專利名稱：一種制備帕立骨化醇的方法
技術領域：
本發明涉及化學及生物制藥，尤其是治療骨質疏松癥的藥物l-α -羥基-19-去亞甲基維生素A技術領域。
背景技術：
帕立骨化醇(Paricalcitol)是Abbott公司于1998年開發的新型活性維生素藥物，商品名為kmplar已獲FDA批準上市，臨床上用于預防及治療繼發性甲狀旁腺功能亢進動物。實驗及臨床研究顯示paricalcitol具有相對選擇性的藥理作用能安全有效地抑制甲狀旁腺激素的分泌及甲狀旁腺的增生而很少引起高鈣血癥和高磷血癥，可替代骨化三醇(calcitriol)用于尿毒癥特別適用于長期血液透析病人繼發性甲狀旁腺功能亢進的治療。1- α -羥基-19-去亞甲基維生素D2 (1 α -19-nor_VD2)，即帕立骨化醇(paricalcitol)的已知合成大多采用全合成，主要有兩類合成路線，一是如專利US7645911所述方法采用維生素仏或25羥基維生素仏作為原料，經過保護、1位羥基化，10，19位雙鍵四氧化鋨/高碘酸鈉斷鍵，還原、磺酰化、LiAlH4還原等的步驟合成或保護、或10，19位雙鍵四氧化鋨/高碘酸鈉斷鍵、1，10雙鍵成烯，硼氫化引入1位羥基、保護、22，23臭氧斷鍵、引入25羥基側鏈等合成；如專利US5237110、US5M6925所述方法采用25羥基維生素A作為原料，經過保護、1位羥基化，10，19位雙鍵四氧化鋨/高碘酸鈉斷鍵，還原、磺酰化、LiAlH4 還原等的步驟合成。二是如專利 US5086191、US5^1731/5391755、US5486636、US5525745等專利所述采用維生素仏作為原料，采用臭氧斷6，7位雙鍵，分別得到A環和CD環，或者以手性合成子分別合成A環合CD環，再分別經過各種化學修飾，將去除了 10位亞甲基的A環經過wittig反應與CD環縮合，再經Wittig-Horner反應，Suzuki-Miyaura偶聯反應，Julia-type成烯反應等多步合成得到。第二種方法步驟繁多，多次進行手性拆分，收率極低，用于合成帕立骨化醇非常不經濟。第一種方法步驟相對要少些，但仍然要使用劇毒昂貴的四氧化鋨作為烯烴雙羥基化試劑，或使用難得的25羥基維生素&做原料，或者使用臭氧斷22，23雙鍵，再引入25羥基側鏈，在生產上依然工序太多，操作復雜，收率偏低，總收率僅0. 左右。

發明內容
鑒于現有技術的以上不足，本發明的目的是提供一種制備帕立骨化醇的新方法，使之具有生產工序簡化、收率高、且革除劇毒昂貴的四氧化鋨作為烯烴雙羥基化試劑應用的優點。本發明的目的是通過如下手段來實現的。一種制備帕立骨化醇的方法，以維生素D2為原料，采用如圖1所表達的化學反應和生物反應步驟獲得治療骨質疏松癥藥物帕立骨化醇1-α-羥基-19-去亞甲基維生素D2(ix)化學反應部分
高錳酸鉀水溶液在_20°C下，以醇類溶劑溶解環化物(iii)滴加濃度為5-20%的高錳酸鉀水溶液，攪拌反應1-10小時最好3小時，濃縮去除水，殘余物用同體積乙醇稀釋；0°C下，加入10-20%的高碘酸鈉水溶液，攪拌2-5小時，最好3小時，用等體積1-5個碳的氯代烷烴，1-5個碳的羧酸酯等萃取，濃縮至干，得到10羰基環化維生素D2 (iv)；在_78°C下，滴加非極性溶劑的強堿，加入三氟甲烷磺酸酐、N-苯基雙(三氟甲烷磺酰)亞胺，得到烯醇基三氟甲烷磺酸酯(V)；用甲酸及醋酸鈀還原得到1，10雙鍵的環己烯衍生物(vi)，使用硼氫化試劑經堿性過氧化氫氧化得到1-羥基-19-去甲維生素D2(Vii)，采用低分子有機酸開環，洗滌后再經4%的氫氧化鈉甲醇溶液水解得到1-羥基-10去甲維生素D2 (viii)；生物反應部分1-羥基-19-去甲維生素D2(Viii)作為底物用菌株CGMCC 5098在通氣攪拌的狀態下，在碳源、氮源、礦物鹽的培養基中進行生物轉化，發酵溫度22-30°C，最好是27°C，pH范圍6. 5-7. 5，最好是7. 0，通氣量在0. 5-1. Ov/v/min ；將1-羥基-19-去甲維生素D2 (viii)作為底物加入到培養液中，底物濃度最好是l_15g/升，底物加入培養基的時間通常是在碳源將近消耗完時加入底物最佳，碳源的消耗可以通過測定糖的濃度來控制，通常是降到0. 05-0. 002%后加入底物；在繼續上述的培養的過程中產生25位的羥基化生物轉化，轉化的時間取決于培養基的組成和菌株，通常繼續培養1-7天，最好是4天。最后經固液分離，分別對菌絲和濾液用有機溶劑抽提，經硅膠柱層析，丙酮/水重結晶得到純的目標產物1-羥基-25-羥基-19-去甲維生素D2 (ix)，即帕立骨化醇。本發明采用化學和生物轉化相結合的制備帕立骨化醇的方法，在10，19雙鍵斷鍵上采用低溫價廉易得的高錳酸鉀溶液雙羥基化反應代替劇毒昂貴的四氧化鋨，采用生物轉化法進行25位的直接羥基化，比化學法溫和，無須超低溫和臭氧斷鍵，而且具有區域選擇性，不需要進行基團保護，25羥基化生物轉化收率高，環境友好，對化學法25位羥基化的關鍵步驟進行替代，簡化工藝流程，通過化學合成和微生物轉化系那個結合的方法，大大縮短工藝路線，提高收率，降低制造成本，將已知的合成帕立骨化醇27步反應縮短為9步反應，總收率達到3%，比現有公開報道的0. 左右的收率提高了 10倍以上。


圖1為本發明方法的工藝路線圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的實施作進一步的描述。本發明的技術方案路線見圖1化學部分化學合成本發明的起始原料是維生素D2，采用DeLuca等(US4195027)的方法轉化成3，5-環化維生素D2 (iii)，接著對10，19位的雙鍵進行雙羥基化，本發明采用高錳酸鉀水溶液在-20°C下，以乙醇、丙醇、異丙醇等為溶劑溶解上述環化物(iii)，滴加濃度為5-20%的高錳酸鉀水溶液，攪拌反應1-10小時，最好3小時，濃縮去除水，殘余物用同體積乙醇稀釋，0°C下，加入10-20%的高碘酸鈉水溶液，攪拌2-5小時，最好3小時，用等體積1-5個碳的氯代烷烴，1-5個碳的羧酸酯等萃取，濃縮至干，得到10羰基環化維生素D2 (iv)。10羰基環化維生素D2,溶于非極性溶劑，如環己烷、四氫呋喃、乙醚、二氯甲烷等，在_78°C下，滴加如前所述的非極性溶劑的強堿，如六甲基二胺基鋰、正丁基鋰、叔丁基鋰、氨基鈉等，加入三氟甲烷磺酸酐、N-苯基雙(三氟甲烷磺酰)亞胺，得到烯醇基三氟甲烷磺酸酯。用甲酸及醋酸鈀還原得到1，10雙鍵的環己烯衍生物(vi)，使用通常的硼氫化試劑，比如9-硼二環[3. 3.1]壬烷(9-BBN)，硼烷、二異松菔基氯硼烷，二乙基甲氧基硼烷等等，經堿性過氧化氫氧化得到1-羥基-19-去甲維生素D2(Vii)，采用DeLuca等(US4195027, US4260549)的低分子有機酸如乙酸開環，洗滌后再經4%的氫氧化鈉甲醇溶液水解得到1-羥基-10去甲維生素 D2 (viii)。生物部分發明人從四川二峨山采取的土樣中分離得到一株菌QL-3721001，具有對1_羥基-19-去甲維生素D2(Viii)具有轉化能力，經自然選育和紫外誘變得到菌株QL-3721021具有更高更專一的25羥基化能力，命名為SWJTUQL-3721021。采用高氏合成1號瓊脂培養基進行形態特征觀察，采用國際鏈霉菌計劃(ISP)推薦的培養基進行培養特征觀察和系列生理生化試驗，培養特征見表1，該菌孢子絲直而略有柔曲，幾無分支，菌落致密，表面光滑。菌株不能液化明膠，淀粉略有水解，牛奶發生胨化。對葡萄糖，肌醇，D-甘露糖，甘露醇，L-阿拉伯糖，果糖，鼠李糖，棉子糖，D-木糖等糖醇均有不同程度的利用能力。硝酸鹽不還原。纖維素上不生長。不產生類黑色素和酪氨酸酶，不產生硫化氫。該菌能夠利用碳酸氫鈉為唯一碳源。也可異養生長。菌落為白色，形成的菌落質地緊密，背面產生的色素顏色為微黃褐色。菌株產生兩種菌絲，基內菌絲和氣生菌絲；同時還可以看到黑色的較粗的孢子絲，生長在長而直的枝上，分生孢子單生，壁厚，有橫隔膜，呈松環或鉤狀，并有散落的橢圓狀孢子。表1菌株SWJTUQL-3721021在各培養基上的形態特征
權利要求
1. 一種制備帕立骨化醇的方法，以維生素A為原料，采用如下的化學反應和生物反應步驟獲得治療骨質疏松癥藥物帕立骨化醇1-0-羥基-19-去亞甲基維生素1)2(^)化學反應部分高錳酸鉀水溶液在_20°C下，以醇類溶劑溶解環化物(iii)滴加濃度為5-20%的高錳酸鉀水溶液，攪拌反應1-10小時最好3小時，濃縮去除水，殘余物用同體積乙醇稀釋；0°C下，加入10-20%的高碘酸鈉水溶液，攪拌2-5小時，最好3小時，用等體積1-5個碳的氯代烷烴，1-5個碳的羧酸酯等萃取，濃縮至干，得到10羰基環化維生素D2 (iv)；在_78°C下，滴加非極性溶劑的強堿，加入三氟甲烷磺酸酐、N-苯基雙(三氟甲烷磺酰)亞胺，得到烯醇基三氟甲烷磺酸酯(V)；用甲酸及醋酸鈀還原得到1，10雙鍵的環己烯衍生物(vi)，使用硼氫化試劑經堿性過氧化氫氧化得到1-羥基-19-去甲維生素D2(Vii)，采用低分子有機酸開環，洗滌后再經4%的氫氧化鈉甲醇溶液水解得到1-羥基-10去甲維生素D2 (viii)；生物反應部分1-羥基-19-去甲維生素D2 (viii)作為底物用菌株CGMCC 5098在通氣攪拌的狀態下，在碳源、氮源、礦物鹽的培養基中進行生物轉化，發酵溫度22-30°C，最好是27°C，pH范圍6. 5-7. 5，最好是7. 0，通氣量在0. 5-1. Ov/v/min ；將1-羥基-19-去甲維生素D2 (viii)作為底物加入到培養液中，底物濃度最好是l_15g/升，底物加入培養基的時間通常是在碳源將近消耗完時加入底物最佳，通常是常是菌株培養2天后加入底物；在繼續上述的培養的過程中產生25位的羥基化生物轉化，轉化的時間取決于培養基的組成和菌株，通常繼續培養1-7天，最好是4天；最后經固液分離，分別對菌絲和濾液用有機溶劑抽提，經硅膠柱層析，丙酮/水重結晶得到純的得到目標產物1-羥基-25-羥基-19-去甲維生素込(ix)，即帕立骨化醇。
2.根據權利要求1所述的一種制備帕立骨化醇的方法，其特征在于，所述溶解環化物(iii)的醇類溶劑可為乙醇、丙醇、異丙醇。
3.根據權利要求1所述的一種制備帕立骨化醇的方法，其特征在于，所述由10羰基環化維生素1)2(^)得到烯醇基三氟甲烷磺酸酯(V)步驟中所滴加非極性溶劑的強堿可為六甲基二胺基鋰、正丁基鋰、叔丁基鋰、氨基鈉。
4.根據權利要求1所述的一種制備帕立骨化醇的方法，其特征在于，所述由1，10雙鍵的環己烯衍生物(vi)經堿性過氧化氫氧化得到1-羥基-19-去甲維生素D2 (vii)步驟中所用硼氫化試劑可為9-硼二環[3. 3. 1]壬烷(9-BBN)，硼烷、二異松菔基氯硼烷，二乙基甲氧基硼烷。
5.根據權利要求1所述的一種制備帕立骨化醇的方法，其特征在于，所述培養基采用種子培養基1. 5%葡萄糖，1. 5%黃豆餅粉，0. 5%玉米漿，0. 5% NaCl,0. 2% CaC03，pH自然；121°C滅菌20min ；發酵培養基1. 5%葡萄糖，2. 0%黃豆餅粉，1. 0%玉米漿，0. 5% NaCl, 0. 2% CaC03, pH自然；121°C滅菌20min ；一級種子以1-10 %的接種量接入發酵培養基，發酵溫度，通氣量0. 5v/v/min,培養48小時。
全文摘要
本發明公開了一種制備治療骨質疏松癥藥物帕立骨化醇的方法。以維生素D2為原料，經化學反應和生物反應步驟獲得目標物。革除了昂貴毒性雙羥基化試劑的使用，采用價廉有效氧化試劑高錳酸鉀溶液的雙羥基化斷鍵成酮。在堿性試劑下異構化成烯烴，運用硼氫化試劑9-BBN，硼烷等試劑進行硼氫化反應，引入1位羥基，開環得到19-去甲維生素D2，以Pseudonocardia autotrophica SWJTUQL-3721021(自養假諾卡氏菌CGMCC 5098)為羥基化菌，用生物轉化法進行25位的直接羥基化，經提取分離獲得帕立骨化醇。本發明通過化學-生物轉化結合的方法，將帕立骨化醇已知公開報道的27步反應縮短為9步反應，提高了總收率，縮短了工藝路線，為解決帕立骨化醇的工業制備提供一條新的工藝路線。
文檔編號C12P7/02GK102392053SQ20111027931
公開日2012年3月28日 申請日期2011年9月20日 優先權日2011年9月20日
發明者萬陽, 馮海婷, 周傲群, 孫博, 文鵬, 陸群 申請人:西南交通大學