專利名稱：一種用于鑒定油茶品種的方法及其專用引物和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及油茶品種的鑒定方法，具體涉及一種用于鑒定油茶品種基于遺傳基因的方法及其專用引物和方法。
背景技術：
油茶是世界四大木本油料樹種之一，也是我國最重要的木本油料經濟作物，其壽命長，具有一次種植、多年受益的特點，穩定收獲期可長達80年以上。然而，一旦誤用不當或偽劣品種造林，影響也將是深遠的。近年我國政府投入巨資，大力發展油茶產業。按國家發展規劃，到2015年全國的油茶種植規模將要達到六千萬畝左右。在油茶產業蓬勃發展過程中，造林種苗是否為真實的優良品種，如同優良品種的選育本身一樣，也是油茶林優質高產的基礎。為確保油茶產業健康發展，急需建立一套真實、簡便、快速、可靠的油茶品種遺傳真實性鑒定技術，以滿足對油茶種苗生產的監督檢查、對新品種進行認定，以及對育種工作者的知識產權進行保護的需要。植物品種遺傳真實性鑒定的關鍵是所依賴的技術手段。以往植物品種鑒別所采用的方法主要是依據植物的形態特征。但植物品種間在形態上的差異，特別是苗期的差異，往往并不十分顯著。尤其對油茶這類世代周期長的物種，性狀的差異一般到了成熟期才能表現出來，大多數品種根本無法從幼苗的形態上進行鑒別。自上世紀八十年代以來，現代分子標記技術的應用，為植物新品種的鑒定提供了準確可靠的技術手段。分子標記是以DNA為基礎的標記技術，是指能反映生物個體或種群間基因組差異的特征DNA 片段，也稱DNA指紋圖譜。隨著分子標記技術的發展，通過DNA指紋技術鑒別生物個體已經成為一項成熟的技術，并在許多植物新品種鑒別中得到了廣泛應用。分子標記技術直接以植物DNA為分析對象，從根本上克服了環境的影響，同時也不受基因表達的限制， 在DNA水平上進行品種遺傳真實性鑒定不僅可靠性高，而且大大提高了檢測效率。常見的分子標記有RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism限制片段長度多態
) > ISSR(Inter-simple sequence repeat M S M ^lJ ) > RAPD (Random amplified polymorphic DNA) > AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism, 性)、SSR(Simple Sequence R印eat，簡單重復序列)等。應用分子標記對植物品種進行遺傳真實性鑒定需要考慮以下因素1.簡便、快速，易于在實際檢驗工作中推廣使用；2.標記針對待檢物種有高度特異性，使檢測結果不受內源和外源微生物或病原菌影響；3.標記擴增基因位點多態性高，可以利用較少的引物組合達到較高的檢測精度。考慮上述要求，微衛星標記是目前不同標記類型中，用于植物品種遺傳真實性鑒定的最高效的分子標記。微衛星DNA也稱簡單重復序列，是由長度為l-6bp串聯重復序列組成，微衛星是基因組中變異最為迅速的序列，其高度多態性主要來源于串聯數目的不同。微衛星標記是基于PCR擴增為基礎的標記，微衛星標記分析相對于基于分子雜交為基礎的標記要簡便、快速的多。同時微衛星引物是由待檢物種的基因組序列開發而來，具有極高的種屬特異性，這樣既使樣品中含有不同的內源和外源微生物或病原菌污染，檢測結果也不會受到干擾。這一優點是RAPD或AFLP等這類隨機標記所不具備的。油茶不同品種間同一位點的SSR重復次數存在差異，造成了品種間等位位點的長度多態性。根據微衛星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由于微衛星串聯重復數目不同，通過擴增片段的電泳分離，可以獲得不同微衛星位點的基因型頻率信息。根據不同品種在不同微衛星位點的基因型頻率，就可以估算出不同品種遺傳真實性鑒定的準確概率。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種真實、簡便、快速、可靠的用于鑒定油茶品種的方法，為油茶新品種保護，保證油茶產業的健康和可持續發展，把好種苗質量關，提供關鍵技術支撐。本發明的另一目的是提供一種上述用于鑒定油茶品種的方法的專用引物。本發明還有一目的是提供上述用于鑒定油茶品種的方法的試劑盒。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下—種用于鑒定油茶品種的專用引物，所述引物至少為下表中的2個引物對
權利要求
1. 一種用于鑒定油茶品種的專用引物，其特征在于所述引物至少為下表中的2個引物對
2.一種用于鑒定油茶品種的試劑盒，其特征在于含有權利要求1所述的10個用于鑒定油茶品種的引物對。
3.根據權利要求2所述的用于鑒定油茶品種的試劑盒，其特征在于還包括10XPCR 緩沖液、dNTP、雙蒸水、以及Taq DNA聚合酶。
4.一種用于鑒定油茶品種的方法，其特征在于分別以待鑒定的油茶樣品DNA和標準對照樣的DNA為模板，在任意選取的兩個引物對引導下進行PCR擴增獲得產物，對產物進行電泳，對電泳結果進行基因型比對，若檢測到基因型不同為則為不同品種；若檢測到基因型均相同，查表2相應引物基因型出現的頻率，計算待檢樣品與標準樣品基因型相同的概率； 若相同概率達不到檢測要求時，選取第三對引物進行檢測，直至相同概率達到檢測要求即可；其中，引物對為權力要求1所述的專用引物，表2為說明書中的表2。
5.根據權利要求4所述的用于鑒定油茶品種的方法，其特征在于PCR反應體系為模板 DNA 25ng，FAM標記的上、下游引物各 20ng，200uM dNTP,0. 5 U Taq 聚合酶，1. 5uL 含 100 uM pH 8. 3 的 Tris-HCl、500 mM KCl, 20 mM MgCljPlO. 0 g /L BSA 的 IOX buffer，加滅菌去離子水補充反應積到15uL ；PCR反應條件為94°C預變性^iin ； 94°C變性30s，50°C退火30 s，72°C延伸lmin，進行30個循環；72°C延伸5min。
6.一種用于鑒定油茶品種的方法，其特征在于分別以待鑒定的油茶樣品DNA和標準對照樣的DNA為模板，用鑒定油茶品種的試劑盒進行PCR擴增獲得產物，對產物進行電泳， 對電泳結果進行基因型比對，若檢測到基因型不同為則為不同品種；若檢測到基因型均相同，查表2相應引物基因型出現的頻率，計算待檢樣品與標準樣品基因型相同的概率；若相同概率達不到檢測要求時，選取第三對引物進行檢測，直至相同概率達到檢測要求即可；其中，試劑盒為權利要求2或3所述的用于鑒定油茶品種的試劑盒，表2為說明書中的表2。
7.根據權利要求6所述的用于鑒定油茶品種的方法，其特征在于PCR反應體系為模板 DNA 25ng，FAM 標記的上、下游引物各 20ng，200uM dNTP,0. 5 U Taq 聚合酶，1. 5uL 含 100 uM pH 8. 3 的 Tris-HCl、500 mM KCl, 20 mM MgCljPlO. 0 g /L BSA 的 IOX buffer，加滅菌去離子水補充反應積到15uL ；PCR反應條件為94°C預變性^iin ； 94°C變性30s，50°C退火30 s，72°C延伸lmin，進行30個循環；72°C延伸5min。
全文摘要
本發明公開了一種用于鑒定油茶品種的方法及其專用引物和試劑盒，該方法分別以待鑒定的油茶樣品DNA和標準對照樣的DNA為模板，在相同引物對引導下進行PCR擴增獲得產物，對產物進行電泳，對電泳結果進行基因型比對，基因型不同為不同品種，否則進行相同概率計算，達不到檢測要求，繼續選擇引物進行PCR鑒定，直至符合鑒定概率要求即可；與現有的油茶鑒定方法相比，本發明的突出優點包括利用10對油茶專用微衛星引物，進行油茶品種的遺傳真實性鑒定，鑒定方法操作簡單、快捷，鑒定的準確率高。此外，根據本發明的方法開發出相應的檢測試劑盒，用于油茶品種遺傳真實性鑒定，具有使用方法簡單、快速、靈敏的優點，檢測結果可靠、穩定、準確，為油茶品種遺傳真實性鑒定提供了可靠技術手段。本發明將為油茶良種使用的監督檢驗發揮重要作用，應用前景廣闊，具有很好的實用性，能夠產生較好的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12Q1/68GK102321768SQ20111032197
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者史潔, 尹佟明, 戴曉港, 施季森, 管宏偉, 陳金慧 申請人:南京林業大學