖3泳道對(duì) 沈)時(shí)能擴(kuò)增出目的DNA片段；其中，Tris堿、MgCl2和甘油濃度分別為50mmol/L(圖1泳道4)、2. 0mmol/L(圖2泳道14)和10% (圖3泳道24) 時(shí)擴(kuò)增效果最好。實(shí)施例觀(guān)食管癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)本實(shí)施例用于同時(shí)測(cè)定三個(gè)與食管癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)1.實(shí)驗(yàn)材料采用不同的抗凝劑(乙二胺四乙酸二鈉鹽、枸櫞酸鈉)處理的血液樣本；基因組DNA，采用酚/氯仿提取法提取；9條引物序列見(jiàn)表1，由金思特科技(南京) 有限公司合成，PAGE級(jí)；其他材料同實(shí)施例1。基因組DNA采用如下辦法進(jìn)行提取
1)采樣抽取病人外周血l_2ml于枸櫞酸納(1 9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管。吸抗凝管中部分的血液至離心管SOOOrpm離心5分鐘，分離血漿和細(xì)胞。血漿小心移入另一無(wú)菌管子，注意不要吸到白細(xì)胞，_20°C保存(1周)，管身標(biāo)示病人名字和編號(hào)， 注明日期。幻提取采用酚/氯仿提取法提取，提取的DNA-20 °C保存。2.實(shí)驗(yàn)方法本例采用全血擴(kuò)增技術(shù)與多重等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)Roberts R, Joyce P, and Kennedy MA. Rapid and comprehensive determination of cytochrome P450 CYP2D6 poor metabolizer genotypes by multiplex polymerase chain reaction. Human Mutation 2000,16 :77-85.相結(jié)合，測(cè)定與食管癌相關(guān)的3個(gè)SNP位點(diǎn)rs671、 rsl3181和rsl048943，即在兩只PCR管(管W和管M)中分別加入3對(duì)引物(管W中加入 Pffl/PSU PW2/PS2、PW3/PS3 ；管 M 中加入 PM1/PS1、PM2/PS2、PM3/PS3)進(jìn)行 3 重等位基因特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為343、462、188bp ；然后用瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；由于每管與多態(tài)性位點(diǎn)的兩種等位基因中的一種對(duì)應(yīng)，可以根據(jù)每管中擴(kuò)增片段的大小判斷多態(tài)性的基因型。如果同一長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段只在一管中出現(xiàn)，則為純合子；如果在兩管中同時(shí)出現(xiàn)則為雜合子。擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系中加入75mmol/L Tris、2. 0mmol/L MgCl2、10%甘油、分別加入 IyL抗凝血或 IOOng 基因組 DNA、5(toimol/L KC1、引物(管 W 中加入 PW1/PS1、PW2/PS2、 PW3/PS3 ；管 M 中加入 PM1/PS1、PM2/PS2、PM3/PS3)各 0. 4μ mol/L、0. 2mmol/L dNTPs 和 1.25U Taq DNA聚合酶。放入PCR儀中，94°C預(yù)變性IOmin ；然后以94°C變性20s，55°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)40次；最后72°C延伸7min使反應(yīng)完全；16°C保存。反應(yīng)完成后，取反應(yīng)產(chǎn)物3 μ L在2. 0 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(1 X TAE電泳緩沖液，8V/cm恒壓電泳 30min)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。表1引物序列
SNP引物名引物序列(5’—30產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)rs671PWlCACACTCACAGTTTTCACGTC343PMlCACACTCACAGTTTTCACGTTPSlGCAGGAGAATCTCTTGAACCrsl3181PW2AGCAATCTGCTCTATCCTGTT462PM2AGCAATCTGCTCTATCCTGTGPS2GCCCTCAGCAAAGAGAAGTTrsl048943PW3GAAGTGTATCGGTGAGAGCA188PM3GAAGTGTATCGGTGAGAGCGPS3GGCTCTCAAGCACCTAAGAG 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖4和圖5所示。兩種擴(kuò)增起始材料(抗凝血和基因組DNA) 均得出相同的結(jié)果。四個(gè)樣本中3個(gè)SNP位點(diǎn)rs671、rsl3181和rsl048943的基因型分別為樣本1為CC、GA、AA ；樣本2為CC、GG、AA ；樣本3為AC、GA、AG ；樣本4為AC、GG、GG。 該結(jié)果與Sanger’ s測(cè)序技術(shù)測(cè)得結(jié)果完全一致。因此，本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)試劑可以從全血直接擴(kuò)增出目的核酸片段，不需預(yù)先從全血中分離純化出基因組DNA。圖4和圖5均為采用全血擴(kuò)增緩沖液與多重等位基因特異性擴(kuò)增法同時(shí)測(cè)定三個(gè)與食管癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的結(jié)果圖。圖4是以全血為起始材料的4個(gè)樣本的3 重等位基因特異性擴(kuò)增結(jié)果；圖5是以基因組DNA為起始材料的4個(gè)樣本的3重等位基因特異性擴(kuò)增結(jié)果。M表示DNAmarker。上述實(shí)例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒，其特征在于所述試劑盒的核酸反應(yīng)體系內(nèi)包括用于特異性擴(kuò)增目的基因靶向序列的若干個(gè)引物對(duì)、PCR緩沖液、dNTPs、 MgCl2、Taq DNA聚合酶；且體系內(nèi)三羥甲基氨基甲烷的濃度在25-100 mmol/L之間，鎂離子濃度在1. 5-3. 0 mmol/L之間，甘油濃度在10%_14%之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒，其特征在于所述核酸反應(yīng)體系內(nèi)三羥甲基氨基甲烷的濃度在25-100 mmol/L之間，鎂離子濃度在1. 5-3. 0 mmo 1 /L之間，甘油濃度在10%-14%之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒，其特征在于所述核酸反應(yīng)體系內(nèi)三羥甲基氨基甲烷的濃度在40-80 mmol/L之間，鎂離子濃度在1.5-3.0 mmol/L之間，甘油濃度在10%_14%之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒，其特征在于所述 PCR緩沖液包括Tris . Cl、氯化鉀、硫酸銨、氯化鎂；-201下？!1值在8.0-9.0間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒，其特征在于所述核酸反應(yīng)體系的終濃度組成為PCR緩沖液含25-100 mmol/L Tris, 50mmol/L KCl ；dNTPs 0.01 0.2 mmol/L;引物序列 0.01 0.4 μ mol/L ;TaqDNA 聚合酶 0.01 0.025 U/ μ L ；MgCl2 1. 5-3. 0 mmol/L ；甘油 10%_14%。
6.一種從全血樣本中直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，其特征在于所述方法包括取全血樣本作為起始材料，將全血樣本加入權(quán)利要求1所述的以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒或?qū)?quán)利要求1所述的以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑體系加入全血樣本中，直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中全血樣本選自人或動(dòng)物的液體血液或干血。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中液體血液為加入抗凝劑的血液或不加抗凝劑的血液；所述抗凝劑選自乙二胺四乙酸二鈉鹽、乙二胺四乙酸二鉀鹽、乙二胺四乙酸三鉀鹽、草酸鈉、草酸鉀、肝素和枸椽酸鈉的一種或兩種以上的組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中干血為加入抗凝劑的血液或不加抗凝劑的血液附著于固體表面干燥形成的血塊。
10.一種以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒在進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)、鏈置換反應(yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種以全血為起始模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)試劑盒，其特征在于所述試劑盒的核酸反應(yīng)體系內(nèi)包括用于擴(kuò)增目的基因靶向序列的若干個(gè)引物對(duì)；且體系內(nèi)三羥甲基氨基甲烷的濃度在25-100mmol/L之間，鎂離子濃度在1.5-3.0mmol/L之間，甘油濃度在10%-14%之間。該試劑盒不經(jīng)過(guò)核酸的分離和純化過(guò)程，也不需對(duì)全血樣本進(jìn)行任何前處理，即可從含有大量抑制核酸擴(kuò)增物質(zhì)的全血樣本中高效率地放大目的核酸。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102286473SQ201110264868
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者汪維鵬 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)