專利名稱：一種用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照，更具體而言涉及一種用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的對(duì)照樣品在實(shí)驗(yàn)中的作用是在每次RT-PCR檢測(cè)時(shí)，設(shè)立的陰性對(duì)照樣品和陽(yáng)性對(duì)照樣品是不能缺少的，陰性對(duì)照樣品檢測(cè)為陰性時(shí)，表明試驗(yàn)全部過程的試劑沒有受到污染；陽(yáng)性對(duì)照樣品檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)，表明RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對(duì)照樣品和陽(yáng)性對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果都成立的前提下，才能對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行判定。因此，每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)立RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄、 DNA擴(kuò)增和電泳鑒定對(duì)照，只有設(shè)立試驗(yàn)全程的對(duì)照，才能證明試驗(yàn)結(jié)果成立。因此，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒要設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，試劑盒中陽(yáng)性對(duì)照需要滿足以下三點(diǎn)1)穩(wěn)定性好，2)可靠有效，3)符合生物安全。生物安全是指生物性的傳染媒介通過直接感染或間接破壞環(huán)境而導(dǎo)致對(duì)人類、動(dòng)物或者植物的真實(shí)或者潛在的危險(xiǎn)。因此，符合生物安全是指避免了上述危險(xiǎn)。所述危險(xiǎn)例如是高致病性病原微生物，第一類和第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物，第一類病原微生物，是指能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。第二類病原微生物，是指能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物。對(duì)于一些高致病性病原微生物的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照，目前大多數(shù)這種試劑盒做法是將目的片段克隆至載體上，其缺點(diǎn)是不能作為RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄過程對(duì)照，且容易污染。因此，亟需一種穩(wěn)定性好、可靠有效、符合生物安全的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒陽(yáng)性對(duì)照的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性組合物對(duì)照，特別是陽(yáng)性對(duì)照組合物及其制備方法，該方法制得的陽(yáng)性對(duì)照穩(wěn)定性好、安全可靠、可大大減少試驗(yàn)污染的可能性。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供了一種反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物的制備方法，其特征在于，選取一種非靶病毒作為陽(yáng)性對(duì)照模板。本發(fā)明的一個(gè)方面，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物的制備方法中選取的非靶病毒為RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于雞新城疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，并且選自比較安全、遺傳穩(wěn)定、容易培養(yǎng)的病毒株。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所選取的非靶病毒株雞新城疫病毒Iasota株和豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV株。本發(fā)明的還一個(gè)方面，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物的制備方法中還包括使用滅活試劑處理所述非靶病毒的培養(yǎng)液。所述滅活試劑為高濃度強(qiáng)變性劑， 其迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使RNA從細(xì)胞中釋放出來，還使細(xì)胞內(nèi)的RNA酶失活，使釋放出的RNA 不被降解。其中，高濃度強(qiáng)變性劑包括但不限于異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍等含有胍基的鹽。滅活試劑可用于RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照的滅活。也就是說，在本發(fā)明所述的方法中將非靶病毒培養(yǎng)液用變性劑進(jìn)行稀釋，稀釋的倍數(shù)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，一般應(yīng)稀釋不小于7倍，優(yōu)選地稀釋50-100倍，更優(yōu)選地稀釋50倍。稀釋倍數(shù)與病毒含量有關(guān)，其中陽(yáng)性對(duì)照的要求是病毒含量既不能太高，也不能太低；太高了，容易污染試劑盒，太低了，使試劑盒的保存期較短。根據(jù)各自試劑盒的要求進(jìn)行稀釋。本發(fā)明的還一個(gè)方面，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物的制備方法中還包括設(shè)計(jì)一對(duì)非靶病毒引物，對(duì)所述選取的非靶病毒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒所針對(duì)目的基因的長(zhǎng)度相同本發(fā)明還提供了一種用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物，其特征在于包括一種非靶病毒作為陽(yáng)性對(duì)照模板。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，陽(yáng)性對(duì)照組合物中選取的非靶病毒為RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于雞新城疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，并且選自安全、遺傳穩(wěn)定、容易培養(yǎng)的病毒株，優(yōu)選的所述病毒株包括雞新城疫病毒Iasota株和豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV株。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，陽(yáng)性對(duì)照組合物還包括滅活試劑。滅活試劑為高濃度強(qiáng)變性劑。其中，高濃度強(qiáng)變性劑包括但不限于含有胍基的鹽，優(yōu)選的是異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍。滅活試劑可用于RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照的滅活。所述非靶病毒的培養(yǎng)液用根據(jù)病毒含量所述滅活試劑進(jìn)行稀釋，一般應(yīng)稀釋不小于7倍，優(yōu)選地稀釋50-100 倍，更優(yōu)選地稀釋50倍。而稀釋倍數(shù)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)各自試劑盒的要求容易地確定。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，陽(yáng)性對(duì)照組合物還包括一對(duì)非靶病毒引物，以對(duì)所述非靶病毒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒針對(duì)的目的基因的長(zhǎng)度相同。本發(fā)明還提供了上文所述陽(yáng)性對(duì)照組合物的用途，其用作反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的部分。本發(fā)明的陽(yáng)性對(duì)照組合物可以置于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒中。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所適用的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒包括但不限于禽流感病毒RT-PCR試劑盒和口蹄疫病毒RT-PCR試劑盒，其中禽流感病毒RT-PCR試劑盒可用于禽類，例如雞、鴨、鵝、麻雀、鴿子等等；口蹄疫病毒RT-PCR試劑盒可用于檢測(cè)偶蹄動(dòng)物，例如牛。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法制備的陽(yáng)性對(duì)照安全、易保存，可以起到RNA提取、 RNA反轉(zhuǎn)錄過程對(duì)照的作用，證明RNA提取試劑、反應(yīng)體系中的反轉(zhuǎn)錄酶等活性正常，避免了現(xiàn)有技術(shù)中直接使用病毒感染材料易造成病毒擴(kuò)散的缺點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。利用檢測(cè)靶病毒作為陽(yáng)性對(duì)照是一種理想的方法。由于禽流感發(fā)生會(huì)給國(guó)家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且禽流感屬于人畜共患病。因此，禽流感病毒檢測(cè)試劑盒生物安全是非常重要的。特別是禽流感病毒作為陽(yáng)性對(duì)照可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境產(chǎn)生一些不安全的影響。雞新城疫病毒Iasota株為一株弱毒疫苗株，廣泛應(yīng)用我國(guó)雞新城疫免疫接種，在預(yù)防雞新城疫方面發(fā)揮了十分重要的作用。同時(shí)該病毒毒株在雞胚培養(yǎng)中血凝效價(jià)很高， 最高可達(dá)到2_13，是比較安全、遺傳穩(wěn)定、容易培養(yǎng)的病毒株。因此雞新城疫病毒Iasota株是設(shè)立反轉(zhuǎn)錄陽(yáng)性對(duì)照的理想病毒。我們采用雞新城疫病毒Iasota株作為RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄陽(yáng)性對(duì)照，起到了 RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄過程對(duì)照的作用，證明了 RNA提取試劑、反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄酶等活性正常。同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)雞新城疫病毒的引物，此引物要求擴(kuò)增的片段大小恰好與所檢測(cè)的禽流感病毒擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相一致。加入含異硫氰酸胍的滅活試劑， 將雞新城疫病毒滅活，作為禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照，由于RNA 提取過程中采用了雞新城疫病毒Iasota株作為提取對(duì)照，大大減少了試驗(yàn)污染的可能性， 比較適合長(zhǎng)期進(jìn)行禽流感檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室或大規(guī)模的禽流感監(jiān)測(cè)。


圖1.實(shí)施例2中陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。其中各個(gè)泳道分別是1. Marker 2.陽(yáng)性對(duì)照3.樣品4.陰性對(duì)照。圖2.實(shí)施例3中陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。其中各個(gè)泳道分別是1. Marker 2.陽(yáng)性對(duì)照3.樣品4。陰性對(duì)照。實(shí)施例實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件 (例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社) 或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1.禽流感病毒RT-PCR試劑盒陽(yáng)性對(duì)照的制備1、滅活試劑的配制4mol/L異硫氰酸胍，25m mol/L 二水檸檬酸鈉，0. 5 % (m/v) 十二烷基硫酸鈉，0. lmol/L β -巰基乙醇。2、非靶病毒雞新城疫病毒Iasota株(來源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，原種代號(hào) AVlOO(L))將血凝價(jià)高于2048的雞新城疫病毒Iasota株雞胚尿囊液合并、混勻。3、陽(yáng)性對(duì)照的制備將非靶病毒雞新城疫病毒Iasota株用變性液100倍稀釋后， 可作為禽流感病毒RT-PCR試劑盒陽(yáng)性對(duì)照使用。實(shí)施例2.禽流感病毒RT-PCR試劑盒陽(yáng)性對(duì)照的應(yīng)用1、試劑盒的組成0. 2mL 薄壁 PCR 管、RNA 提取試劑盒(Rneasy Mini Kit, qiagen 公司)、δ0 倍 TAE 電泳緩沖液、染色液(Goldview)、上樣緩沖液(溴酚藍(lán)蔗糖溶液)、陰性對(duì)照(即滅菌去離子水)、陽(yáng)性對(duì)照(即實(shí)施例1中所制備的陽(yáng)性對(duì)照)、RT-PCR反應(yīng)液(引物、dNTPs、TaqDNA 聚合酶所帶的反應(yīng)緩沖液、Mg2+)、酶混合液(AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA抑制劑、TaqDNA聚合酶)、X 液(如下所述)。2、樣品制備2. 1樣品采集病死雞的喉氣管和肺組織。2. 2樣品處理每份樣品分別處理。2. 2. 1組織樣品處理每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約lg，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0. 05g于研磨器中研磨，加入1. 5mL生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1. 5mL 滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100 μ L于1. 5mL滅菌離心管中。2. 2. 2陽(yáng)性對(duì)照處理取陽(yáng)性對(duì)照100 μ L，置1. 5mL滅菌離心管中。2. 2. 3陰性對(duì)照處理取陰性對(duì)照100 μ L，置1. 5mL滅菌離心管中。3、病毒RNA的提取(按照試劑盒說明書進(jìn)行操作)4、RT-PCR 操作程序每份總體積20 μ L，含16. 8 μ L RT-PCR反應(yīng)液(用前混勻)，1. 2 μ L酶混合液， 2 μ L模板RNA0例如:η份樣品(η < 10)，配制η+1份，16. 8 X (n+1) RT-PCR反應(yīng)液，再加入 1. 2 X (η+1)酶混合液混勻，取18 μ L分裝成η份，分別加入2 μ L模板RNA (陽(yáng)性對(duì)照管加入 1 μ L陽(yáng)性對(duì)照RNA和1 μ L X液，陰性對(duì)照管加入1 μ L陰性對(duì)照RNA和1 μ LX液)，作好標(biāo)記。5、X液即為非靶病毒雞新城疫病毒Iasota株基因組中的引物序列的水溶液，濃度 IOpmoL/μ L0
權(quán)利要求
1.一種用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物的制備方法，其特征在于，選取一種非靶病毒作為陽(yáng)性對(duì)照模板。
2.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于選取的非靶病毒為RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于雞新城疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，并且選自安全、遺傳穩(wěn)定、容易培養(yǎng)的病毒株，優(yōu)選的所述病毒株包括雞新城疫病毒Iasota株和豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV株。
3.權(quán)利要求1或2的制備方法，其特征在于還包括使用滅活試劑處理所述非靶病毒的培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其中所述滅活試劑為高濃度強(qiáng)變性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其中所述高濃度強(qiáng)變性劑包括但不限于含有胍基的鹽，優(yōu)選地是異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍。
6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中所述非靶病毒的培養(yǎng)液根據(jù)病毒含量用所述滅活試劑進(jìn)行稀釋，稀釋不小于7倍，優(yōu)選地稀釋50-100倍，更優(yōu)選地稀釋50倍。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，設(shè)計(jì)一對(duì)非靶病毒引物，以對(duì)所述非靶病毒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒所針對(duì)的目的基因的長(zhǎng)度相同。
8.一種用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物，其特征在于包括一種非靶病毒作為陽(yáng)性對(duì)照模板。
9.權(quán)利要求8所述的陽(yáng)性對(duì)照組合物，其特征在于選取的非靶病毒為RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于雞新城疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，并且選自安全、遺傳穩(wěn)定、容易培養(yǎng)的病毒株，優(yōu)選的所述病毒株包括雞新城疫病毒 Iasota株和豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV株。
10.權(quán)利要求8或9所述的陽(yáng)性對(duì)照組合物，其特征在于還包括滅活試劑。
11.權(quán)利要求10所述的陽(yáng)性對(duì)照組合物，其中滅活試劑為高濃度強(qiáng)變性劑。
12.權(quán)利要求11所述的陽(yáng)性對(duì)照組合物，其中，高濃度強(qiáng)變性劑包括但不限于含有胍基的鹽，優(yōu)選的是異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍。
13.權(quán)利要求10-12所述的陽(yáng)性對(duì)照組合物，其中所述非靶病毒的培養(yǎng)液根據(jù)病毒含量用所述滅活試劑進(jìn)行稀釋，稀釋不小于7倍，優(yōu)選地稀釋50-100倍，更優(yōu)選地稀釋50倍。
14.權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)性對(duì)照組合物，其特征在于還包括一對(duì)非靶病毒引物，以對(duì)所述非靶病毒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒所針對(duì)的目的基因的長(zhǎng)度相同。
15.權(quán)利要求8-14任一項(xiàng)所述的陽(yáng)性對(duì)照組合物的用途，其用作反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的部分。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照組合物及其制備方法，其特征在于以一種非靶病毒作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的目的基因的長(zhǎng)度相同；非靶病毒用異硫氰酸胍滅活。本發(fā)明方法制備的陽(yáng)性對(duì)照安全，避免了現(xiàn)有技術(shù)中直接使用病毒感染材料造成病毒擴(kuò)散，且作為RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄陽(yáng)性對(duì)照，起到了RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄過程對(duì)照的作用，證明RNA提取試劑、反應(yīng)體系中所用物質(zhì)的活性正常，便于作為商品化試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102329789SQ20111027245
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者喬明明, 孫明, 田克恭, 趙鐵柱, 陳西釗 申請(qǐng)人:北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司