專利名稱：一株對蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用的構巢裸胞殼的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株構巢裸胞殼。
技術背景
化石能源將逐步枯竭，新能源和可再生能源為能源供給提供了重要選擇，燃料乙醇作為一種C、H比例小、燃燒熱值大、CO2排放量低的燃料，正日益受到廣泛關注。以玉米、 小麥等糧食為原料生產乙醇威脅著糧食安全，因此以木質纖維素為原料生產乙醇，即纖維乙醇得到各國政府的支持。
預處理方法是制約纖維乙醇發展的瓶頸之一，對于糖得率和發酵性能有重要影響。蒸汽爆破法處理過程中無需加入化學品，且處理后纖維素的酶水解率較高，具有處理時間短、環境污染小、低能耗的優勢，是目前比較推崇的預處理技術。但由于蒸爆過程的處理條件比較激烈，這一過程中會產生甲酸、乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等發酵抑制物，會對后續的發酵過程產生影響，因此需要對汽爆物料進行脫毒處理。解毒方法主要包括生物解毒、物理解毒、化學解毒。其中生物解毒是指用一些特定的酶或微生物作用于發酵抑制物，通過改變抑制物的結構而降低其毒性，包括酶處理法和微生物處理法。微生物處理方法與酶處理方法的原理是相同的，但微生物能夠持續地產生多種酶，能同時去除多種抑制物質，與酶處理法相比具有成本低，解毒效率高的優點。發明內容
本發明提供了一株構巢裸胞殼(Emericella nidulans)，能夠去除乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等蒸汽爆破預處理所產生的發酵抑制物，提高燃料乙醇的得率。
本發明對蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用的構巢裸胞殼為構巢裸胞殼 110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2010年12月M日， 保藏編號為CGMCC No. 4514。
本發明的構巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)屬于子囊菌門(Ascomycota)，散囊菌目(Eurotiales)，發菌禾斗(Trichocomaceae)，曲菌屬 (Aspergillus)。
本發明構巢裸胞殼110在剛果紅纖維素瓊脂培養基上培養，菌落呈圓形，結構致密，邊緣呈鋸齒狀，菌落隆起，干燥，不透明(如圖1所示)，培養2天菌落直徑為8mm ；在普通光學顯微鏡下觀察，菌絲體為白色，菌絲有隔，產灰綠色孢子，分生孢子頭(如圖2和圖3 所示)。
本發明構巢裸胞殼110可在剛果紅纖維素瓊脂培養基和察氏培養基中生長，最適生長溫度28 0C，最適pH值為6。
本實施方式構巢裸胞殼110對經蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用，可以清除抑制纖維素降解和發酵的有毒物質，這些有毒物質包括Ca2+、Mg2+、Al3+、狗2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羥甲基2-呋喃甲醛。
本發明構巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2010年12月M日，保藏編號為CGMCC No. 4514。


圖1為本發明構巢裸胞殼110的菌落形態圖；圖2為本發明構巢裸胞殼110的透視電鏡照片；圖3為本發明構巢裸胞殼110的掃描電鏡照片；圖4為構巢裸胞殼110和相近菌株的18S rDNA序列進行同源性比對構建的系統發育樹圖；圖5構巢裸胞殼110對Ca2+的去除效果；圖6為構巢裸胞殼110對Mg2+的去除效果；圖7為構巢裸胞殼110對Al3+的去除效果；圖8為構巢裸胞殼110對!^2+的去除效果；圖9為構巢裸胞殼110以葡萄糖為碳源對有機酸的代謝效果，其中- -為乙酸，-Δ-為丁酸，為丙酸；圖10為構巢裸胞殼110以混合有機酸為碳源的代謝效果，其中- -為乙酸，-Δ -為丁酸，-□-為丙酸； 圖11為構巢裸胞殼110以木糖為碳源對有機酸的代謝效果，其中- -為乙酸，-Δ -為丁酸，-■-為丙酸；圖12為構巢裸胞殼110對糠醛在40°C的共代謝效果，其中- -為以糠醛為唯一碳源，-□-為以葡萄糖作主要碳源；圖13為構巢裸胞殼110對糠醛在35°C的共代謝效果，其中- -為以糠醛為唯一碳源，-口 -為以葡萄糖作主要碳源；圖14為構巢裸胞殼110對羥甲基糠醛(5-羥甲基2-呋喃甲醛)在40°C的共代謝效果，其中- -為以 5-羥甲基2-呋喃甲醛為唯一碳源，-■-為以葡萄糖作碳源；圖15為構巢裸胞殼110對羥甲基糠醛(5-羥甲基2-呋喃甲醛)在35°C的共代謝效果其中- -為以5-羥甲基2-呋喃甲醛為唯一碳源，-■-為以葡萄糖作碳源。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式對蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用的構巢裸胞殼為構巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2010年 12月24日，保藏編號為CGMCC No. 4514。
本實施方式構巢裸胞殼110在剛果紅纖維素瓊脂培養基上培養，菌落呈圓形，結構致密，邊緣呈鋸齒狀，菌落隆起，干燥，不透明，培養2天菌落直徑為8mm ；在普通光學顯微鏡下觀察，菌絲體為白色，菌絲有隔，產灰綠色孢子，分生孢子頭。
本實施方式構巢裸胞殼110可在剛果紅纖維素瓊脂培養基和察氏培養基中生長， 最適生長溫度280C，最適pH值為6。
剛果紅纖維素瓊脂培養基(IOOOmL)由0. 50g Κ2ΗΡ04、0· 25g MgS04、1. 88g纖維素粉、0. 20g剛果紅、14g瓊脂、2g明膠和余量的蒸餾水組成，調節pH為5，于121°C滅菌30min。 察氏培養基(IOOOmL)由 3g NaNO3>0. 50g Κ2ΗΡ04、0· 5g KC1、0. Olg FeS04、30g 蔗糖、20g 瓊脂和余量的蒸餾水組成，于121°C滅菌30min。
具體實施方式
二本實施方式構巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)由秸稈堆肥中分離、純化得到，具體步驟為取IOg秸稈堆肥，放入IOOmL裝有玻璃珠的無菌水中，振蕩1小時后制成混濁液；吸取5mL懸浮液裝入盛有30mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基的三角瓶中，于100r/min、35°C的條件下培養3 5天；之后更換新鮮的馬鈴薯葡萄糖液體培養基繼續培養，轉接5 6次后進行分離，得富集培養后的培養液。取富集培養后的培養液，采用倍比稀釋法將樣品稀釋至10、ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4,10_5，將稀釋液滴入無菌的剛果紅纖維素瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養基表面，在35°C培養 4天，挑選水解圈較大的單獨菌落移入斜面，進行菌種分離。待斜面菌體生長飽滿后進行平板劃線純化培養，至菌落形態一致，結合顯微鏡檢測個體形態特征后，再挑選單一菌落移種斜面，即得到構巢裸胞殼110。
所述馬鈴薯葡萄糖液體培養基(IOOmL)由200g、20g葡萄糖和余量的蒸餾水組成， 于 121°C 滅菌 30min。
對分離純化得到的構巢裸胞殼110進行分子生物學鑒定，按以下步驟進行提取菌株的總DNA，采用真菌通用引物ITS擴增構巢裸胞殼FLZlO的18s rDNA ITS序列，PCR產物純化后，進行測序，測序結果與GenBank中的18S rDNA序列進行同源性比對，然后用軟件CLUSTALX 1. 83和MEGA 4. 1以近鄰結合法構建系統發育樹(如圖4所示)，以確定菌株的種屬關系。同源性分析結果表明，該序列與四脊裸胞殼(Emericella quadrilineata)的 18S rDNA序列的同源性最高，保守區相似性為100%，通過結合菌體形態特征、生長條件、生理生化鑒定結果確定構巢裸胞殼110屬于曲霉屬，為構巢裸胞殼。
PCR引物購買自上海生工生物技術有限公司。
本實施方式構巢裸胞殼110對經蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用，可以清除抑制纖維素降解和發酵的有毒物質，這些有毒物質包括Ca2+、Mg2+、Al3+、狗2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羥甲基2-呋喃甲醛。無機離子方面，構巢裸胞殼110對Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe2+ 均有明顯的去除效果，培養48h去除率分別為70 %、50 %、90 %、80 %。有機物方面，35 °C時以葡萄糖為碳源的培養基中，構巢裸胞殼110對乙酸、丙酸、丁酸于96h的去除率可分別達 24. 20 %、30. 92 %、27. 73 %。35°C時以葡萄糖為碳源的培養基中，構巢裸胞殼110對糠醛和 5-羥甲基2-呋喃甲醛的去除率分別為56. 52%、69. 21%。
對無機離子的去除試驗將察氏培養基分裝于4個IOOmL的三角瓶中，每個三角瓶分裝50mL，培養基中葡萄糖的質量百分比濃度為1%。在4個三角瓶的培養基中分別加入 Ca2+、Mg2+、Al3+和Fe2+，使培養基中的離子濃度分別為|丐離子800mg/L、鎂離子500mg/L、鋁離子80mg/L、鐵離子350mg/L，調節pH至5. 0，于115°C滅菌30min。向4個培養基中分別接種構巢裸胞殼110，于40°C、150rpm/min培養48小時，然后于0h、24h和4 取樣，采用離子發射光譜(ICP)測定各離子濃度。
本實施方式構巢裸胞殼110對Ca2+的去除效果如圖5所示，構巢裸胞殼110對Mg2+ 的去除效果如圖6所示，構巢裸胞殼110對Al3+的去除效果如圖7所示，構巢裸胞殼110對 Fe2+的去除效果如圖8所示。從圖中可以看出，隨著培養的進行，培養液中的離子濃度下降趨勢明顯。構巢裸胞殼110對過量的Ca2+有明顯的去除作用，培養4 去除率可達70% ； 構巢裸胞殼110對!^2+的去除作用明顯，培養4 去除率可達80% ；構巢裸胞殼110可以對Mg2+進行去除，培養4 去除率在50%左右；構巢裸胞殼110在培養4 對Al3+的去除率可達90%。
通過以上分析可見，構巢裸胞殼110對Ca+、Mg2+、Al3+和Fe2+均有明顯的去除效果， 由此可以推測，由于構巢裸胞殼110的存在可以代謝發酵液中部分過量的離子，使得酵母所需的離子處于適宜的濃度范圍內，在一定程度上解除過量離子對酵母的抑制作用。
對有機酸的去除試驗將乙酸、丙酸和丁酸混合，使每種酸在察氏培養基中的體積濃度均為2%，得混合酸，將混合酸分別加到察氏培養基中，①葡萄糖作為碳源，混合酸加到察氏培養基中；②混合酸做碳源，混合酸加到不加葡萄糖的察氏培養基中；③木糖作為碳源，混合酸加到以木糖替代葡萄糖的察氏培養基中。以上三組培養基均調節PH為5. 5，分別接種構巢裸胞殼110進行培養，于0h、24h、4a!、7a!、％h分別取樣，用氣相色譜測定有機酸濃度。
本實施方式構巢裸胞殼110以葡萄糖為碳源對有機酸的代謝效果如圖9所示，構巢裸胞殼110以混合有機酸為碳源的代謝效果如圖10所示，構巢裸胞殼110以木糖為碳源對有機酸的代謝效果如圖11所示。從圖9中可看出，在35°C時，乙酸、丙酸和丁酸三種酸在培養96h時濃度均有下降，96h的去除率可分別達24. 20%、30. 92%、27. 73%。從圖10 中可看出，在35°C時，雖然從Oh 96h的趨勢較為起伏，在培養24h濃度均有明顯的降低， 其后又逐漸升高。但總體來說，培養96h乙酸、丙酸和丁酸三種酸濃度有略微的下降，分別降低12.75^^9.76^^10.68 ^木糖是發酵醪液中一種主要的五碳糖，由半纖維素降解得到。通常情況下，微生物更容易直接利用的碳源是葡萄糖，但當木糖作為唯一初級能源物質存在時，從圖11中可看出，構巢裸胞殼110也可以通過木糖作為碳源進行共代謝，在35°C 時，三種酸的濃度均有降低，乙酸、丙酸和丁酸的去除率分別為13. 73%、19. 76%,22. 12%.
對醛的去除試驗分為以下四組進行，(1)葡萄糖作為碳源，的糠醛加到察氏培養基中；的糠醛加到無葡萄糖的察氏培養基中；C3)葡萄糖作為碳源，的5-羥甲基2-呋喃甲醛加到察氏培養基中；1 %的5-羥甲基2-呋喃甲醛加到無葡萄糖的察氏培養基中；四組培養基中分別接種構巢裸胞殼110進行培養，以上四組實驗條件均為 pH5. 5，分別在40°C (SSF工藝溫度)和35°C (SHF工藝發酵溫度)進行。分別于0h、24h、 48h.72h.96h取樣，用液相色譜測定5-羥甲基2-呋喃甲醛濃度，紫外分光光度發測定糠醛濃度。
本實施方式構巢裸胞殼110對糠醛在40°C的共代謝效果如圖12所示，構巢裸胞殼 110對糠醛在35°C的共代謝效果如圖13所示。由圖可見，在以葡萄糖作為碳源的培養基中， 兩種溫度下，構巢裸胞殼110對于糠醛均有去除作用，在24h會有濃度略微的升高，然后培養基中的糠醛濃度幾乎呈直線下降，培養96h，35°C和40°C條件下的去除率分別為56. 52% 和觀.10%。這說明構巢裸胞殼110可以在葡萄糖存在條件下代謝糠醛，且在35°C條件下， 更適合構巢裸胞殼110對糠醛的去除。在無葡萄糖的培養體系中，24h糠醛濃度有較大的升高，而后培養中糠醛濃度基本維持恒定，無明顯的去除效果，說明在沒有可利用的初級能源物質存在的條件下，構巢裸胞殼110不能代謝糠醛。
本實施方式構巢裸胞殼110對羥甲基糠醛(5-羥甲基2-呋喃甲醛)在40°C的共代謝效果如圖14所示，構巢裸胞殼110對羥甲基糠醛(5-羥甲基2-呋喃甲醛)在35°C的共代謝效果如圖15所示。由圖可見，構巢裸胞殼110對于5-羥甲基2-呋喃甲醛的去除效果與對糠醛的去除類似，在含有葡萄糖的培養基中，35°C和40°C條件下的去除率分別為 69. 21%,50. 25%。在無葡萄糖的培養基中無明顯的去除效果。
權利要求
1. 一株對蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用的構巢裸胞殼，其特征在于對蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用的構巢裸胞殼為構巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2010年12月M 日，保藏編號為CGMCC No. 4514。
全文摘要
一株對蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用的構巢裸胞殼，涉及一株構巢裸胞殼。本發明提供了一株構巢裸胞殼，能夠去除乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等蒸汽爆破預處理所產生的發酵抑制物，提高燃料乙醇的得率。本發明對蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用的構巢裸胞殼為構巢裸胞殼110，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2010年12月24日，保藏編號為CGMCC No.4514。構巢裸胞殼110對經蒸汽爆破預處理產物具有解毒作用，可以清除抑制纖維素降解和發酵的有毒物質，這些有毒物質包括Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羥甲基2-呋喃甲醛。
文檔編號C12P7/10GK102505000SQ20111033752
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月31日 優先權日2011年10月31日
發明者于艷玲, 馮玉杰, 徐琛, 李冬梅, 李梓木 申請人:哈爾濱工業大學