專利名稱：一種快速檢測馬鈴薯y病毒煙草分離物的方法
技術領域：
本發明涉及植物病毒學技術領域，尤其是一種快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物的方法。
背景技術：
馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是馬鈴薯病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y 病毒屬(Potyvirus)的典型成員。在東亞地區、中南美洲、加拿大、墨西哥、哥斯達黎加及美國均有發生，我國各主要煙區亦普遍發生，該病毒還可侵染茄科、莧科、藜科、菊科和豆科的 120余種植物。其病毒粒子呈彎曲線狀，無包膜，長約700nm，直徑11 13nm，螺旋對稱結構，可在感病寄主體內形成風輪狀內含體。標準沉降常數S20w= 1MS，氯化銫中的浮力密度為 1.33g/cm3。煙葉粗汁液的鈍化溫度為55°C，10min，稀釋限點(DEP)為1X10—4，體外存活期 (LIV) 5 10 天。病毒核酸為單分子線形正義ssRNA，長9496nt，基因組結構具有典型馬鈴薯Y病毒屬病毒結構特征，核酸約占病毒粒子重量的5%。病毒外殼蛋白由一種多肽組成，分子質量約 30 47kDa。PVY基因組RNA具有典型的馬鈴薯Y病毒屬病毒基因組結構特征，其5 ‘端為VPg 結構，3'端為Poly(A)尾。基因組編碼一個多聚蛋白，切割產生10個蛋白，分別為Pl蛋白(功能未知)、HC-Pro蛋白(與蚜蟲傳播相關)、P3蛋白(功能未知)、6K1蛋白(功能未知)、CI蛋白(柱狀內含體蛋白)、6K2蛋白(功能未知)、NIa-VPg蛋白(即VPg蛋白)、 NIa-Pro蛋白(核內含體蛋白酶)、NIa蛋白(核內含體復制酶)和外殼蛋白。基于病毒外殼蛋白抗原抗體反應的免疫吸附法和基于病毒核酸的LAMP檢測是目前應用廣泛的檢測病毒的方法。但現有方法在檢測時間、不靈敏和穩定性等方面存在不足， 且檢測特異性不強。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物的方法，即結合了上述兩種方法的免疫捕獲RT-LAMP，免疫捕獲RT-LAMP (IC-RT-LAMP)主要由三個部分組成，第一部分的免疫反應類似于普通的免疫吸附試驗的測定過程，第二部分為第一鏈cDNA的合成，第三部分即通常的LAMP擴增，為快速、靈敏的檢測大量樣品，使用了一步法反轉錄環介導等溫擴增，即將后兩步合并為一步。整個技術省略了繁瑣的RNA提取、第一鏈cDNA的合成以及LAMP擴增等三個步驟， 利用馬鈴薯Y病毒煙草分離物抗體的高效價和特異性以及簡便、靈敏的LAMP法擴增，特異、 快速的檢測樣品中的病毒病原，通過肉眼或濁度儀判定病樣中是否含有馬鈴薯Y病毒，為快速檢測病毒提供了一種快速、特異和靈敏的方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的一種快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物的方法，其步驟包括通過馬鈴薯Y病毒煙草分離物特異性抗體誘捕病株樣品中的馬鈴薯 Y病毒、高溫變性獲得病毒RNA作為模板、利用馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因3'末端引物及四條特異反應引物進行一步法反轉錄環介導等溫擴增(Reverse-transcriptionLoop-Medi ated Isothermal Amplification，RT-LAMP)法擴增，肉眼觀察或濁度儀在400nm波長下檢測沉淀濁度或電泳條帶觀察，判斷樣品中是否帶有病毒。1.引物設計用于反轉錄反應的3'端引物5' -CCA AGC TTC ATG TTC TTS ACT CCA AGT ARA-3'用于LAMP反應的四條引物PVY-FIP 5' -CGT CCT TCT CCT TTT CTT TGT TGA ATT TTG AAG GAT GCA AAA CAAGAG C-3'，PVY-BIP 5' -ATC TGG AAC TCA TAC TGT GCC ACT TTT TCA GTA CAG TTG CACCCT-3‘，PVY-F3 5' -AAT CGA TGC AGG AGG AAG-3‘，PVY-B3 5' -AGC ATA CTC GAG TAA ATG TTC T-3'。2.病毒粒子的免疫捕獲在PCR管中加入稀釋為1 1000的PVY兔多抗血清，4°C下包被過夜，PBST洗滌3 次。煙草病樣用PBST研磨，IOOOg離心lmin，取100 μ 1上清加入PCR管中，溫育汕；PBST 洗滌3次，H2O洗滌1次，短暫離心，吸去殘液。
3.高溫變性
加25 μ 1 DEPC處理的超純水，97°C變性5min，即刻插入冰內X預冷3_5min。
4.一步法 RT-LAMP
在上述PCR管內進行RT-LAMP，反應體系30 μ L
2xBst DNA polymerase Buffer15 μL10 U/ AMV RTase (Initrogen )1 μL40 U RNase Inhibitor1 μL8 υ/μ Bst DNA polymerase1 μL0.1 μΜ3'端引物及LAMP四條引物各1 μ DEPC處理的超純無菌水7 μLRT-LAMP反應條件50°C溫育30min ；60°C溫育40min，降至常溫。5.肉眼觀察或濁度儀檢測肉眼觀察反應液是否變渾濁，與陰性樣品比較有明顯渾濁的反應液即為陽性樣品，反之則為陰性；濁度儀在400nm波長下檢測沉淀濁度，濁度升高的為陽性，濁度與陰性對照沒有明顯變化的為陰性樣品.6.電泳檢測RT-LAMP反應結束后取5 μ L反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，在0. 5 X TBE緩沖液中，80V穩壓電泳1. 5h，然后用凝膠成像系統觀察并記錄結果，有明顯條帶狀電泳痕跡的即為陽性樣品，反之則為陰性。序列表
<110>云南省煙草公司昭通市公司，云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南省煙草農業科學研究院<120> 一種快速馬鈴薯Y病毒煙草分離物的檢測方法
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<212>DNA
<213>人工序列
<222>(1). . (30)
<400>1
ccaagcttca tgttcttsac tccaagtara
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<212>DNA
<213>人工序列
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權利要求
1. 一種快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物的方法，包括以下步驟1)在PCR管內利用馬鈴薯Y病毒煙草分離物特異性抗體誘捕病株樣品中的馬鈴薯Y病2)高溫變性獲得病毒RNA作為模板；3)利用上述RNA模板的馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因3'末端引物及四條特異反應引物進行一步法反轉錄環介導等溫擴增 Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP ；4)肉眼觀察或濁度儀在400nm波長下檢測沉淀濁度，判斷樣品中是否帶有病毒，或者通過瓊脂糖電泳觀察電泳條帶，判斷樣品中是否帶有病毒。
2.根據權利要求1所述的快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物的方法，其特征是進行一步法RT-LAMP的引物為馬鈴薯Y病毒云南分離物外殼蛋白基因內3'末端引物一條及LAMP 擴增引物四條。
3.根據權利要求1或2所述的快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物的方法，其特征是用于反轉錄反應的 3'端引物5' -CCA AGC TTC ATG TTC TTS ACT CCA AGT ARA-3'，用于LAMP反應的四條引物PVY-FIP 5' -CGT CCT TCT CCT TTT CTT TGT TGA ATT TTG MG GAT GCA AM CMGAG C-3'，PVY-BIP 5 ‘ -ATC TGG AAC TCA TAC TGT GCC ACT TTT TCA GTA CAG TTG CACCCT-3‘，PVY-F3 5' -AAT CGA TGC AGG AGG AAG-3‘，PVY-B3 5' -AGC ATA CTC GAG TAA ATG TTC T—3'。
全文摘要
本發明提供了一種快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物的方法，其步驟包括通過馬鈴薯Y病毒煙草分離物特異性抗體誘捕病株樣品中的馬鈴薯Y病毒、高溫變性獲得病毒RNA作為模板、利用馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因3′末端引物及四條特異反應引物進行一步法反轉錄環介導等溫擴增(Reverse-transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification，RT-LAMP)法擴增，肉眼觀察或濁度儀在400nm波長下檢測沉淀濁度或電泳條帶觀察，判斷樣品中是否帶有病毒。該方法將快速、特異和高靈敏度的病毒免疫捕捉與快捷的RT-LAMP法結合，從而快速、簡便的檢測煙草樣品中的馬鈴薯Y病毒。
文檔編號C12Q1/70GK102352418SQ20111035085
公開日2012年2月15日 申請日期2011年11月9日 優先權日2011年11月9日
發明者丁銘, 付修廷, 倪霞, 卯志勇, 張仲凱, 張磊, 游堂貴, 秦西云, 趙聲春, 陸文林, 黃韡 申請人:云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所, 云南省煙草公司昭通市公司, 云南省煙草農業科學研究院