專利名稱：白菜熱誘導miRNA及其鑒定的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業領域，具體涉及白菜保守和新miRNA家族中熱誘導miRNA及其鑒定。
背景技術：
白菜是一類品種繁多的蔬菜作物，比較基因組學的工作揭示白菜和擬南芥有著非常保守的線性排列和染色體片段的共線性關系，推測它們是在大約13到17百萬年前從一個共同的祖先那里進化而來(Mun et al.，2009)。因為白菜在進化中發生了相當于擬南芥全基因組范圍內三倍化的事件，所以白菜基因組含有三倍化的擬南芥基因組的相應片段的同源對應物。在許多區域白菜類的蔬菜作物經常受到高溫的脅迫。全球范圍內，相當一部分農作物的損失是由于高溫和其伴隨的其他逆境脅迫造成(Mittler，2006)。雖然抗熱分子育種已經成為可能，但作物的基因改良因為缺乏抗熱基因資源而受到限制。植物內源的小片段非編碼RNA參與到了植物對非生物脅迫的響應中。小RNA主要分為四大類微小RNA(microRNAs),反式作用干擾小RNA(ta_siRNAs),天然反義轉錄小RNA (nat-siRNAs)和重復序列相關小 RNA (ra-siRNAs) (Jamalkandi et al. ,2009)。植物典型的miRNA大約21nt,由DCL1/HYL1復合體從形成莖環結構的前體中加工而成(Kuriharaet al.，2006)，進入到RISC復合體中剪切靶基因，發揮植物發育和逆境響應方面的調控(Shukla et al.，2008 ；Chen X，2009)。最近幾年的工作揭示了植物和動物中miRNA更復雜的加工機制。大部分已知miRNA是從基因間區域轉錄而來的，但也有小部分來自基因內含子區域(Babiarz et al. , 2008 ；Zhu et al. , 2008)、或者外顯子區域(Li et al.,2010)、轉座子(Devor E et al. , 2009 ；Piriyapongsa et al, 2008)甚至 tRNA 區域(Keita. ,2010)。同時最近也報導了 miRNA加工途徑和其他小RNA加工途徑之間的交叉互作。例如，長度22nt的miRNA而非21nt的經典miRNA激活了次級干擾小RNA的產生(Axtell et al.，2006 ；Cuperus et al. ,2010 ；Chen et al.,2010) ;miRNA 的前體莖環結構也能進入 DCL3/RDR2 加工途徑產生 24nt 的小 RNA (Vazquez et al. ,2008 ；Chellappan et al. , 2010)。miRNA 通常被認為發揮的是剪切祀基因和翻譯抵制的作用(Brodersen et al. , 2008),但最近發現來自miRNA前體的24nt小RNA也參與到了在轉錄前水平對靶基因的甲基化作用(Wu et al.，2010, Chellappan et al.,2010)。另一方面,在擬南芥和水稻中通過高通量的降解組測序驗證了許多受 miRNA 剪切的祀基因(German et al. ,2008 ；Addo-Quaye et al. , 2008 ；Liet al. ,2010 ;)。miRNA 及其靶基因在時期轉換(Wang et al.，2009 ；ffu et al.，2009)、激素信號傳遞(Mallory et al. , 2005 ；Reyes et al. , 2007)和極性分化方面(Zhou et al.，2007 ；Sieber et al.，2007 ；Liu et al. ,2010 ；Liu et al. ,2011)扮演著重要角色，同時在抵御逆境比如干旱(Li et al. , 2008,Martin et al. , 2010)、過氧化(Sunkar et al. , 2006)和缺磷脅迫(Fujii et al.，2005)方面發揮作用。其中miR398在過氧化脅迫下顯著下調。擬南芥中miR398靶向兩個高度同源的銅鋅超氧化物歧化酶CSDl和CSD2，調控了植物對過氧化脅迫的耐受性(Sunkar et al. ,2006) 但是，在全基因組水平上哪些白菜miRNA響應熱脅迫還沒有被報導。總的來說，在白菜保守和特異miRNA家族中鑒定熱誘導miRNA可進一步提聞我們對植物抗熱機制的了解。熱激脅迫干擾細胞穩態，并使葉片黃化，延遲植物的生長和發育甚至致死。在熱激轉錄因子(HSFs)調控下熱激蛋白(HSPs)的積累被認為在對熱激響應(HSR)過程中扮演著中心角色(Kotak et al.，2007)。有些蛋白如 DREB2A (Sakuma et al.，2006)，MBFlC (Suzukiet al. ,2005), CTLl (Kwon et al. ,2007)的累積被認為可以提高對植物抗熱的能力，一些信號分子如乙烯、脫落酸(Larkindale et al. , 2005)、過氧化氫和IP3 (Liu et al. , 2006)等也與植物高溫耐受通路有交叉互作。但這些蛋白是否受小RNA的調控或者是否調控了相關的miRNA靶基因是未知的。隨著小RNA深度測序技術的進步，許多作物的miRNA被發現(Zhu et al. ,2008 ；Lelandais-Briere et al. ,2009 ；Pantaleo et al. , 2010)。白菜是與模式生物擬南芥最為同源的作物之一(Snowdon et al.，2007)。白菜類的作物對高溫非常敏感，產量和質量因此嚴重受損，尤其是在夏季和高溫地區。最近白菜全基因組的測序和注釋有了非常大的進展，使得在全基因組水平調查miRNA成為可能。鑒定熱誘導miRNA提供了揭示植物響應熱激脅迫機制的一種渠道。

發明內容
本發明提供分離的核酸分子，所述核酸分子含有(a) SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；(b)與(a)互補的核苷酸序列；(c)與( a)或(b)具有至少80%序列相同性的核苷酸序列；和/或(d)在嚴格條件下與(a)、(b)和/或(C)雜交的核苷酸序列。在一優選實施例中，前述(C)中所述序列的相同性為至少85%，優選至少90%，更優選至少95%。在一優選實施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO :1、2和22_40中任
一所示。本發明提供一種嵌合基因，其含有在植物細胞中有活性的操作性連接于本發明所述核酸分子的啟動子，所述啟動子任選地進一步操作性連接于3’非翻譯核酸分子。本發明提供一種載體，其含有本發明所述的核酸分子或嵌合基因。本發明提供一種宿主細胞，其含有本發明所述的嵌合基因或載體。在一具體實施例中，所述宿主細胞是植物細胞。本發明提供含有本發明所述的植物細胞的植物或其部分。本發明提供產生自本發明所述的植物的種子。本發明提供本發明所述的載體在轉化植物細胞以提供耐熱植物中的應用。本發明提供一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括降低所述植物中具有SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1和22-40任一所示的核苷酸序列具有至少80%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟。在一優選實施例中，所述降低所述植物中具有SEQ ID NO 1和22_40任一所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1和22-40任一所示的核苷酸序列具有至少80%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟包括選自下組的一個或多個步驟將一核苷酸序列導入所述植物，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO :1和22_40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的互補序列，或是與SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的互補序列具有至少80%相同性的核酸序列；下調編碼SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，或與SEQ ID NO :1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的基因的表達；使編碼SEQ ID NO 1和22-40任一所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，或與SEQ ID NO :1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的基因突變，以降低或消除SEQ ID NO :1和22-40中任一序列與其mRNA靶標的結合，和/或降低或消除SEQ ID NO :1和22-40中任一序列結合上后該mRNA靶標的切割；和使所述植物與能抑制SEQ ID NO :1和22-40中任一核苷酸序列、SEQ ID NO 2所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :1和22-40中任一核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80 %相同性的核苷酸序列的化合物接觸。本發明提 供一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括提高所述植物中具有SEQ ID NO 3或55所示核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或55的核苷酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO :5所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO :5所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟。在一具體實施例中，所述提高所述植物中具有SEQ ID NO :3或55所示核苷酸序列或與SEQ ID NO 3或55的核苷酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO 5或56所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO :5或56所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟包括選自下組的一個或多個步驟在所述植物中過表達一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO :3或55所示核苷酸序列，或與SEQ ID NO :3或55所示核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，或編碼具有SEQ ID NO :5或56所示氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列，或編碼具有與SEQ ID NO 5或56所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列；和使SEQ ID NO :3或55所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :3或55具有至少70%相同性的核苷酸序列突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO 3或55或所述與SEQID NO 3或55具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA的結合，和/或降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO :3或55或所述與SEQ ID NO :3或55具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA結合后該mRNA的切割。本發明提供一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法提高所述植物中具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO 4的核酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO 6所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟。在一具體實施例中,所述提高所述植物中具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4的核酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟包括選自下組的一個或多個步驟在所述植物中過表達一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQID NO 4所示核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，或編碼具有SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列，或編碼具有與SEQ ID NO :6所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列；和使SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4具有至少70%相同性的核苷酸序列突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO 4或所述與SEQ ID NO 4具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA的結合，和/或降低或消除SEQ ID NO 1與由SEQID NO 4或所述與SEQ ID NO 4具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA結合后該mRNA的切割。 本發明提供本發明所述的核酸分子在調節植物耐熱性中的應用。本發明還提供本發明所述的核酸分子在提供耐熱性植物的遺傳分析或標記物輔助的選擇方法中的應用。本發明還提供本發明所述的核酸分子在提供耐熱性植物的植物育種方法中的應用。


圖1顯示常溫或熱處理的白菜四個數據庫中小RNA的長度分布。NTl和HTl是實驗I中分別進行了 NT和HT處理后測序得到的小RNA數據庫；NT2和HT2是實驗2中分別進行了 NT和HT處理后測序得到的小RNA數據庫。㈧NT和HT小RNA數據庫小RNA總數的長度分布；(B)NT和HT小RNA數據庫小RNA各類的長度分布。圖2顯示熱激脅迫下bra_miR398a的累積和其靶基因BracCSDl的表達變化。(A)bra-miR398和BracCSDl靶位點的比對；(B) Northern雜交檢測白菜兩個NT和HT生物學重復中的bra-miR398a ； (C)實時PCR檢測BracCSDl的表達變化。圖3顯示來自miRNA前體中熱響應小RNA。成熟序列用帶有正向箭頭的下劃線標出，miRNA*用帶有反向箭頭的下劃線標出。阿拉伯數字依次代表均一化后小RNA在NT1，HTl，NT2, HT2數據庫中的讀數。(A)bra-miR156h_2前體上產生的小RNA的匹配位點和豐度；(B)bra-miR167a-2前體上產生的小RNA的匹配位點和豐度；(C)bra_miR400前體上產生的小RNA的匹配位點和豐度。圖4顯示熱處理條件下bra_miR9. 3b和其祀基因的表達變化。(A)從miR9b前體中產生的三對miRNA/miRNA* ； (B)從miR9b前體中產生的三對miRNA/miRNA在四個數據庫中的豐度；(C)bra-miR9. 3b和其潛在靶基因互補位點的比對；(D)Norhtern雜交檢測熱激條件下的bra_miR9. 3b ； (E) RT-PCR檢測熱激條件下bra_miR9. 3b潛在祀基因的表達情況。圖5顯示bra-miRlO和其靶基因的進化關系及熱響應情況。(A)braniRlO前體和BracPAPlO的序列比對。bra-miR10成熟序列的反義鏈及方法用帶有反向箭頭的下劃線標出，BracPAPlO互補位點用正向箭頭的下劃線標出；(B)從miRlO前體中產生的熱響應小RNA ;阿拉伯數字依次代表均一化后小RNA在NT1，HTl, NT2, HT2數據庫中的讀數；(C)RT-PCR檢測BracPAPlO在熱處理條件下的表達變化；(D) 5’ -RACE PCR顯示BracPAPlO斷點落在bra-miR10與BracPAPlO互補的位點。圖6顯示兩個新miRNA和實證靶基因的進化關系。(A)bra_miR4前體和BracDRLl的序列比對；bra-miR10成熟序列及方法用帶有正向箭頭的下劃線標出，BracPAPlO互補位點反義序列用反向箭頭的下劃線標出；(B)5’ -RACE PCR顯示BraVELl斷點落在bra-miR4-5p 和 BracVELl 的互補位點，BracDRLl 斷點落在 bra-miR4_3p 和 BracDRLl 的互補位點；(C)bra-miR9b前體和BracTAOl的序列比對，bra_miR9b成熟序列及方法用帶有正向箭頭的下劃線標出，BracTAOl互補位點反義序列用反向箭頭的下劃線標出；(D)5’ -RACEPCR顯示fcaTAOl斷點落在bra_miR9.1和fcacTAOl的互補位點。圖7顯示p35S:amiR1885b. 3載體的構建。圖8 顯示了另一種 p35S:amiR1885b. 3+p35S:BracQQTl 載體的構建。圖9顯示了 p35S:fcacQQTl載體的構建。圖10 顯示了 p35S:amiR1885b. 3 載體的構建。
具體實施例方式本文中，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”可包括任何嘧啶堿基和嘌呤堿基的聚合物或寡聚物，優選是胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鳥嘌呤(見AlbertL. Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub. 1982),本文將其全文以引用的方式納入本文)。本發明包括脫氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸組分，以及它們的任何化學變體，如這些堿基的甲基化、羥甲基化或糖基化形式等。所述聚合物或寡聚物在組成上可以是同源或 異源的，且可從天然來源分離得到，或可人工合成產生。此外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，可以單鏈或雙鏈形式(包括同源雙鏈、異源雙鏈或雜合狀態)永久或暫時存在。術語“基因”指含有一區域(轉錄區)的DNA序列，該區域操作性連接于適當的調節區域(如啟動子)，在細胞中被轉錄成RNA分子(如mRNA)。基因的轉錄區可以是編碼氨基酸序列或功能RNA如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA和反義RNA的核苷酸序列。因此，基因可含有幾個操作性連接的序列，如啟動子、含例如參與啟動翻譯的序列的5’前導序列、轉錄區、內含子、和含如轉錄終止位點的3’非翻譯序列。“嵌合基因”(或重組基因)指在物種中天然不存在的任何基因，尤其指其核酸序列的一個或多個部分在自然界中以互不相關的形式存在的基因。例如，啟動子在自然界中與部分或所有轉錄區域或其它調節區域不關聯。術語“嵌合基因”應理解為包括表達構建物，其中啟動子或轉錄調節序列操作性連接于一個或多個編碼序列或反義序列(有義鏈的反向互補鏈)或反向重復序列(有義和反義，從而轉錄后RNA轉錄物形成雙鏈RNA)。“3’ UTR”或“3’非翻譯序列”(也常稱為3’非翻譯區或3’端)指基因的編碼序列下游的核酸序列，其包含例如轉錄終止位點和(大多數情況下，但不是全部的真核mRNA)聚腺苷酸化信號(如AAUAAA或其變體)。轉錄終止后，mRNA轉錄物在聚腺苷酸化信號下游被切割，并加入poly (A)尾,該poly (A)尾參與該mRNA向胞質的轉運(在那發生翻譯)。
“基因表達”指操作性連接于適當的調節區域(尤其是啟動子)的DNA區域被轉錄成RNA的過程，該RNA是有生物學活性的，即該RNA能被翻譯成生物學活性蛋白或肽(或活性肽片段)，或該RNA自身具有活性(如在轉錄后基因沉默或RNAi中)。某些實施方式中的活性蛋白指組成型活性的蛋白。編碼序列優選是有義取向，并編碼所需的生物學活性蛋白或肽，或活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列優選以反義DNA或反向重復DNA的方式存在，含有反義取向或有義和反義取向的短序列的靶基因。“異位表達”指在通常不表達的組織中表達。“轉錄調節序列”在本文中定義為能調節操作性連接于轉錄調節序列的(編碼)序列的轉錄速率(rate of transcription)的核酸序列。本文所定義的轉錄調節序列包含啟動轉錄(啟動子元件)、維持和調節轉錄所需的所有序列元件，包括弱化子和增強子。雖然大多數情況下指編碼序列的上游(5，)轉錄調節序列，但此定義也包括編碼序列下游(3’ )所發現的調節序列。本文中，“啟動子”指起到控制一種或多種基因的轉錄的核酸片段，根據轉錄方向，啟動子位于所述基因轉錄起始位點的上游，結構上由DNA依賴性RNA聚合物的結合位點、轉錄起始位點和任何其它DNA序列(包括但不限于轉錄因子結合位點、阻遏子和激活子蛋白結合位點，以及本領域周知的直接或間接調節由該啟動子引起的轉錄量的核苷酸序列)所鑒定。“組成型”啟動子是在大多數組織中在生理學和發育條件下有活性的啟動子。組成型啟動子例如包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉錄起始區，衍生自根癌農桿菌的T-DNA的I'-或2'-啟 動子，遍在蛋白I啟動子，Smas啟動子，肉桂基醇脫氫酶啟動子(美國專利No. 5, 683, 439), Nos啟動子，pEmu啟動子，rubisco啟動子，GRP1-8啟動子及本領域技術人員已知的各種植物基因的其它轉錄起始區。如果希望低水平表達，則可以使用弱啟動子。弱組成型啟動子包括例如，Rsyn7啟動子的核心啟動子(W099/43838及美國專利No. 6，072，050)，核心 35S CaMV 啟動子等。“誘導型”啟動子是可從生理學(如通過外部施與某些化合物)或發育上進行調節的啟動子。誘導型啟動子的例子是Hsp70啟動子，其是可由熱刺激誘導的啟動子。也可以使用可由化學物質、雌激素或植物生長素誘導的啟動子等等。“組織特異性”啟動子是僅在特定類型的組織或細胞中有活性的啟動子。“啟動子在植物或植物細胞中有活性”是指啟動子在植物或植物細胞中驅動轉錄的一般能力，它并不暗含關于啟動子時空活性的內容。本文中，“操作性連接”指處于功能關系的多核苷酸連接。當核酸與其它序列以功能關系連接時，該核酸與其它核酸序列“操作性連接”。例如，如果啟動子，或甚至是轉錄調節序列能影響到編碼序列的轉錄，那么它們與該編碼序列操作性連接。操作性連接意味著被連接的DNA序列通常是連續的。本文中，“核酸構建物”或“載體”指采用重組DNA技術產生的人造的核酸分子，用于遞送外源DNA到宿主細胞中。載體骨架可以是,例如雙運載體或超雙運載體(superbinaryvector)(見 US5591616、US2002138879 和 W095/06722)、共整合載體或 T-DNA 載體，如本領域已知的且在本文其它部分也有描述，在該骨架中可整合入嵌合基因，或者，如果其已存在合適的轉錄調節序列，僅需在該轉錄調節序列下游整合入所需的核酸序列(如編碼序列、反義或反向重復序列)。載體通常還含有有利于他們在分子克隆中應用的遺傳元件，如可選擇標記物、多克隆位點等(見下文)。本文中，“宿主細胞”可指天然存在的細胞或含有載體并支持該載體復制的轉化細胞。宿主細胞可以是培養的細胞、外植體、體內細胞等。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，如植物細胞。“嚴格雜交條件”可用于鑒別與給定核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。嚴格條件是序列依賴性的，在不同環境中將不同。通常，嚴格條件選為在規定離子強度和pH下比特定序列的解鏈溫度(Tm)低約5°C。Tm是在規定離子強度和pH下50%的靶序列雜交到最佳匹配探針的溫度。通常，嚴格條件將選擇為，鹽濃度約O. 02摩爾，pH為7，和溫度至少為60°C。降低鹽濃度和/或升高溫度會增加嚴格性。RNA-DNA雜交(使用如IOOnt探針進行的Northern印跡)的嚴格條件是，例如包括至少一次在63°C、0. 2X SSC中進行20分鐘的洗漆的條件或其同等條件。DNA-DNA雜交(使用如IOOnt探針進行的Southern印跡)的嚴格條件是，例如包括至少一次(通常2次)在至少50°C (通常約55°C )、0· 2X SSC中進行20分鐘的洗漆的條件或其同等條件。可參見Sambrook等，(1989),和Sambrook和Russell (2001)。 “序列相同性”和“序列相似性”可通過使用全球或本地比對算法比對兩條肽或兩條核苷酸序列而確定。然后，當它們具有至少某個最低百分比的序列相同性(如下文所述)時(最佳采用例如GAP或BESTFIT程序進行比對，使用它們的默認參數)，可將序列稱為“基本上相同”或“基本上相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全球比對算法比對兩條序列的全長序列，使匹配的數量最大化，并將空隙數量最小化。通常使用GAP默認參數，空隙產生罰分(gap creation penalty) = 50 (核苷酸)/8 (蛋白)，空隙延伸罰分(gap extentionpenalty) = 3(核苷酸)/2(蛋白)。對于核苷酸,使用的默認的計分矩陣是nwsgapdna,對于蛋白，使用的默認的計分矩陣是 Blosum62 (Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。可使用計算機程序進行序列比對和序列相同性百分比計分，例如使用Accelrys Inc.(9685Scranton Road, San Diego, CA92121-3752USA)的 GCG Wisconsin Package，第 10.3版，或EmbossWin version 2· 10. O (使用“needle”程序)。或者，可使用算法如FASTA和BLAST等檢索數據庫，測定相似性百分比或相同性百分比。優選地，序列相同性指整條序列長度上的序列相同性。“宿主細胞”或“重組細胞”或“轉化的細胞”指至少一種核酸分子，尤其是含有編碼所需蛋白的嵌合基因或轉錄后產生反義RNA或反向重復RNA (或發夾RNA)以用于使靶基因/基因家族沉默的核酸序列的核酸分子，被導入細胞后所產生的新的獨立細胞(或有機體)。宿主細胞優選是植物細胞或細菌細胞。宿主細胞可含有作為染色體外(游離基因)復制分子的核酸構建物，或更佳地，含有整合到該宿主細胞的核內或質體基因組中的嵌合基因。本文中，術語“宿主”還指病原體能侵入或感染的宿主植物物種，但根據上下文，該定義是清楚的。植物物種依病原體而分為“宿主”或“非宿主”物種。“非宿主”物種是即使在最適疾病發生的條件下也對所有種類的病原體感染都完全免疫的物種。“宿主”物種也稱為病原體的“宿主范圍”，對優選種類(但不是全部)的病原體免疫。術語“可選擇標記物”與本領域常規的術語含義類似，在本文中指任意遺傳物質，當該物質表達時，可用于選擇含有該可選擇標記物的細胞。可選擇標記物基因產物賦予例如抗生素抗性，或更優選的，除草劑抗性或其它可選擇性狀，例如表型性狀(如著色上的變化)或營養需求。術語“報告子”主要指可視標記物，例如綠色熒光蛋白(GFP)、eGFP、熒光素酶、GUS等。術語“同源”或“異源”指核酸或氨基酸序列與它們的宿主細胞或有機體(尤其是在轉基因有機體中)之間的關系。同源序列指在宿主物種中天然存在的序列(如用番爺基因轉化番茄)，而異源序列指在宿主細胞中天然不存在的序列(如用來自馬鈴薯的序列轉化番茄)。根據上下文，術語“同源物”或“同源的”可互換使用，指都是來自共同祖先序列的后代的序列。本文中，術語“等位基因”指基因在特定位點上的一種或多種可替換形式。在生物體的二倍體細胞中，給定基因的等位基因位于染色體上特定的位置或位點上。一個等位基因存在于一對同源染色體的各個染色體上。術語“蛋白質”或“多肽”在本文中可互換使用，指由氨基酸鏈構成的分子，與特定的作用模式、大小、三維結構或來源無關。因此，蛋白質的“片段”或“部分”仍然可稱為“蛋白質”。“分離的蛋白質”指不再存在于其天然環境中的蛋白質，例如是體外的，或不在重組細菌或植物宿主細胞中。本文中，“植物(作物)”包括各種農作物、花卉植物、或林業植物等。所述的植物比如可以是(不限于)雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。作為一種優選方式，所述的“植物”包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜等，十字花科鼠耳芥屬的擬南芥等，禾本科的水稻，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科蕓薹屬或鼠耳芥屬的植物。“植物”包括植物細胞，植物組織或器官，植物原生質體，可再生植物的植物細胞組織培養物，植物愈傷組織，植物細胞塊，和植物中完整的植物細胞，或植物的部分，如胚芽、花粉、胚珠、果實(如收獲的番茄)、花、葉、種子、根、根尖等。術語“增加的水平”和“降低的水平”在本文中指明顯增加的水平或明顯降低的水平。通常，當測試樣品 中的水平是對照樣品或參比樣品中的相應水平的至少5%，例如10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%以上或更低，該水平增加或降低。本申請中，術語“含有”為開放式的限定方式，指包括其后所限定的內容，但并沒有排除沒有明確列出的內容。此外，“由……組成”與“基本上由……組成”是可互換的，指除具體指明的成分外，本發明的組合物可含有額外的成分，所述額外的成分不改變本發明的獨特特征。此外，“一種”、“一個”等不排除包括多于一個的可能性，除非文中以清楚表明僅有一個或一種。因此，“一種”、“一個”通常指“至少一種”、“至少一個”。如本文所用，“豐度”就是一種序列的小RNA存在的總數量(如序列的條數)，也即相同序列的小RNA的總數量。豐度的測定可通過小RNA高通量測序(Illumina GAII)的方法測定，或通過本領域已知的其它方法進行。小RNA的表達量可通過領域技術人員熟知的技術來獲得，常規的例如通過Northern印跡技術，例如可設計特異性針對該小RNA的探針(攜帶可檢測信號，如熒光)來測定。本發明已鑒定了新穎的白菜(Brassica rapa)熱響應miRNA,miR-9. 3 (如SEQ IDNO :1所示)，其響應熱應力而下調，而它的兩個靶標(QQT1和FRA-8)響應熱應力而上調。本發明進一步證實，擬南芥(Arabidopsis thaliana)中miR_9· 3的下調和祀標QQTl的過表達提聞的耐熱性。本發明的核酸分子本發明提供一種分離的、重組或合成核酸分子，含有(a)SEQ ID NO :1所示的核酸序列或SEQ ID NO 2所示的前體序列；(b)與(a)互補的核苷酸序列；(c)與(a)或(b)具有至少80%序列相同性的核苷酸序列；和/或(d)在嚴格條件下與(a)、(b)和/或(c)雜交的核苷酸序列。SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列是miR_9. 3 (本文中也用miR-1885. 3表示)的成熟序列，長20個核苷酸。已顯示在熱應力中miR-9. 3下調,而它的兩個祀標上調。miR_9. 3與目前已鑒別的miRNA家族都不同源。miR-9. 3可被它的互補核苷酸序列下調。本發明者已進一步證實，在擬南芥中miR-9. 3的下調和其靶標之一 QQTl的過表達增加了該植物的耐熱性。本發明還包括具有與SEQ ID NO :1的核苷酸序列互補的序列的核酸分子，如反義RNA或其它抑制性RNAjB RNA i中使用的核酸分子；或在嚴格條件下與SEQ ID NO 1的一部分雜交的核酸分子。這些互補的或雜交的序列可以是任意長度的序列，本領域技術人員將理解序列的適當長度應與其使用目的相符。優選地，這些互補的或雜交的序列長度至少為15、16、17、18或19個核苷酸。更優選地，這些互補細胞和雜交序列的長度為20個核苷酸。預期與SEQ ID NO 1的核苷酸序列具有80%相同性將能確保所設有互補的和/或雜交的序列與SEQ ID NO :1結合。優選地，所述互補序列和雜交序列與SEQ ID NO :1的核苷酸序列具有至少80%的相同性，例如至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，優選基于其全長序列。本發明還涉及與(a)或(b)的序列具有至少80% (例如至少85%、90%、95%、96^^97^^98%或99%)的相同性的核苷酸序列。可采用本文上述部分提及的方法測定兩條核苷酸序列的相同性。本發明還包括SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，其代表了 miR_9. 3的前體miRNA。本發明也包括具有與SEQ ID NO :2的核苷酸序列互補的序列的核酸分子，如反義RNA或其它抑制性RNA，如用于RNAi中的核酸分子；或在嚴格條件下與SEQ ID NO 2的一部分雜交的核酸分子。這些互補序列和雜交序列可以是任意長度，本領域技術人員將理解序列的適當長度應與其使用目的相符。優選地，這些互補的或雜交的序列長度至少為15、16、17、18或19個核苷酸。預期與SEQ ID NO :2的核苷酸序列具有80%相同性將能確保所設有互補的和/或雜交的序列與SEQ ID N0:2結合。優選地，所述互補序列和雜交序列與SEQ IDNO 2的核苷酸序列具有至少80%的相同性，例如至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99 %，優選基于所述互補或雜交序列的全長序列。應理解，本發明包括與本文所列所有序列(引物序列除外)，例如SEQ ID NO :1_6、22-40和53-56具有上文所述序列相同性(至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% )的序列，或嚴格條件下與所有這些序列(包括具有所述相同性的序列)雜交的序列。本發明的載體另一方面，本發明涉及含有本發明核酸分子的載體。所述載體可以是表達載體。表達載體通常還含有啟動子、復制起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建本發明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。可有利使用的載體包括已知的植物載體，例如pK7GWIG2 (I)和pGreen，以及本領域用于在微生物中轉化和表達蛋白質的載體。可參見Arabidopsis, A laboratory manualEds. Weigel&Glazebrook,冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Lab Press) (2002),和Maniatis等，Molecular Cloning,冷泉港實驗室出版社(1982)。本發明的宿主細胞又一方面，本發明涉及含有本發明核酸、嵌合基因或載體的宿主細胞。本發明的合適宿主細胞包括植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、人細胞和動物細胞。合適的植物細胞的例子包括但不限于Brassica和Arabidopsis的細胞。合適的酵母細胞包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。合適的真菌細胞包括曲霉(Aspergillus)。合適的動物細胞包括昆蟲細胞,如來自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的細胞；哺乳動物細胞,如中國倉鼠卵巢細胞或PERC6細胞。可使用本領域現有的各種細胞系，如Flp-1n細胞系(Invitrogen)。如上文所述,可使用用于將本發明核酸導入宿主細胞的各種載體。這些載體可以是克隆載體、表達載體、沉默載體，可選自例如質粒DNA載體、病毒DNA載體(如腺病毒或腺相關載體)、病毒RNA載體(如逆轉錄病毒)或病毒植物載體(如煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus)和馬鈴薯X病毒(potato virusX))。在另一實施方式中，所述宿主細胞是轉基因植物。本發明植物細胞的轉化

植物miRNA可從前體miRNA加工而來，所述的前體miRNA可折疊成一種穩定的莖環(發夾)結構，所述的莖環結構長度一般在60-330bp之間。通常，前體miRNA可在植物細胞內被剪切成成熟的miRNA分子。成熟的miRNA通常具有18-26個核苷酸(一般約22個核苷酸)，然而也不排除具有其它數目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印跡檢測到。植物來源的miRNA是在植物細胞中由前體miRNA加工獲得的miRNA。前體miRNA也可從植物中分離出來或由人工合成合成。如本文所用，“莖環”結構也被稱作“發夾”結構，是指一種核苷酸分子，其可形成一種包括雙鏈區域(莖部)的二級結構，所述的雙鏈區域由該核苷酸分子的兩個區域(位于同一分子上)形成，兩個區域分列雙鏈部分的兩側；其還包括至少一個“環”結構，包括非互補的核苷酸分子，即單鏈區域。即使該核苷酸分子的兩個區域不是完全互補的，核苷酸的雙鏈部分也可保持雙鏈狀態。例如，插入、缺失、取代等可導致一個小區域的不互補或該小區域自身形成莖環結構或其它形式的二級結構，然而，該兩個區域仍可基本上互補，并在可預見的方式中發生相互作用，形成莖環結構的雙鏈區域。莖環結構是本領域技術人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級結構的核苷酸序列的核酸后，本領域技術人員能夠確定該核酸是否能形成莖環結構。根據本發明所提供的miRNA序列，可設計出在被導入植物中后可被植物加工成可影響相應的mRNA表達的miRNA的核酸構建物。因此，本發明提供了一種分離的核酸構建物，所述的核酸構建物可被植物細胞轉錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可被植物細胞裂解且表達成所述的miRNA。在本發明中，將所述的核酸構建物導入到植物細胞中，該核酸構建物在體內被轉錄成前體miRNA,之后所述的前體miRNA被加工成miRNA,所述的miRNA可與相應的mRNA的部分序列相互補，從而抑制該mRNA相應的目的基因的表達。所述植物細胞再生成植物后，該轉基因植物中相應的目的基因的表達與野生型不同。在一些實施方案中，希望進行瞬時表達。在這些情況中，可以使用標準瞬時轉化技術。這種方法包括但不限于病毒轉化方法、DNA或RNA顯微注射以及本領域熟知的其它方法。序列說明本發明涉及以下序列SEQ ID NO 1-成熟的 miR_9. 3 序列SEQ ID NO 2-miR-9. 3 前體序列SEQ ID NO 3——擬南芥 QQTl 的編碼序列(AT5G22370. 2)SEQ ID NO 4——擬南芥 FRA-8 的編碼序列(At2g28110.1)SEQ ID NO 5——擬南芥QQTl的蛋白序列SEQ ID NO 6——擬南芥FRA-8的蛋白序列SEQ ID NO :7_21表示5’ -RACE-PCR和實時PCR中使用到的引物SEQ ID NO :22-40分別表示本發明發現的新miRNASEQ ID NO :41_52顯示實施例2構建質粒所用引物SEQ ID NO : 53顯示IPS I的序列，該序列中的第236-259位堿基在構建p35S:MIMbra-398a 質粒時被 ACTTCCTTCTTCTATGTCCACAAT (MIM1885b. 3)替換SEQ ID NO : 54顯示pRS300的序列，該序列中的第803-822位堿基構建p35S:amiR398a 質粒時，被 ATTGTGGACAAAGAAGGAAG (對應于 miR1885*)替換，而第 953-972位被 CTCCCTTCTTTGTGCACAAT (對應于 miR1885)替換SEQ ID NO 55 顯不非結球白菜(B. rapa. ssp. chinensis)QQTl 的 CDS 序列SEQ ID NO 56 顯不非結球白菜(B. rapa. ssp. chinensis)QQTl 的氛基酸序列下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1 :白菜中響應熱應力的miRNA的鑒別一.材料與方法小RNA深度測序構建小RNA文庫的材料是一種非結球白菜(B. rapa. ssp. chinensis)的品種Wu-11。所有材料都種植在22°C 16小時光照8小時黑暗的長日照條件下；三周后部分材料進行46°C I個小時的熱激處理。收集地上部分的植物材料后用Alternativevl. 5Protocol (Illumina, 2009)提取 RNA 樣品，使用 mirVana miRNA 分離試劑盒(Ambion,Inc)進行小RNA分離，Illumina GAII測序儀進行深度測序。保守miRNA的分析我們將測序得到的小RNA序列與miRbase中擬南芥miRNA家族的成熟序列進行比對，然后將所有不超過四個堿基錯配的miRNA序列匹配到白菜全基因組的scaffold序列數據庫(http://brassicadb.org)或者表達序列標簽數據庫(EST) (http://brassica.bbsrc. ac.uk/),提取出miRNA成熟序列存基因組或者EST上的600bp旁鄰序列。進一步用下載到本地的RNAfold軟件對旁鄰序列進行批量折疊；最后我們用peri腳本語言檢查這些前體是否符合miRNA莖環結構的標準(Meyers et al. ,2008)。白菜新miRNA的預測我們將所有小RNA序列匹配到白菜全基因組的scaffold序列數據庫或者表達序列標簽數據庫(EST)。小RNA匹配到的基因組位點不超過10個的被保留下來，600bp的旁鄰序列被提取出來用RNAfold進行二級結構的預測。進一步我們根據miRNA莖環結構的特點判定該小RNA是否落在預測二級結構的莖上，且不超過4個不匹配的位點(連續3個不匹配的位點也是不允許的)(Meyers et al.，2008)。為了調查這些符合標準的莖環結構前體來自基因組的哪個區域，我們使用BLASTN將這些前體序列比對TAIR9的擬南芥cDNA數據庫。最后我們將小RNA測序數據庫中的小RNA匹配到這些前體上顯示出siRNA在前體的分布圖。與核糖體RNA或轉座子高度同源的前體序列大部分被排除。根據是否同時實測到預測的miRNA*這一個核心標準最終判定出新miRNA。新miRNA靶基因預測將miRNA序列與 白菜EST數據庫中的EST互補序列做比對，保留堿基不匹配低于四個以下的EST序列；匹配結果用打分矩陣的形式給出，完全匹配給I分，G-U配對O. 5分，不匹配的給-1分，在第10或第11位不匹配給-2分。如果有連續兩個的不匹配、在前十個堿基有2個以上不匹配、在后面的堿基中有3個以上的不匹配，這三種情況均不保留。最后我們把潛在靶基因的EST序列與擬南芥TAIR9的cDNA數據庫比對，確認它在擬南芥的同源基因。Northern 雜交30-50 μ g RNA樣品在19%的聚丙烯酰胺上以IOOV穩壓電泳3_4小時分離，然后以200mA穩流2小時轉至雜交膜上(Amersham biosciences-GE healthcare) ;3分鐘的紫外交聯后，將膜與miRNA互補的生物素標記DNA探針雜交過夜；雜交膜用2XSSC、0. 1% SDS在42度洗兩次(每次五分鐘)，再用0.1 X SSC、+0.1 % SDS在42度洗兩次(每次十分鐘)。接著在核酸檢測封閉緩沖液中加入穩定的親和素偶聯物(Thermo)，然后用IX洗滌緩沖液洗五次(每次五分鐘)；最后，在底物平衡緩沖液洗脫后的雜交膜中加入穩定的過氧化物溶液和增強液，將膜壓片后，用顯影液對底片進行顯影。另外用U6探針作為上樣量的內參。DNA探針序列由Invitrogen公司合成并進行3’末端的生物素修飾。5’ -RACE PCR使用5’全長RACE PCR試劑盒，省略去堿性磷酸酶(CAIP)和TAP (Tobacco AcidPyrophosphatase)處理,將RNA直接連接5’末端接頭,使用oligo_dT進行反轉錄。每個基因使用兩條基因特異嵌套引物(表I)，擴增產物連接到PMD18T載體(Takara)上進行測序。實時PCR 和 RT-PCRRNA 用 TRIzol(Invitrogen)提取后,進行 DNase I (Takara)處理,用 4 μ g 進行反轉錄。實時PCR和RT-PCR使用基因特異引物進行擴增(表I)。實時PCR用相對Ct值方法來衡量轉錄水平表達量，RT-PCR通過電泳方法判斷。白菜中與擬南芥ACT4的同源基因BrcACT4用來做內參。每個實驗采用三次生物學重復,三次技術重復。表1: 5 ’ -RACE-PCR和實時PCR中使用到的引物

引物序列(序列編號依次為SEQ ID NO:7-21) 實驗
FJ842796-744A (BraTAOl) CCCAACTAACCCGTCAAAATCA5'RACE PCR
FJ842796-595A (BraTAOl) TCCATCTCTCAATGTTTTCCTTCG5'RACE PCR
BracDRLl-1085ACAATTTGTCCACAACTTTTCACTG5'RACE PCR
BracDRLl-107IACTTTTCACTGAAGAGCACAAAGTGT5'RACE PCR
EE521879-613A (BracVELl) CCAGGTTCTTGCAGTAGGTAGTCTT5'RACE PCR
EE521879-560A (BracVELl) GTTGGAGCCACGTAGCGAGTAG5'RACE PCR
5'RACE PCR
bra-PAP 10 -42 SCGTCTGGAAGGACC A AATCTAT
和 RT-PCR
bra-PAP 10-5IOAGCACATCAGGACCGACTTCA5'RACE PCR
和 RT-PCR
bra-PAP 10-174ATATCGAGTGGCATATCAACCG5'RACE PCR
Brac-CSD1-54SCCCTGAGATCACAAAGGATATACAA 實時 PCR
Brac-CSD1-143ATGAAGAAGATAGTCCCCTTAACACC 實時 PCR
DY029374-41SAACTTCTCCACCTTTCACCATTCRT-PCR
DY029374-561AGTTGCTGCATCTCTCGTTGGRT-PCR
EE423375-157STTACCGTATGAGTGTGCTGTGART-PCR
EE423375-633AGTAGTTCTGCAAGTATGACAAGTCRT-PCR

二.結果與分析 全基因組水平分析熱響應小RNA高溫抑制植物的生長，引起葉片黃化甚至死亡。葉片黃化的嚴重程度與處理的溫度梯度及時間梯度有關。為了找出在苗期生長過程中基礎耐熱溫度和受熱時間的臨界點，我們將白菜用44、45、46、47和48°C五個溫度梯度處理O. 5，I和2小時三個時間梯度(Wanget al. ,2011)。我們發現白菜基因型為Wu-1l的溫度臨界點為46°C I小時，在這個條件處理后移至常溫(22°C)的苗停止生長，12天后表現出黃化現象。我們預期該條件影響了早期響應小RNA的生成，但不會帶來過多因形態和生理的改變而引起的次級效應。為檢測熱響應的小RNA，我們對苗齡三周的非結球型白菜Wu-11進行了兩次獨立的熱處理實驗。第一次實驗中，兩組白菜分別進行了 46°C I小時的熱處理(HTl)和22°C I小時的常溫處理(NTl)。處理過后，我們對植株的整個地上部分進行取樣。片段大小從9nt到36nt的小RNA被分離出來構建小RNA文庫，分別命名為HTl和NTl文庫。為確認HTl和NTl文庫的質量，我們采用了同樣的方法進行了第二次重復實驗，將得到的文庫分別命名為HT2和NT2文庫。NTl和HTl文庫中分別包含了 14. 67百萬和12. 77百萬條的小RNA讀數，NT2和HT2文庫中分別包含了 11. 25百萬和14. 61百萬條的小RNA讀數(表2)。表I顯示了白菜各小RNA數據庫的總讀數，其中，特異的小RNA指代只在一種處理類型的數據庫中存在的小RNA，共有的小RNA指代在兩種處理類型的數據庫中都存在的小RNA。因為在每個實驗中NT和HT的小RNA總數豐度不一樣，我們將每個數據庫中小RNA的讀數均一化為總數一千萬時的讀數[每千萬總數包含的轉錄量(TPlOM)]。表2 白菜各小RNA數據庫的總讀數
權利要求
1.分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有 (a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列； (b)與(a)互補的核苷酸序列； (c)與(a)或(b)具有至少80%序列相同性的核苷酸序列；和/或 (d)在嚴格條件下與(a)、(b)和/或(C)雜交的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，(c)中所述序列的相同性為至少85 %，優選至少90 %，更優選至少95 %。
3.一種嵌合基因，其含有在植物細胞中有活性的操作性連接于權利要求1或2所述核酸分子的啟動子，所述啟動子任選地進一步操作性連接于3’非翻譯核酸分子。
4.一種載體，其含有權利要求1或2所述的核酸分子或權利要求3所述的嵌合基因。
5.一種宿主細胞，其含有權利要求3所述的嵌合基因或權利要求4所述的載體。
6.如權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是植物細胞。
7.含有權利要求6所述的植物細胞的植物或其部分。
8.產生自權利要求7所述的植物的種子。
9.權利要求4所述的載體在轉化植物細胞以提供耐熱植物中的應用。
10.一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括降低所述植物中具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1具有至少80%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述降低所述植物中具有SEQID ΝΟ:1所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1具有至少80%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟包括選自下組的一個或多個步驟 將一核苷酸序列導入所述植物，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO :1所不的核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的互補序列，或是與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的互補序列具有至少80%相同性的核酸序列； 下調編碼SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，或與SEQ IDNO:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的基因的表達； 使編碼SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，或與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的基因突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與其mRNA靶標的結合，和/或降低或消除SEQ ID NO I結合上后該mRNA靶標的切割；和 使所述植物與能抑制SEQ ID NO :1所示核苷酸序列、SEQ ID NO 2所示核苷酸序列或與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列的化合物接觸。
12.—種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括提高所述植物中具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :3的核苷酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO :5所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO 5所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述提高所述植物中具有SEQID NO :3所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :3的核苷酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO :5所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO 5所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟包括選自下組的一個或多個步驟 在所述植物中過表達一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列或具有與SEQID NO 3所示核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，或編碼具有SEQ ID NO 5所不氣基酸序列的蛋白序列，或編碼具有與SEQ ID NO :5所不氣基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的蛋白序列；和 使SEQ ID NO :3所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :3具有至少70%相同性的核苷酸序列突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO :3或所述與SEQ ID NO :3具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA的結合，和/或降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO:3或所述與SEQ ID NO 3具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA結合后該mRNA的切割。
14.一種制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法提高所述植物中具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4的核酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的蛋白序列或與SEQ ID NO :6所示氨基酸序列具有至少70%相同性的蛋白序列的水平的步驟。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述提高所述植物中具有SEQID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4的核酸序列具有至少70%序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步驟包括選自下組的一個或多個步驟 在所述植物中過表達一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ IDNO :4所示核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，或編碼具有SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列，或編碼具有與SEQ ID NO :6所示氨基酸序列具有至少70 %相同性的氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列；和 使SEQ ID NO :4所示核苷酸序列或與SEQ ID NO :4具有至少70%相同性的核苷酸序列突變，以降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO :4或所述與SEQ ID NO :4具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA的結合，和/或降低或消除SEQ ID NO :1與由SEQ ID NO:4或所述與SEQ ID NO 4具有至少70%相同性的核苷酸序列形成的mRNA結合后該mRNA的切割。
16.權利要求1或2所述的核酸分子在調節植物耐熱性中的應用。
17.權利要求1或2所述的核酸分子在提供耐熱性植物的遺傳分析或標記物輔助的選擇方法中的應用。
18.權利要求1或2所述的核酸分子在提供耐熱性植物的植物育種方法中的應用。
全文摘要
本發明涉及白菜熱誘導miRNA及其鑒定。本發明鑒定了新穎的白菜熱響應miRNA，miR-9.3(miR-1885.3)(如SEQ ID NO1所示)，其響應熱應力而下調，而它的兩個靶標(QQT1和FRA-8)響應熱應力而上調。本發明進一步證實，擬南芥中miR-9.3的下調和靶標QQT1的過表達提高的耐熱性。因而本發明包括這類新的核酸分子、含有這些分子的載體、宿主細胞，以及這些分子、載體在轉化植物細胞以提供耐熱植物中的應用。本發明也涉及利用上述序列制備耐熱性提高的植物和/或其部分的方法。
文檔編號C12Q1/68GK103031301SQ201110298399
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者何玉科, 馬賽爾·普瑞斯, 余祥 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 荷蘭科因公司