一種富硒乳酸菌制劑及其生產方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制品領域，具體地說，涉及一種富硒乳酸菌制劑及其制備方法，還涉及該富硒乳酸菌制劑的應用。本發(fā)明的富硒乳酸菌制劑，其主要成分是富含有機硒的乳酸菌，所說的有機硒是通過乳酸菌發(fā)酵轉化無機硒而富集在菌體內，每克制劑中硒含量為6-15毫克。其制備方法是：a.將乳酸菌按常規(guī)培養(yǎng)擴增；b.向步驟a的發(fā)酵液中加入亞硒酸鈉溶液，使發(fā)酵液的硒含量為30-120mg/L，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)12-36小時；c.將步驟b得到的菌液離心后，洗滌沉淀物，再離心、去上清，即得產品。該富硒乳酸菌制劑能用于制備防治肝纖維化食品或藥品。本發(fā)明的制劑兼具乳酸菌和硒的生物學功能，其生產工藝簡單，該制劑特別是在防治肝纖維化方面有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種富砸乳酸菌制劑及其生產方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制品領域，具體地說，涉及一種富硒乳酸菌制劑及其制備方法，還涉及該富硒乳酸菌制劑的應用。
【背景技術】
[0002]硒是人體必需的微量元素，研究表明，硒是機體賴以清除脂質過氧化物和自由基的谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, gSH-Px)的必需組成成分,硒發(fā)揮作用的重要機制之一就是通過GSH-Px抗氧化活性實現的。硒能夠通過提高肝細胞、Ito細胞GSH-Px活性，阻止脂質過氧化損傷而發(fā)揮防止肝病作用。肝纖維化是肝臟對各種原因刺激的慢性肝損傷反應，是肝臟疾病共同可逆病理過程，進一步可發(fā)展為不可逆肝硬變。目前，由于工藝和藥價等原因，用于防病治病的硒主要還是以無機硒為主，如硒酸鈉和亞硒酸鈉，但研究證明，人體對無機硒化物的吸收效果差，利用率低，又會對人體產生程度不同的毒副作用；而有機硒化物利用率高、無任何毒副作用。
[0003]硒的有機化有兩種手段:人工合成和生物轉化。人工合成的產品很多，但價格昂貴，且轉化的產物單一，難以在實際生產中應用。硒的生物有機化主要是通過動物、植物、微生物轉化無機硒生產有機硒，如:富硒雞蛋、富硒蘑菇、富硒酵母等，其中的硒主要是以硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒-甲基硒代半胱氨酸等形式存在。
[0004]一些發(fā)達國家通過酵母富硒獲得的功能性富硒食品基料已進入工業(yè)。化大規(guī)模生產和用于食品之中。但富硒酵母含硒量通常為0.3mg/g，最高達lmg/g(微生物學報，1990，30(1):36-40 ;山西食品工業(yè)，1999，⑵:28-29)，對無機硒的轉化利用仍不夠理想。乳酸菌是食品加工和保藏的著名菌種，能分泌各種各樣的酶類、提供豐富的氨基酸和維生素，具有抗菌、降低膽固醇、維持微生態(tài)環(huán)境、抗腫瘤、增強免疫力等生物功能，但不具備硒的生物學功能。`
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種富硒乳酸菌制劑及其制備方法，本發(fā)明還提供了該富硒乳酸菌制劑的用途。
[0006]本發(fā)明的富硒乳酸菌制劑，其主要成分是富含有機硒的乳酸菌，所說的有機硒是通過乳酸菌發(fā)酵轉化無機硒而富集在菌體內，每克制劑中硒含量為6-15毫克。
[0007]以上所說的富硒乳酸菌制劑是由以下方法制得:
[0008]a.將乳酸菌按常規(guī)接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴增12-36小時:
[0009]b.向步驟a的發(fā)酵液中加入亞硒酸鈉溶液，使發(fā)酵液的硒含量為30_120mg/L，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)12-36小時；
[0010]C.將步驟b得到的菌液離心后，用水洗滌沉淀物至少3次，再離心、去上清，即得富含有機硒的乳酸菌制劑。
[0011]本發(fā)明優(yōu)選的具體步驟如下:[0012]a.將乳酸菌按常規(guī)接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴增24-36小時，
[0013]b.向步驟a的發(fā)酵液中加入質量百分濃度5-8%的亞硒酸鈉溶液，使發(fā)酵液的硒含量為30-80mg/L，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24-36小時，
[0014]c.將步驟b得到的菌液離心、無菌生理鹽水洗滌3-5次后，離心、去上清，即得富含有機硒的乳酸菌制劑。
[0015]本發(fā)明制備過程中所說的培養(yǎng)基優(yōu)選MRS液體培養(yǎng)基。所說的乳酸菌優(yōu)選保加利亞乳桿菌(Lactobacill bulgulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜酸乳桿菌(Lacidophilus)或乳鏈球菌(J.1actis)。上述微生物菌種由中科院微生物研究所微生物菌種保藏中心提供。
[0016]在上述步驟c中用水洗滌沉淀物的目的是洗去無機硒，其中所說的水，根據制備產品的不同要求可以是普通水、蒸餾水、無菌水或無菌生理鹽水等。
[0017]發(fā)明人在實驗中發(fā)現，乳酸菌混合培養(yǎng)的富硒效果不如單一菌種，因此，要得到(混合型)富硒乳酸菌制劑，最好是先用單一菌種轉化無機硒，得到相應富硒乳酸菌制劑，再將得到的上述制劑混合。
[0018]本發(fā)明所說的富硒乳酸菌制劑在制備防治肝纖維化制品中的應用。本發(fā)明的富硒乳酸菌制劑富含有機硒，經動物實驗表明:能明顯抗肝纖維化，通過干預肝纖維化組織細胞脂質過氧化反應，特別是明顯改善抗氧化酶活性系統(tǒng)發(fā)揮效應；在干預肝纖維化過程中，還通過改善和提高機體免疫細胞功能活性發(fā)揮積極有效的作用。因此，該制劑本身就具有防治肝纖維化的功效，此外，還可將其作為食品或藥用基料來生產制備防治肝纖維化的食品或藥品。
[0019]本發(fā)明的有益效果是，利用乳酸菌富集轉化無機硒為有機硒，既提升了乳酸菌自身的營養(yǎng)及醫(yī)療保健功能，又增加了其附加值。本發(fā)明的生產工藝簡單、操作簡便、轉化率聞于酵母富砸。
[0020]本發(fā)明的富硒乳酸菌制劑能夠提高正常機體抗氧化能力、免疫功能；干預肝纖維化組織細胞脂質過氧化反應，特別是明顯改善抗氧化酶活性系統(tǒng)等優(yōu)點。因為本發(fā)明是借助乳酸菌利用無機硒轉變而成的一種生物制劑，安全可靠，既可作為功能性食品添加劑，又可作為防病治病的功能性調節(jié)劑。因此，市場實施可操作性強，具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0021]實施例1:配制乳酸菌MRS液體培養(yǎng)基:按1000ml蒸餾水中加入蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,酵母浸膏5.0g,葡萄糖20.0g,乙酸鈉5.0g,檸酸三胺2.6g，吐溫801.0g,K2HPo42.0g, MgSo4.7Η2ο 0.58g, MnSo4.H20 0.25g ;混合溶解調 pH 至 6.0-6.4，121°C滅菌15min。
[0022]取活化的保加利亞乳桿菌的菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，在42°C下培養(yǎng)擴增后，加入5%亞硒酸鈉溶液使培養(yǎng)基的硒含量為64mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集菌液、離心(2000r/min, 15min)、無菌生理鹽水反復洗滌5次，再離心后，沉淀物即為富含有機硒的保加利亞乳桿菌制劑。
[0023]按以下方法測定硒含量:
[0024](I)標準硒工作液準備[0025]精密稱取分析純亞硒酸鈉，加硝酸溶液制成每毫升含1.0mg硒的標準貯備液；精密量取標準貯備液lmL，用硝酸溶液定容至IOOmL即為標準硒工作液。
[0026](2)樣品消化
[0027]精密稱取0.3g富硒保加利亞乳酸菌制劑干粉樣品于小燒杯中，加少量水濕樣，然后再加入消化液(雙氧水:高氯酸:濃硫酸二 3: 3: 1)，搖勻。置通風櫥內電爐上消化至終點后，加5% EDTA-2Na溶液2mL，搖勻，用40%氫氧化鈉于冷水浴中調PH至中性，定容至IOOmL,同法做對照空白實驗。
[0028](3)樣品測量和標準曲線制定
[0029]精密量取5mL消化液于分液漏斗中，另取7個分液漏斗，分別加入與消化液等量的空白溶液及標準硒工作液0.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mL，5 %氫氧化鈉溶液調PH至中性，加2mol/L甲酸溶液3mL，然后加水至35mL，搖勻。各分液漏斗中加入0.5% 3，3’- 二氨基聯苯胺溶液5.0mL，搖勻后置暗處反應30min。用5%氫氧化鈉溶液調PH6.5-7.0，精密加入甲苯IOmL,震搖萃取Imin,靜置分層,取甲苯層濾液于ImL比色皿中，在波長420nm處測光密度(OD)值。用標準硒工作液的OD值繪制標準曲線，在曲線上查出與樣品消化液對應的硒含量。標準硒在0.02-0.1me/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為y = 0.045+0.114x,擬合度超過0.99。測定消化液的OD值后代入回歸方程即可得到該富硒乳酸菌制劑的硒含量為 9.00-11.45me/g。
[0030]實施例2:與實施I基本相同，不同之處在于，取活化的嗜熱鏈球菌的菌落于IVIRS液體培養(yǎng)基中，在42°C下培養(yǎng)擴增12h后，加入8%亞硒酸鈉溶液使培養(yǎng)基的硒含量為30me/L,繼續(xù)培養(yǎng)12h,收集菌液、離心(2000r/min, 15min)、蒸懼水反復洗漆3次,再離心后，沉淀物即為富含有機硒的嗜熱鏈球菌制劑，有機硒含量可達6-12me/g。
[0031]實施例3:與實施I基本相同，不同之處在于，將所述的保加利亞乳桿菌用嗜酸乳桿菌替代，培養(yǎng)擴增24h后，加入9%亞硒酸`鈉溶液使培養(yǎng)基的硒含量為120me/r，，繼續(xù)培養(yǎng)36h,收集菌液、離心(2000r/min, 15min)、生理鹽水反復洗漆3次,再離心后,去上清即制得富含有機硒的嗜酸乳桿菌制劑，有機硒含量可達8-15mg/g。
[0032]實施例4:與實施I基本相同，不同之處在于，將所述的保加利亞乳桿菌用乳鏈球菌替代，在37°C下培養(yǎng)36h，加入亞硒酸鈉溶液使培養(yǎng)基的硒含量為80me/L，繼續(xù)培養(yǎng)36h，收集菌液、離心(2000r/min，15min)、無菌水反復洗滌6次，再離心后，沉淀物即為富含有機硒的乳鏈球菌制劑，有機硒含量可達8-12mg/g。
[0033]實施例5:取實施1、實施2、實施3和實施4制得的富硒乳酸菌制劑中的至少兩種按比例配合在一起，混勻后即制成(混合型)富硒乳酸菌制劑。實施例6:本發(fā)明制劑用于防治肝纖維化動物試驗將60只健康成年SD大鼠(雌雄各半)，經I周適應性飼養(yǎng)后，隨機分成對照組、纖維化組、有機硒抗纖維化保護組，每組20只。纖維化組和保護組大鼠腹腔注射用橄欖油稀釋的50%四氯化碳(CCl4)溶液誘發(fā)肝纖維化，對照組用同樣方法注射同等劑量的橄欖油。對照組和纖維化組飼喂普通全價飼料，保護組飼喂添加含硒習mg/kg飼料的富硒乳酸菌制劑全價飼料。大鼠自由采食、飲水，環(huán)境溫度20-25°C。整個試驗持續(xù)4周。觀察動物表現，并在試驗的第2、4周宰殺大鼠取肝臟組織勻漿測定MDA含量和GSH-Px活性。
[0034]試驗結果:注射CCl4后第I天，纖維化組大鼠即出現明顯臨床癥狀:精神抑郁，減食，毛色暗淡、紊亂，但在第2周剖檢尚未見明顯病理變化，在4周后剖檢可見纖維化組大鼠肝臟纖維化，有粘連，器官呈蒼白感，腹水嚴重，而日糧添加乳酸菌有機硒制劑的保護組大鼠，在整個實驗期里沒有明顯的臨床癥狀和剖檢病理變化，對照組大鼠無異常表現。整個實驗期內，富硒乳酸菌制劑能顯著提高肝損傷組織勻漿GSH-Px活性；纖維化組肝組織勻漿MDA含量顯著升高，而保護組與對照組接近。表明富硒乳酸菌制劑能通過抗損傷保護，干預肝損傷脂質過氧化反應，改善抗氧化酶活性`發(fā)揮正常有效的作用。
【權利要求】
1.一種富硒乳酸菌制劑，其特征在于，其主要成分是富含有機硒的乳酸菌，所說的有機硒是通過乳酸菌發(fā)酵轉化無機硒而富集在菌體內，每克制劑中硒含量為6-15毫克。
2.如權利要求1所說的富硒乳酸菌制劑，其特征在于，其中所說的乳酸菌是保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜酸乳桿菌(L acidophilus)或乳鏈球菌(S.1actis)。
3.一種制備權利要求1或2所說的富硒乳酸菌制劑的方法，包括以下步驟: a.將乳酸菌按常規(guī)接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴增12-36小時； b.向步驟a的發(fā)酵液中加入亞硒酸鈉溶液，使發(fā)酵液的硒含量為30-120mg幾，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)12-36小時； c.將步驟b得到的菌液離心后，用水洗滌沉淀物至少3次，再離心、去上清，即得富含有機硒的乳酸菌制劑。
4.如權利要求3所說的制備方法，其特征在于，具體是: a.將乳酸菌按常規(guī)接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴增24-36小時， b.向步驟a的發(fā)酵液中加入質量百分濃度5-8%的亞硒酸鈉溶液，使發(fā)酵液的硒含量為30-80mS幾，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24-36小時， c.將步驟b得到的菌液離心、無菌生理鹽水洗滌3-5次后，離心、去上清，即得富含有機硒的乳酸菌制劑。5、如權利要求4所說的制備方法，其特征在于，步驟a中所說的培養(yǎng)基是MRS液體培養(yǎng)基。
5.如權利要求5所說的制備方法，其特征在于，其中所說的MRS液體培養(yǎng)基具體按以下制得:按1000ml蒸餾水中加入蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖20.0g,乙酸鈉 5.0g，檸酸三胺 2.6g，吐溫 801.0g, K2HPo42.0g, MgSo4.7Η2ο 0.58g，MnSo4.H20.0.25g ;混合溶解調 pH 至 6.0-6.4,121°C滅菌 15min。
【文檔編號】C12P1/04GK103751220SQ201110319785
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2011年10月20日 優(yōu)先權日:2011年10月20日
【發(fā)明者】朱琴 申請人:朱琴