專利名稱：改造的mvip3Aa11基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物防治技術領域，特別是涉及對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因組合、人工合成的序列及其應用。
背景技術：
蟲害是造成農業(yè)生產損失的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計，蟲害每年給農業(yè)生產造成的直接經(jīng)濟損失高達15%?；瘜W殺蟲劑曾對蟲害防治、穩(wěn)定農業(yè)生產做出過重要貢獻。隨著人們對化學殺蟲劑環(huán)境危害的認識、環(huán)保意識的日益加強，為了實現(xiàn)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展，全球都在積極探索新的害蟲防治途徑。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種廣泛分布于土壤中的革蘭氏陽性細菌，它在芽胞形成期產生的殺蟲晶體蛋白ansecticidal Crystal Proteins, I CPs)是Bt殺蟲的主要活性成分，ICPs通過作用于昆蟲中腸而導致昆蟲死亡(Hofte H. Microbiology Review,1989, 53 :242-255 ；Agaisse H. Journal of Bacteriol. ,1995, 177，6027-6032)。由于 ICPs 對鱗翅目(I^pidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目 (Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)等多種重要的農林業(yè)害蟲均具有毒殺作用，目前Bt已經(jīng)成為研究最為深入、應用最廣的殺蟲微生物(Schn印f N. Microbiol and Molecular Biology，1998，62 (3) :775 806)。而轉Bt殺蟲晶體蛋白基因抗蟲植物成功商業(yè)化已經(jīng)有 12年，獲得了巨大的社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益(Clive James, ISAAA 2008, Briefs 39，Global Status of Commercialized Biotech/GM Crop)。但是，在實際應用中，第一代轉基因作物如抗蟲棉、抗蟲玉米等，由于單一的使用cryl類基因(crylAb，cryIAc)，害蟲在田間對cryIA基因的抗性頻率和抗性風險隨著產業(yè)化的面積和時間增加而呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(李國平，中國農業(yè)大學博士學位論文， 2006)。因此，尋找與Cryl類(CrylAb，CrylAc)具有不同受體的殺蟲蛋白和殺蟲蛋白的組合，對克服和延緩害蟲抗性產生具有極其重要的理論意義和實用價值。Cry2A類的蛋白是一類殺蟲譜較廣的殺蟲蛋白，對鱗翅目、雙翅目具有較好的殺蟲活性，李長友等研究發(fā)現(xiàn)Cry2Ab4毒素對重要的農業(yè)害蟲-棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、大豆食心蟲(Leguminivora glycinivorella)具有高毒力，同時對水禾S二化螟(Chilo suppressalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)也有很好的防效(李長友等，生物工程學報，2007,23 ) :634-638)。Liang和Dean(1994，引用信息補充完整)通過蛋白與BBMV結合實驗表明Cry2A類蛋白與CrylA類蛋白具有不同的結合位點，即這兩類蛋白在與害蟲的中腸結合上沒有競爭，害蟲對這兩種蛋白不容易產生交互抗性(Liang et al. Molecular Microbiology, 1994,13(4) :569 575)。這一研究結果很快就體現(xiàn)在 Monsanto 公司的第 2 代抗蟲棉中(Perlak FJ, Plant Tournal. 2001 ；27 (6) :489-501 Adamczyk JJ, T Econ Entomol. 2001,94(6) :1589-1593)。1996 年和 1998 年 Estruch (Estruch JJ, Proc Natl Acad Sci U S A. 1996， 93(11) :5389 5394)禾口Warren(Warren Gff,World Intellectual Property Organization Patent WO 1998/5,849 870)等人分別從 B. thuringiensis 菌株 AB88 和 B. cereus 菌株 AB78的上清液中發(fā)現(xiàn)了在營養(yǎng)期分泌的新型殺蟲毒蛋白，即營養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins, VIPs) VIPs 主要分為 VIP1、VIP2 和 VIP3 三種。目前，Bt 蛋白命名委員會提出按照Bt Cry毒蛋白的分類命名方法(Crickmore Neil, http //www, lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/vip. html),將所有的 Vip 蛋白和類 Vio 毒素蛋白分為三個種，八個亞種。Vip3A對鱗翅目昆蟲，如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、 甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、煙芽夜蛾(Heliothis virescens)等具有廣泛的殺蟲活性(Estruch JJ, Proc Natl Acad Sci U S A. 1996，93 (11) :5389 5394)，對小地老虎 (Agrotis ypsilon)的毒個生比 CrylAc 高 260 倍(Estruch JJ, et al. World Intellectual Property Organization Patent WO 2000/6 :107 279)。Donovan 等人的研究發(fā)現(xiàn)表明Vip3A蛋白不但是對甜菜夜蛾殺蟲活性的重要組成部分，而且與Cryl類蛋白有協(xié)同增效作用，能提高蘇云金芽胞桿菌的殺蟲效果(Donovan WP, J Invertebr Pathol. 2001, 78(1) :45-51) ο VIPs的殺蟲作用機理不同與已知的Cry蛋白(Yu, Appl. and Environ. Microbiol. 1997,63(2) :532 536)。進一步的研究表明，Vip3A與Cryl類蛋白在部分重要的鱗翅目的農業(yè)害蟲中的受體不同，顯示Vip3A具有不同于晶體蛋白的殺蟲模式(Lee， Appl. and Environ. Microbiol. 2003,69(8) :4648-4657)。隨著抗蟲棉等轉基因植物的產業(yè)化，害蟲在田間產生抗性的風險不斷增加，2003 年和2005年，Zhao JZ等人分別發(fā)表文章指出基因疊加(Gene stacking and pyramided) 策略是克服和延緩害蟲對轉基因抗蟲植物產生抗性的有效手段(Zhao JZ, et al. Nature Biotechnology,2003,21 (12) :1493-1497 ；Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2005, 102(24) 8426-8430)。隨后Monsanto公司研制出CrylAc與Cry2Ab2組合的抗蟲棉Bollgard II，Syngenta 公司推出了 Vip3A 與 CrylAb 組合的抗蟲棉(Kurtz Rff, J Invertebr Pathol. 2007,95(3) :227-230)。1987年，國際上開始研究構建轉Bt殺蟲基因植物，Vaeck等(Vaeck et al.， Nature，1987，328 :33-37)、Barton 等(Barton et al. , Plant Physiol, 1987 85: 1103-1109)、Fischoff 等(Fischoff et al.，Bio/Tehnology, 1987,5 :807-813)分別獲得了轉Bt殺蟲基因植物。但這些早期獲得的的轉Bt基因植株的抗蟲性都很弱，難以檢測出 mRNA的轉錄，蛋白質表達量很低。造成Bt基因在植物中表達量低的原因有許多例如，1.野生Bt基因中富含AZ序列，在植物中表達的mRNA不穩(wěn)定；2.野生Bt基因中可能存在真核基因的內含子切割位點、轉錄終止信號序列，造成轉錄本不完整或轉錄本的異常加工；3、微生物與植物在翻譯中對密碼子的使用頻率上有很大差異，使翻譯效率降低；4、真核基因的 5’ -UTR序列與原核基因有很大的不同，以及真核基因的3’端需要加尾識別信號序列。因此，要使得Bt基因在轉基因植物中高效表達，必須對野生Bt基因進行有效的改造。1990年Adang等根據(jù)雙子葉植物基因特點，改造了原始cry基因的CG/AT比例、 密碼子使用頻率，刪除所有認為可能影響B(tài)t基因在植物中表達的AATGAA等序列，合成了一個新Bt殺蟲基因新基因與原基因的相似性為85%，C+G含量提高到正常植物基因的水平( 45%)。經(jīng)過改造后，cry基因在植物中的表達量大幅度提高(Adang et al,EP0359472 1990)。1991年，Perlak等人對cryIAb基因進行的改造和人工合成，也獲得了 cry基因在植物中表達量有了較大的提高(Perlak et al.，PNAS USA, 1991,88 =3324-3328)

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種vip3Aall和Cry2Ab4的基因組合，其對鱗翅目害蟲的殺滅具有增效作用。同時為適應轉基因植物的需要，本發(fā)明還提供有改造的mvip3Aall和mcry2Ab4基因。改造的mcry2Ab4基因，編碼具有SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。含有改造的mcry2Ab4基因的重組質粒。上述重組質粒為pET_2Ab4。上述重組質粒為pCAMIA_S2AbN。重組質粒在轉基因植物或微生物中的應用，使其獲得抗蟲特性。改造的mvip3Aall基因，編碼具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。含有改造的mvip3Aall基因的重組質粒。上述重組質粒為pET_vip3Aal 1。重組質粒pET-vip3Aall在轉基因微生物中的應用，使其表達抗蟲蛋白的特性。一種重組質粒，含有表達Cry2Ab4蛋白的基因和表達Vip3Aall蛋白的基因。所述重組質粒中含有mvip3Aall基因和mcry2Ab4基因。所述重組質粒為pCS2AbVIP3N。Cry2Ab4蛋白與Vip3Aall蛋白組合在抗鱗翅目害蟲中的應用。所述應用是將Cry2Ab4蛋白與Vip3Aall蛋白制成殺蟲劑殺滅鱗翅目害蟲。所述應用是將表達Cry2Ab4蛋白的基因和表達Vip3Aall蛋白的基因轉入同一植物或微生物中，使其表現(xiàn)抗鱗翅目害蟲的特性。所述表達Vip3Aall蛋白的基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 5 ；所述表達Cry2Ab4 蛋白的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0. 6。所述表達Cry2Ab4蛋白的基因為改造基因mcry2Ab4，所述表達Vip3Aal 1蛋白的基因為改造基因mvip3Aall。所述應用是將改造基因mcry2Ab4轉入一植物中，將改造基因mvip3Aall轉入另一植物中，兩種植物雜交，得到轉有改造基因mcry2Ab4和改造基因mvip3Aall的雜交植物。所述應用是將含有改造基因mcry2Ab4和改造基因mvip3Aall的質粒轉入同一植物中。所述質粒為pCS2AbVIP3N。我們實驗室分別克隆了 vip3Aall基因(高技術通訊，2004，第9期，39_42)和 cry2Ab4基因(生物工程學報，2007，23卷4期，634-638)，發(fā)現(xiàn)了兩者組合對鱗翅目害蟲的增效作用，特別是對棉鈴蟲抗CrylAc種群等害蟲具有良好的防效。
分析比對棉花等植物偏愛的密碼子，在保持原Vip3Aall和Cry2Ab4殺蟲蛋白的氨基酸組成不變的情況下，用棉花等植物基因偏愛的密碼子替換vip3Aall和cry2Ab4基因對應的不穩(wěn)定密碼子，通過替換獲得優(yōu)化密碼子，完成vip3Aall和cry2Ab4基因DNA序列優(yōu)化改造得到新的mvip3Aall和mcry2Ab4優(yōu)化基因。在大腸桿菌中表達新的mvip3Aal 1和mcry2Ab4優(yōu)化基因，進行Vip3Aal 1和 Cry2Ab4蛋白純化，對這兩種蛋白分別進行單獨、以及組合殺蟲活性測定，通過計算LC5tl和兩種蛋白的協(xié)同增效系數(shù)，明確優(yōu)化基因的功能。構建用于轉化棉花的植物表達載體，一個植物表達盒包括組成型表達啟動子 CaMV35S(來源于花椰菜花葉病毒基因啟動子，是一段DNA序列，可以驅動所連接的基因片段進行轉錄，進而翻譯成蛋白質，組成型表達的啟動子可以調控基因在生長發(fā)育的任何階段和任何組織都有表達)、改造的cry2Ab4基因、NOS終止子(來源于花椰菜花葉病毒 Nopaline (NOS)基因的終止子，一段DNA序列，含有基因表達的終止信號)，另一個植物表達盒包括組成型表達啟動子CaMV35S、改造的vip3Aall基因、NOS終止子?？梢詫蓚€表達盒分別構建兩個植物表達載體，由獲得的單價轉化植株通過雜交方法獲得轉雙基因棉花；也可以將兩個表達盒置于同一個植物表達載體中，轉化棉花，獲得雙價轉基因棉花(本發(fā)明實施例采用后一種方法)。取兩管200 μ 1農桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞，分別加入1 μ g質粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37°C恢復培養(yǎng)5分鐘，加入Iml YEB液體培養(yǎng)基，慢速振蕩(< IOOrpm) 4小時，1，OOOrpm離心30秒種，棄上清，加入100 μ 1 YEB液體培養(yǎng)基重懸細胞，涂布于含有卡那霉素100μ g/ml和鏈霉素125μ g/ml的YEB培養(yǎng)基的平板上，28°C培養(yǎng)48小時。將YEB抗性培養(yǎng)基平板上的克隆，搖菌，提取質粒，應用PCR方法檢測陽性克隆。將含有mCry2Ab4基因和mvip3Aall基因質粒的農桿菌克隆接種于含有卡那霉素和利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，
振蕩培養(yǎng)至0D_為0. 8-1. 0，1/50接種于MS鹽(pH7. 0)中；切取棉花幼苗下胚軸作為轉化外植體，將下胚軸浸于農桿菌菌液5-10分鐘；取出棉花下胚軸，用滅菌濾紙吸干菌液， 放置到鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基中，28°C共培養(yǎng)48h，將轉化外植體轉移至愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約2周后，將在誘導培養(yǎng)基上產生愈傷組織，待愈傷組織長到直徑約2cm時，分別切取下胚軸切斷兩端產生的愈傷組織，轉到分化培養(yǎng)基上進行繼代和誘導分化，15-20d繼代一次直到成苗為止。選取七葉期轉基因棉花的第二、第三、第四片葉子作為生測對象。將脫脂棉球把葉柄包裹，置于放有滅過菌濾紙的平皿中，并滴加dd H20 500 μ 1于棉球上，初孵棉鈴蟲11頭接于每片葉片上；將平皿放于鋪有濕紗布的筐中，并將四周蓋上濕紗布，置于培養(yǎng)室中；三天后觀察結果。實驗結果表明，在植物中轉入mvip3Aall和mcry2Ab4 基因，使其表達蘇云金芽孢桿菌Vip3Aall、Cry2Ab4蛋白，獲得對害蟲具有高毒力的新型轉基因植株。Vip3Aall、Cry2Ab4兩種蛋白對害蟲的抗蟲性比單獨表達Vip3Aall或Cry2Ab4 蛋白的殺蟲作用強，具有顯著的協(xié)同增效作用。具有這樣的基因組合的植物不僅對普通鱗翅目害蟲有良好的毒殺防治效果，更為重要的是它對抗性害蟲(抗CrylA毒素的害蟲品系) 具有同樣強的毒殺作用，與CrylA類蛋白沒有交互抗性，能有效防止和毒殺對抗性害蟲品系(抗CrylA毒素的害蟲品系)，從而能有效克服和延緩害蟲抗性的產生。這是第一代轉基因抗蟲植物所無法比擬的優(yōu)勢。本發(fā)明涉及對鱗翅目害蟲高毒力的Bt cry2Ab4基因和vip3All基因組合。通過對Bt cry2Ab4基因和vip3Aall基因的人工改造，并將兩個基因組合使其更適于在植物中表達，將兩個基因構建植物表達載體，轉化農作物。雙價基因的使用，具有顯著的增效作用， 而且同時對CrylA等抗性害蟲具有很強毒殺作用，可以極大地提高農作物抗鱗翅目害蟲的能力，并且將有效地克服或延緩害蟲對轉基因植物抗藥性的產生。


圖1重組表達質粒pET_2Ab限制酶切分析其中，M:lkbDNA Ladder (12216，11198，10180，9162，8144，7126，6108，5090， 4072，3054，2036，1636，1018，517，506 bps)，1 :L2Ab5/L2Ab3 amplified product，2: pET-m2Ab/BamHI+/EcoRI，3 :pET_21b/BamHI+EcoRI ；圖2 mcry2Ab4在大腸桿菌中表達產物的SDS-PAGE檢測其中，M.高分子量標準蛋白(212，116，97，66，40kDa)，l.B-Pr-88(陽性對照)， 2. Cry2Ab4(-pET_m2Ab4)，3. BL21(pET_21b)；圖3重組表達質粒pET_Vip3Aall的酶切與PCR擴增鑒定其中，1 X/Ecol30 I marker ；2 :pET_m Vip3A/BamH I and Sal I ；3 :PCR product of vip3A gene ；圖4 mvip3Aall在大腸桿菌中表達產物的SDS-PAGE檢測其中，1:蛋白Marker (212,116,97,66,40kDa), 2 :Vip3Aall (pET-mvip3Aall) 3 CK(BL21)圖5 Vip3Aal 1蛋白的親和層析純化結果其中，1蛋白 Marker (212,116，97，66，40kDa)，2 純化后 Vip3Aall (pET-mvip3Aall)蛋白，3 純化前 Vip3Aall (pET_mvip3Aall) 蛋白圖6雙價基因表達載體pCS2AbVIP3N質粒構建7轉雙價基因棉花對棉鈴蟲的抗蟲性檢測結果其中，左圖為轉基因棉花葉片；右圖為非轉基因棉花葉片
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施例1 設計合成新的vip3Aall和cry2Ab4基因(DNA)序列及其制備方法。(1)找出棉花等植物偏愛的密碼子，在保持原Vip3Aall和Cry2Ab4殺蟲蛋白的氨基酸組成不變的情況下，用植物基因偏愛的密碼子替換vip3Aall和cry2Ab4基因對應的密碼子，初步獲得改造的DNA序列。(2)排除DNA序列中存在的造成植物基因轉錄本不穩(wěn)定的富含AT序列以及常用限制性內切酶位點，然后通過置換密碼子的方法進行改正消除。(3)利用計算機軟件(DNAman)分析，通過置換密碼子的方法排除基因內存在大的反向重復序列。(4)在序列兩端加上進一步克隆需要的限制性內切酶識別位點序列。(5)確定mvip3Aall基因如序列表SEQ ID NO 1所示的編碼序列。
(6)確定mcry2Ab4基因如序列表SEQ ID NO 3所示的編碼序列。(7)化學合成如序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示的序列。A.分析vip3Aal 1和cry2Ab4基因的原始核苷酸編碼序列，從中可以發(fā)現(xiàn)， vip3AalU cry2Ab4基因與植物基因在密碼子的使用上有較大差異，主要表現(xiàn)在vip3Aall 或cry2Ab4基因對第三位搖擺堿基為A或T的密碼子有偏愛性，而植物基因密碼子的第三位搖擺堿基偏愛使用G或C。依據(jù)分析結果，采用植物基因的偏愛性密碼子置換原始vip3Aall和cry2Ab4的對應密碼子，消除vip3Aall和cry2Ab4基因中ATTTA、AATGAA等富含AT序列和不明確的內含子序列，以及排除基因中存在的大的反向重復序列和常用限制性內切酶識別位點序列；在得到的序列兩端加上構建植物表達載體需要的限制性內切酶識別的序列，設計出目標合成的 mvip3Aall(SEQ ID NO. 1)和 mcry2Ab4(SEQ ID NO. 3)。B.對合成新的vip3Aall和cry2Ab4基因與原始基因的比較密碼子的使用情況的比較利用計算機分析軟件分別分析計算出vip3Aall與mvip3Aall的密碼子使用情況， 并進行比較，結果顯示新設計合成的mvip3Aall的密碼子使用情況與植物基因的頻率相似 (結果見表1)，有利于新基因在植物中的表達。表1 vip3Aall與mvip3Aall的密碼子使用情況與植物基因密碼子使用頻率比較
Aacodon普通植物(％)vip3Aall (%)mvip3Aall (%)TTA8560TTG221127LeuCTT241319CTC22541CTA8120CTG15414ATT407844IleATC441256MetATA16100ATG100100100
8
權利要求
1.改造的mvip3Aall基因，編碼具有SEQID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白，其核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示。
2.含有權利要求1所述的改造的mvip3Aall基因的重組質粒。
3.權利要求2所述的重組質粒為pET-vip3Aall，所述骨架載體為pET_21b。
4.權利要求2或3所述的重組質粒在轉基因微生物或植物中的應用，使其表達抗蟲蛋白的特性。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，所述微生物為大腸桿菌BL21。
6.根據(jù)權利要求4所述的應用，所述植物為棉花。
全文摘要
本發(fā)明涉及“改造的mvip3Aa11基因及其應用”，屬于生物防治技術領域。改造的mvip3Aa11基因，編碼具有SEQ NO2所示氨基酸序列的蛋白，其核苷酸序列如SEQ NO1所示。本發(fā)明通過調整vip2Aa11基因的核苷酸組成，使其接近植物基因的密碼子頻率而不改變編碼的氨基酸序列，并將改造基因組合得以在植物中表達，從而獲得對鱗翅目害蟲的抗性。
文檔編號C12R1/07GK102533791SQ20111039657
公開日2012年7月4日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權日2009年12月3日
發(fā)明者宋福平, 張 杰, 束長龍, 梁革梅, 郎志宏, 黃大昉 申請人:中國農業(yè)科學院植物保護研究所