專利名稱：一種多重pcr快速檢測致病性嗜水氣單胞菌的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種快速檢測致病性嗜水氣單胞菌的分子生物學方法，本發明還涉及該方法在水產動物嗜水氣單胞菌疾病診斷上的應用。
背景技術：
隨著水產動物集約化養殖規模的不斷擴大，其病害發生日益頻繁，嚴重制約了水產養殖業的健康發展。水產動物疾病病原眾多，用傳統的微生物分離培養再做鑒定已經不能滿足水產動物病害防治的需要。因此，建立快速、準確、靈敏的病原檢測方法是及時控制和預防疾病發生的前提。傳統的微生物學檢測方法，費時費力，一般需要5-7d，另外免疫學方法如ELISA等則需要制備血清，并且其靈敏度相對較低，特異性差，難以推廣。自從PCR 技術建立以來，其靈敏度高、特異性強、操作簡便快速等優點，使得該技術在疾病診斷中得以廣泛應用。單一 PCR盡擴增一個基因，不能準確確定某一病原菌的特性，多重PCR則增加了其準確性。

發明內容
本發明的目的是針對上述技術問題提供一種多重PCR檢測致病性嗜水氣單胞菌的方法。本發明的另一個目的是將上述建立的方法在水產動物疾病診斷中的應用。本發明的目的是通過下列技術方案實現的 1、DNA模板的制備
①取具有嗜水氣單胞菌感染自然發病的水產動物并在組織、心、肝、血液等，勻漿，取 1. 0ml, IOOOOg離心IOmin,沉淀用蒸餾水懸浮，再IOOOOg離心lOmin，將沉淀懸浮于Iml的蒸餾水中，沸水煮8-10min，IOOOOg離心IOmin,上清液即為DNA模板。②取健康相同水生動物的①中相同組織按上述方法制的的DNA模板為陰性模板。2、多重 PCR 三對引物分別為A :Aero, B: 16S rDNA, C: QS
rr-ER^丨’Γιhryl ,", IcvJ^i"I·:■ ‘ !了了.: · Tfi T"................................................................. itii^ cm: κ; .:-711 -:,',tSniKU ytz-i'mi'1 * !/ ΛΑ --ITTv.N Ti-d]':、J TA- V < T.-v-yyrCihA^AA } ^CA V. ‘ΠΛ ■ "m'v.vr^F η γγτ:'λοτ :: π -廣.....................................................................
3、多重PCR反應體系為
IOXPCR buffer2. 5 μ L (已加 Mg2+，終濃度為 1. 5mmol/L)
dNTP mixture2 μ L (終濃度為 0. 25mmol/L)
引物上下游各2 μ L (終濃度0. 5 μ mol/L)
DNA模板1 μ L
Ex Taq1 μ LddH2014.51 μ L
總體積251 μ L
4、多重 PCR 反應條件 94°C 5min ；65°C Imin ；72°C 2min，30 個循環，72 延遲 lOmin。5、取10 μ L多重PCR反應產物，按常規DNA瓊脂糖凝膠電泳方法檢測，凝膠濃度為
0.8-1^%。在凝膠成像系統中照相，如出現圖1的條帶則致病菌為嗜水氣單胞菌。為盡量避免多重PCR檢測嗜水氣單胞菌帶來的假陽性，將3對引物同時在一個PCR 體系中進行擴增，構成多重PCR檢測法。三對引物分別是根據嗜水氣單胞菌的16Sr DNA保守序列基因、溶血素基因和群體感應信號分子基因設計的，對致病性嗜水氣單胞菌有較強的特異性。與普通PCR檢測方法相比，本發明采用多重PCR有更高的特異性和準確性；與免疫學方法ELISA檢測方法相比，多重PCR省事省力，檢測時間短、實驗條件相對要求低。


圖1是運用多重PCR檢測致病性嗜水氣單胞菌電泳結果圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。實施例1
1、無菌操作取具有嗜水氣單胞菌(A hydrophila)(具體操作和鑒定參照Chopra Α. K. , Houston C. W. , Peterson J. W. & Jin G. -F. (1993) Cloning, expression, and sequence analysis of a cytolytic enterotoxin gene from Aeromonas hydrophila. Canadian Journal of Microbiology 39，513 - 523.，菌種鑒定人為)感染典型臨床癥狀的異育銀鯽(fera^im auratus #力Wio)潰爛的肌肉組織10g，用勻漿器勻漿。取勻漿液Ig裝入1. 5ml離心管中IOOOOg離心lOmin，棄上清，沉淀用蒸餾水重懸，再IOOOOg離心 ΙΟπ η,ΜΛ Iml蒸餾水重懸，蓋上離心管，放入沸水中煮沸lOmin, IOOOOg離心IOmin,將上清轉移至一新無菌離心管中，作為多重PCR的DNA模板。2、DNA模板的制備
①取具有嗜水氣單胞菌感染自然發病的水產動物并在組織、心、肝、血液等，勻漿，取
1.0ml, IOOOOg離心IOmin,沉淀用蒸餾水懸浮，再IOOOOg離心lOmin，將沉淀懸浮于Iml的蒸餾水中，沸水煮8-10min，IOOOOg離心IOmin,上清液即為DNA模板。②取健康相同水生動物的①中相同組織按上述方法制的的DNA模板為陰性模板。3、多重 PCR 三對引物分別為A :Aero, B: 16S rDNA, C: QS
權利要求
1. 一種應用多重PCR快速檢測致病性嗜水氣單胞菌的方法，其特征按一下步驟 DNA模板的制備①取具有嗜水氣單胞菌感染自然發病的水產動物病灶組織、心、肝、血液等，勻漿，取 1. 0ml, IOOOOg離心IOmin,沉淀用蒸餾水懸浮，再IOOOOg離心lOmin，將沉淀懸浮于Iml的蒸餾水中，沸水煮8-lOmin，IOOOOg離心lOmin，上清液即為DNA模板；②取健康相同水生動物的心、肝、血液等，勻漿，取1.0ml, IOOOOg離心lOmin，沉淀用蒸餾水懸浮，再IOOOOg離心lOmin，將沉淀懸浮于Iml的蒸餾水中，沸水煮8_10min，IOOOOg離心lOmin，上清液即為DNA陰性模板；多重 PCR 三對引物分別為A :Aerol、Aero2, B: 16S rDNAl、16S rDNAl、，C: QS1、QS2ifmtn/' Γ,Ail :-]5' CKAO^C^IBCOA CCOACT-! ·.' ^rCTCCAO CCICACC CCl 1 ■ Γm^MiMf: -Ci wVbI'O FT A Ti j "" C TtkA TA C· .1TA -.!- 5 Cb L-.Ι- 'Jj Gl ^AL AAALO - J :QSLr. ICA ^ato-tcp χλ gi g rr yI船Οβ25 a TGTCAA "GCA GG TC-I.多重PCR反應體系為IOXPCR buffer2. 5 μ L (已加 Mg2+，終濃度為 1. 5mmol/L)dNTP mixture2 μ L (終濃度為 0. 25mmol/L)引物上下游各2 μ L (終濃度0. 5 μ mol/L)DNA模板1 μ LEx Taq1 μ LddH2014.51 μ L總體積251 μ L多重 PCR 反應條件 94°C 5min ；65°C Imin ；72°C 2min，30 個循環，72 延遲 IOmin ； 取10 μ L多重PCR反應產物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為0. 8-1. 1。
全文摘要
一種應用多重PCR快速檢測致病性嗜水氣單胞菌的方法。利用嗜水氣單胞菌16rDNA基因保守區序列、外毒素基因以及群體感應信號基因序列設計三對引物，建立多重PCR的快速檢測方法。該方法特異性高，操作方便，檢測成本低，時間短，能同時檢測大批量樣品，可以標準化為產品，可以滿足檢驗檢疫部門大批量檢測水產動物致病性嗜水氣單胞菌的需要。
文檔編號C12Q1/04GK102337349SQ20111035125
公開日2012年2月1日 申請日期2011年11月9日 優先權日2011年11月9日
發明者侯玉峰, 儲衛華, 姜焱, 張常印, 朱衛, 王凱民, 陳雷 申請人:中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局, 中國藥科大學