專利名稱：焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，尤其涉及一種使用焦磷酸測序方法從痰標本中直接檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥突變的引物和檢測方法。
背景技術：
異煙肼(NH)作為一種高效特異的抗結核藥物，它主要通過結核桿菌內過氧化氫-過氧化物酶(由KatG基因編碼)的作用下才能轉化為活性形式作用于enoyl-ACP還原酶，抑制桿菌酸和細胞壁合成。由于KatG蛋白是唯一可以激活異煙肼的酶，所以其功能的下降或缺失必然會造成結核菌異煙肼耐藥性，進一步的研究發(fā)現造成臨床異煙肼耐藥性的主要原因不僅是KatG基因的完全缺失、點位突變、堿基的插入和缺失同樣重要。目前，前期建立的焦磷酸測序結核桿菌異煙肼耐藥性檢測方法是從結核分枝桿菌痰標本培養(yǎng)物中進行檢測，但結核桿菌分離培養(yǎng)的過程至少需時I月，嚴重制約了分子生物學檢測手段快速的優(yōu)越性，如果能從痰標本中直接進行耐藥性檢測，則可以大大縮短藥敏結果的時間，對臨床指導價值更大。但由于痰標本中所含菌量遠遠低于痰標本純培養(yǎng)物，用以前的方法僅進行一輪PCR擴增，所得PCR產物濃度過低，遠遠達不到焦磷酸測序檢測的要求，無法實現在痰標本中的檢測。中國專利CN1311435披露了一種結核分支桿菌耐藥性檢測芯片，其中在一經修飾的載玻片上，固定有一系列寡核苷酸點陣探針。在檢測芯片中所說的探針是針對rpoB基因、katG基因、inhA基因、kasA基因，每個探針長度至少為10個堿基，并且各個探針長度相同；突變點盡可能位于探針中間。在《中華檢驗醫(yī)學雜志》2011年第2期中刊登了“焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌四種藥物耐藥 性”一文，其中利用焦磷酸測序技術以10株已知藥敏結果和經直接測序已知耐藥基因突變情況的MTB為試驗菌株，摸索焦磷酸測序檢測MTB rpoB、katG、gyrA、rrs耐藥基因的最佳模式，并用該條件檢測89株MTB臨床分離株，并將檢測結果與BACTEC960藥敏法進行比較，以便得到最佳的檢測方法。在現有常規(guī)檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法中，都不可以避免需要事先對患者痰標本進行分離培養(yǎng)結核分枝桿菌菌株，這就使得檢測時間增長，檢測中需要進行反應的次數也比較多，使得不能快速得出耐藥性的結果。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種利用焦磷酸測序方法從痰標本中直接檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥突變的引物和檢測條件。為了實現上述本發(fā)明提供一種焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，包括以下順序步驟
步驟I，對KatG基因進行PCR擴增；
步驟2，對PCR擴增產物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。在上述提供的焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中針對KatG基因315位點進行焦磷酸測序并設計引物。在上述提供的焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，所述對KatG基因進行PCR擴增進行兩次PCR擴增，其中第一次擴增以痰標本結核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴增以第一次擴增PCR產物為模板。在上述提供的焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中第一次擴增使用的第一 PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示序列，所述第二次擴增使用的第二 PCR引物具有SEQ ID NO. 3所示序列或帶有生物素標記的具有SEQ ID NO. 2所示序列。在上述提供的焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中所述第一 PCR引物和第二 PCR引物的濃度為O. 4 μ ml/L。在上述提供的焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中在焦磷酸測序中用的測序引物具有SEQ ID NO. 4所示序列。在上述提供的焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中所述擴增反應過程包括下列順序步驟
步驟1:在94°C下進行預熱5分鐘；
步驟2 :在95°C下保持30秒進行變性、61°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，循環(huán)退火過程40次；
步驟3 :在72°C下保持10分鐘。`本發(fā)明提供的檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的方法可以從患者痰標本直接進行耐藥性檢測，無需再做分離培養(yǎng)結核分歧桿菌菌株，相比現在常用檢測方法可以縮短檢測時間，減少焦磷酸序列測定所需要的反應次數和檢測試劑用量。


圖1是本發(fā)明中用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點痰標本焦磷酸測序結果。圖2是本發(fā)明中用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點痰標本焦磷酸測序另一結果。圖3是本發(fā)明中用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點標準株焦磷酸測序結果。
具體實施例方式由于KatG基因的突變主要集中于315位點，在本發(fā)明主要針對異煙肼KatG耐藥基因315位點進行焦磷酸測序檢測方法。本發(fā)明提供的一種檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的方法，先對KatG基因進行PCR擴增，再對PCR擴增產物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。焦磷酸測序技術
焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術是全新的一種DNA序列分析技術,可以快速、準確地測定一段較短的目標片段。該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。
焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發(fā)光反應，基本原理如下將I個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase 和 Apyrase)和底物混合物(包括 APS 和Luciferin)。向反應體系中加入I種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對,貝U會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出摩爾數的焦磷酸基團。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP ;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。通過CCD光學系統即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數成正比。反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。加入另一種dNTP,使第2 4步反應重復進行，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。焦磷酸測序操作系統中共有2個模式能進行堿基突變的檢測，即序列分析模式(Sequence Analysis, SQA)和單核苷酸多態(tài)性模式(Single Nucleotide polymorphism,SNP)ο其中SQA模式的核苷酸加樣順序為循環(huán)順序加樣法，即通過循環(huán)反復的加入A、G、C、T四種核苷酸以檢測出·待檢樣品的序列，該法一次能準確判讀40bp左右的堿基，將所測定序列與已知序列比對后自行判讀突變情況。SNP模式的核苷酸加樣順序為特定順序加樣法，即系統根據設定的待檢位點及·位點周圍的序列自動生成核苷酸的加樣順序，僅對單個位點的堿基變化進行檢測，不對整個序列進行測定。針對不同的檢測對象，需要摸索不同的焦磷酸測序檢測方法。由于焦磷酸測序技術操作簡單，且結果準確可靠，可應用于SNP位點檢測、等位基因頻率測定、細菌和病毒分型等領域。以下通過實施例對本發(fā)明內容作進一步的詳細說明，以便更好理解本發(fā)明創(chuàng)造的內容，但是下述實施例并不限制本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍。采集檢測物
收集病人晨痰并存放在無菌樣本保存管內，痰量以3 5mL為宜，密封后送檢。檢測物預處理和DNA提取
取適量被檢標本，加等量N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化液，震蕩30秒，置于室溫放置15分鐘，如果標本粘稠可適當延長消化時間。檢測物中加入PBS緩沖液20mL，混勻并離心，離心條件為20分鐘3000g。去除上層清液，加入PBS緩沖液20mL用于洗滌沉淀。洗滌2次后，將沉淀重懸于50 μ I TB裂解液中(TB裂解液為含有O. 04%Na0H, O. 1% SDS和15%ChelexlOO的溶液)，在50°C下水浴I小時，后沸水浴10分鐘。再次離心分離，取上層清液并在_20°C環(huán)境下保存?zhèn)溆?，即得到到結核桿菌DNA提取物。異煙肼KatG耐藥基因的PCR擴增
用具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR第一引物和具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第一引物進行第一輪擴增，模板為病人痰檢測物的結核桿菌DNA提取物。在50 μ L反應體系中，第一引物最佳的濃度為O. 4μ mol/L。PCR反應過程如下先在94°C下進行預熱5分鐘；在95°C下保持30秒進行變性、61°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，并循環(huán)該過程40次；最后在72°C下保持10分鐘。用具有SEQ ID NO. 3所示序列的PCR第二引物和帶有生物素標記的具有SEQ IDNO. 2所示序列的PCR第二引物進行第二輪擴增，模板為第一輪擴增的PCR產物。在50 μ L反應體系中，第二引物最佳的濃度為0.4 μ mol/L。PCR反應過程如下先在94°C下進行預熱5分鐘；在95°C下保持30秒進行變性、61°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，并循環(huán)該過程40次；最后在72°C下保持10分鐘。取2 μ L的PCR產物進行1. 5 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，在12V/cm電位梯度下電泳20分鐘，后在紫外燈下檢查擴增效果。具有SEQ ID NO.1所示序列擴增引物、具有SEQ ID NO. 2所示序列擴增引物和具有SEQ ID NO. 3所示序列擴增引物的序列如下所示。SEQ ID NO.1 ATGAGGTCTATTGGGGCAAGGAAGCSEQ ID NO. 2 CCCGCAGCGAGAGGTCAGTGG
SEQ ID NO. 3 AGATGGGCTTGGGCTGGA
具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR第一引物和具有SEQ ID NO. 3所示序列的PCR第二引物為兩條正向引物，具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第一引物和帶有生物素標記的具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第二引物為共同的反向引物。由此具有相同的退火溫度，因此可以共用同樣的PCR擴增條件。帶有生物素標記的引物在檢測中起到標記作用。焦磷酸測序1.檢測試劑配制
結合緩沖液將 IOmmoI/L Tris_HCl、2mol/L NaClUmmol/L EDTA 和 O. 1% Tween20 去離子水溶解，用I mol/L HCl調pH至7. 6。變性緩沖液(denatureationbuffer) :O. 5 mol/L NaOH。退火緩沖液將 20 mmol /T, Tris_Acetate、2mmol/L MgAc2 溶液混合,用 4mol/L 乙酸調pH至7. 6。洗漆緩沖液(washingbuffer):用 4mol/L 乙酸將 10 mmol/L Tris-Acetate 溶液調pH至7. 6。70%乙醇在70mL無水乙醇中加入高純水20mL,充分混勻后定容至100mL。2.檢測儀器及配套試劑
(I) PSQ 96全自動焦磷酸測序儀、PSQ96單鏈制備工具臺(Vacuum prepworkstation)、真空樣品轉移器(Vacuum prep tool)、真空泵、潤旋振蕩器、PCR儀。(2)瑞典PYROSEQUENCING AB公司生產的焦磷酸微測序試劑盒(PSQ 96MA SQAUpgrade Kit)和鏈親和素包被的磁珠(Sepharose beads)。3.焦磷酸測序檢測步驟
(I)PCR產物固定在PCR板中放入40 μ L的具有PCR擴增產物，再分別加入36 μ L的結合緩沖液和4 μ L鏈親和素包被的磁珠。將PCR板放在渦旋振蕩器上常溫振蕩20分鐘，使PCR產物固定在磁珠上。(2)單鏈模板的純化打開真空泵，將真空樣品轉移器移到PCR板中，抓取結合PCR產物的磁珠，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空樣品轉移器上。再將真空樣品轉移器放入70%乙醇中輕微振蕩5秒，然后移到變性緩沖液中抽吸5秒，使DNA變性以得到純化的單鏈DNA模板，最后移到洗滌緩沖液中清洗5 10秒，洗滌未固定的單鏈DNA，從而得到作為測序模板的單鏈DNA。
(3)引物雜交先在焦磷酸測序微孔板各孔中加入退火緩沖液50 μ L，再加入具有SEQ ID NO. 4所示序列測序引物。測序引物的最低要求濃度為I μ mol/L，最高濃度為
O.2mmol/L。再將真空樣品轉移器從PCR板移入焦磷酸測序微孔板，關閉真空泵，將已純化好的單鏈DNA模板與具有SEQ ID NO. 4所示序列測序引物混和，在80°C下變性2分鐘，然后冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交。具有SEQ ID NO. 4所示序列測序引物的序列如下所示。SEQ ID NO. 4 CCGGTAAGGACGCGA
(4)焦磷酸測序利用由瑞典Pyrosequencing AB公司生產的PSQ96MA測序儀和試劑盒，依次在試劑倉中加入酶、底物和4種dNTPs，選用SNP檢測模式、以GTCACAGTCTG的核苷酸加樣順序加入順序進行測序反應。通過CCD光學系統對每次加樣后產物進行檢測，以獲得特異的檢測峰，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。圖1是用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點痰標本焦磷酸測序的結果，檢測得出的序列為TCACG^aiG。圖2是另外一個用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點痰標本焦磷酸測序的結果，檢測得出的序列為TCACCA^GG。將其與圖3的用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點標準株焦磷酸測序結果得到序列為TCACG^CGG的結果相比，可得出圖中方框內為突變的基因序列。根據多次檢驗結果與異煙肼KatG基因315位點標準株焦磷酸測序結果相比較，具有SEQ ID NO. 4所示序列的測試引物能準確的檢測出異煙肼耐藥突變位點，由此在臨床研究中可以方便將其應用在檢測之中。由于通常痰標本中所含菌量遠遠低于痰標本純培養(yǎng)物，得到的PCR產物濃度過低，遠遠達不到焦磷酸測序檢測的要求，無法實現在痰標本中的檢測。在本發(fā)明中利用三條引物進行兩次PCR擴增，使 得約95%的痰標本均能獲得高質量的耐藥基因目的片段，滿足焦磷酸測序檢測的需求，實現從痰標本直接進行結核桿菌耐藥性測定，滿足臨床快速診斷耐藥結核病的需求，為臨床合理用藥提供實驗室依據。本發(fā)明提出的焦磷酸測序技術檢測耐藥性的方法，同樣也可以應用在胸水、腦脊液血液等體液標本的檢測中、檢測速度快、準確性高。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。SEQUENCE LISTING<110>上海市肺科醫(yī)院
〈120〉焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法
〈160〉4
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉25
〈212〉DNA
<213>Artificial
〈220〉
〈223〉擴增異煙肼目的片段的PCR引物
〈400〉I
atgaggtcta ttggggcaag gaagc25
〈210〉2
〈211〉21
〈212〉DNA
<213>Artificial
〈220〉
〈223〉擴增異煙肼目的片段的PCR引物
〈400〉2
cccgcagcga gaggtcagtg g21
〈210〉3
〈211〉18
〈212〉DNA
<213>Artificial〈220〉
〈223〉擴增異煙肼目的片段的PCR引物〈400〉 3
agatgggctt gggctgga18
〈210〉4
〈211〉15
〈212〉DNA
<213>Artificial
〈220〉
〈223〉檢測異煙肼耐藥突變位點的測序引物〈400〉 4
ccggtaagga cgcga15`
權利要求
1.一種焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，其特征在于，包括以下順序步驟 步驟I，對KatG基因進行PCR擴增； 步驟2，對PCR擴增產物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，針對KatG基因315位點進行焦磷酸測序并設計引物。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述對KatG基因進行PCR擴增進行兩次PCR擴增，其中第一次擴增以痰標本結核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴增以第一次擴增PCR產物為模板。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增使用的第一PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示序列，所述第二次擴增使用的第二 PCR引物具有SEQ IDNO. 3所示序列或帶有生物素標記的具有SEQ ID NO. 2所示序列。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR引物和第二 PCR引物的濃度為 0. 4 u ml/Lo
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在焦磷酸測序中用的測序引物具有SEQID NO. 4所示序列。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增反應過程包括下列順序步驟 步驟1:在94°C下進行預熱5分鐘； 步驟2 :在95°C下保持30秒進行變性、61°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，循環(huán)退火過程40次； 步驟3 :在72°C下保持10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，包括以下順序步驟步驟1，對KatG基因進行PCR擴增；步驟2，對PCR擴增產物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。本發(fā)明提供的檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的方法可以從患者痰標本直接進行耐藥性檢測，無需再做分離培養(yǎng)結核分枝桿菌菌株，相比現在常用檢測方法可以縮短檢測時間，減少焦磷酸序列測定所需要的反應次數和檢測試劑用量。
文檔編號C12Q1/02GK103045716SQ20111030510
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權日2011年10月11日
發(fā)明者鄭瑞娟, 胡忠義, 周燕, 王潔, 秦蓮花 申請人:上海市肺科醫(yī)院