專利名稱：一種從成體兔的成熟脂肪細胞誘導分化為心肌樣細胞的方法
技術領域：
本發明涉及細胞生物學去分化及誘導分化的技術領域，具體涉及利用成體兔的成熟脂肪細胞去分化為多能干細胞繼而再分化為心肌樣細胞的方法。
背景技術：
脂肪組織來源豐富，取材的方法安全便捷，可以作為一種實用的以及有前景的間充質細胞的來源。脂肪組織內含有非脂肪細胞被稱為間質血管化組分(stromal-vascular fraction (SVF))。脂肪組織通過機械分離或酶消化(后再經過熒光激活細胞分選術或細胞分選)的方法分離得到SVF.培養的SVF被命名為脂肪來源的間充質干細胞(ASCS/ADSC)。 體內外的研究表明人的ADSC細胞能夠分化成多種細胞系，如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、神經元細胞、內皮細胞和肝細胞(Schaffler and Buchler，2007，Concise review :Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells 25:818-827·)。但是 ADSC 細胞只占脂肪組織中極少量的部分并且培養的原代及最初幾代的ADSC細胞為異質性的細胞群，可能混雜有內皮細胞、平滑肌細胞和周細胞(pericytes)等。因此，仍然需要尋找一種來源明確并具有高純度的細胞系。成熟的脂肪細胞是脂肪組織中最為豐富的細胞類型。這些成熟的脂肪細胞在體外通過特殊的培養條件可獲得一群更原始，并有增殖性的細胞系，稱為去分化的脂肪細胞 (DFAT)。DFAT細胞可從白色脂肪組織(成熟的脂肪組織)中獲取。目前的研究表明，DFAT 細胞是一群同質性的細胞類型；DFAT細胞具有丟失脂肪特異性的標識分子，并獲得多能性的特性，通過一定的誘導培養方法可以分化為多種間質細胞系，具有成骨、成脂、成軟骨、成肌的能力。到目前為止，DFAT細胞已從人、大鼠、小鼠中獲取。但是培養的具體方法各異。 有研究表明白脂肪細胞與心血管細胞有密切的關系，以及脂肪細胞與內皮細胞有共同的前體細胞。并且，Medet Jumabay等用小鼠的DFAT培養出自發搏動的心肌樣細胞(Medet Jumabay,2009, Spontaneously beating cardiomyocytes derived from white mature adipocytes. Cardiovascular Research 85，17-27)0目前尚無文獻報道有關兔的DFAT細胞系的建立以及向心肌樣細胞的分化誘導。

發明內容
本發明的目的是從成體兔的成熟脂肪細胞培養兔的去分化的脂肪細胞(DFAT)，并誘導分化為心肌樣細胞。本發明技術方案的關鍵在于如何簡單的方法獲取兔的DFAT細胞并誘導成為心肌樣細胞。本發明選用的兔是常用的實驗動物，在心臟甚至是心的傳導束系統中是目前所研究的動物中最多的一種，也是最為典型的動物之一。并且，相對于小鼠來講，兔是一種較大的哺乳動物，與人的關系更為接近，用兔作為實驗對象，用其脂肪組織培養誘導出心肌樣細胞，將會是對人的心臟干細胞或者心臟組織工程治療方面提供有力的支持。
本發明提供了一種從成體兔的成熟脂肪細胞誘導分化為心肌樣細胞的方法，如圖 1所示，具體步驟如下
1、分離出成體兔的白色脂肪組織；
可取成體兔腹股溝處白色脂肪組織(或其他皮下脂肪組織)。將其用0. IM的PBS 沖洗，剪成糜狀；
2、獲得上層白色脂肪部分；
采用酶消化法(參照Ken Yagi DK, Yasushi Okazaki, Koichiro Kano A novel preadipocyte cell line established from mouse adult mature adipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications 2004 ；321 :967-974.)。用膠原酶I，37°C消化40-50min,消化充分；
消化過程也可放在37°C的搖床內。
3、采用天花板法培養后再常規培養；
由于的脂肪細胞富含高的脂質成分，培養時，會漂浮在培養基的頂層，這樣會使的成熟的脂肪細胞不能有效的接受營養物質和接受同樣的處理環境。1986年Sugihara H提出“天花板培養”的方法，就是利用了成熟脂肪細胞漂浮的性質使細胞附著在充滿培養基的培養板的上層(Sugihara H，Yonemitsu N，Miyabara S，Yun K. Primary cultures of unilocular fat cells !characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.Differentiation 1986 ；31 :42-49.)。Ken Yagi 在試 著使用天花板培養時發現大量的成熟脂肪細胞能夠去分化為成纖維樣細胞，并命名為 DFAT-Dl (ddY小鼠的脂肪細胞去分化而來)。
用20%完全培養基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)]中和膠原酶I并過濾；
也可選用5%的完全培養基[FBS (Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA公司)， 雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]。
收集過濾液 1000-1500rpm 離心 3_5min。
4、并用20%的完全培養基同時誘導。
取上層白色細胞層采用20%的完全培養基倒置培養至少七天后常規培養。七天后，脂肪細胞內的脂滴基本消失。但是有時七天后觀察一些細胞仍會存在脂滴，這種情況下，可以延長倒置培養的時間。
本發明還提供了根據上述方法從成體兔的成熟脂肪細胞誘導分化得到的心肌樣細胞。
近年來國內外研究從小鼠、大鼠、人上都已建立了 DFAT細胞，但兔的DFAT細胞建立并沒有相關的報道。本發明成功培養出的兔的DFAT細胞，相比較于之前在小鼠、大鼠、人的DFAT細胞的培養步驟和方法上更為得簡化與實用。首先本發明不需要特殊的培養基質， 本發明只是采用的實驗室常用的高糖培養基(DMEM，PAA公司)，普通的胎牛血清，以及常用的抗青-鏈霉素。其次本發明不需要繁瑣的實驗步驟，這在具體實施方式
中已有體現。另外，本發明是首次將兔的DFAT細胞誘導為心肌樣細胞。盡管2009年，Medet Jumabay等用小鼠的DFAT培養出自發搏動的心肌樣細胞。本發明人所在的研究小組一直重復前者的培養方法但并未得到成功。本發明的方法通過相應的改進得到了成功首先，前者有既定的步驟，各步驟的時間設置都是固定的，而本發明各步驟的時間是可以由浮動的。其次，前者的消化的過程中需要特定的搖床，本發明只是普通的消化，更具普遍性。再次，前者需用了兩性霉素等相關的培養基質，本發明沒有選用。采用本發明的培養誘導方法培養出的心肌樣細胞其相關的分子標識確是完全的表達。本發明的培養誘導方法簡便并且不需要特殊的材料及設備，可在實驗室中得到廣泛的應用。本發明用兔作為實驗對象，免與人的關系更為接近，用其脂肪組織培養誘導出心肌樣細胞，將會是對人的心臟干細胞或者心臟組織工程治療方面提供有力的支持。


圖1是脂肪組織內分離DFAT細胞誘導為心肌樣細胞流程模式2是兔的DFAT細胞培養相差顯微鏡其中A、DFAT細胞培養第三天(X200) ；B、DFAT細胞培養第七天(X100) ；C、DFAT 細胞培養第十天(X100) ；D、DFAT細胞培養傳一代(X100)。
具體實施例方式下面結合本發明的實施例和附圖對本發明的實施作詳細說明，以下實施例是在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1 一、兔去分化脂肪細胞的培養成年荷蘭大白兔(第二軍醫大學實驗動物中心，3kg左右)1、相對無菌的狀態下，取出成體兔腹股溝處白色脂肪組織；2、用0. IM的磷酸緩沖液(PBQ洗三遍后，將組織剪成糜狀；3、用等體積(與糜狀的組織塊等體積)的膠原酶I (Worthington公司)37°C消化 40min，期間適當的搖晃，以便消化均勻。消化過程也可放在37°C的搖床內。4、用20%完全培養基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]中和膠原酶的活性并且輔助過濾。為了節約可選用5%的完全培養基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA公司)，1 %雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]。收集濾液，IOOOrpm離心3分鐘.5、取上層白色脂肪層培養在12cm2的培養瓶中，用20%的完全培養基充滿培養瓶， 倒置培養在37°C，5% CO2的培養箱中。6、七天后，倒掉培養基，加入2-3ML的20%的完全培養基常規培養。(流程如圖1 所示)七天后，脂肪細胞內的脂滴基本消失。但是有時七天后觀察一些細胞仍會存在脂滴，這種情況下，可以延長倒置培養的時間。
開始培養時脂肪細胞呈圓形漂浮在最上層。在培養第3/4天，有些細胞貼附在培養瓶的上壁上生長。七天后絕大多數的細胞脂滴丟失，成長梭形細胞形態(如圖2所示)。二、DFAT細胞的鑒定取傳1代的DFAT細胞常規免疫細胞化學染色檢測Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表達(以上檢測的分子均為心肌細胞的標識分子)。結果表明 Sarcomeric Action、肌鈣蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成陽性的，HCN4弱陽性。表明20% 的完全培養基將DFAT細胞誘導為心肌樣細胞。實施例2 —、兔去分化脂肪細胞的培養成年荷蘭大白兔(第二軍醫大學實驗動物中心，3kg左右)1、相對無菌的狀態下，取出成體兔腹股溝處白色脂肪組織；2、用0. IM的磷酸緩沖液(PBQ洗三遍后，將組織剪成糜狀；3、用等體積(與糜狀的組織塊等體積)的膠原酶I (Worthington公司)37°C消化 45min，期間適當的搖晃，以便消化均勻。消化過程也可放在37°C的搖床內；4、用20%完全培養基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]中和膠原酶的活性并且輔助過濾。為了節約，可選用5%的完全培養基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM， PAA公司)，1 %雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]，收集濾液，IOOOrpm離心5分鐘；5、取上層白色脂肪層培養在12cm2的培養瓶中，用20%的完全培養基充滿培養瓶， 倒置培養在37°C，5% CO2的培養箱中；6、七天后，倒掉培養基，加入2-3ML的20%的完全培養基常規培養。(流程如圖1 所示)七天后，脂肪細胞內的脂滴基本消失。但是有時七天后觀察一些細胞仍會存在脂滴，這種情況下，可以延長倒置培養的時間。開始培養時脂肪細胞呈圓形漂浮在最上層。在培養第3/4天，有些細胞貼附在培養瓶的上壁上生長。七天后細胞內脂滴丟失，成長梭形生長。(如圖2所示)二、DFAT細胞的鑒定取21天的DFAT細胞常規免疫細胞化學染色檢測Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表達(以上檢測的分子均為心肌細胞的標識分子)。結果表明 Sarcomeric Action、肌鈣蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成陽性的，HCN4弱陽性，這與實施例 1結果是一致的。實施例3 —、兔去分化脂肪細胞的培養成年荷蘭大白兔(第二軍醫大學實驗動物中心，3kg左右)1、相對無菌的狀態下，取出成體兔腹股溝處白色脂肪組織；
2、用0. IM的磷酸緩沖液(PBQ洗三遍后，將組織剪成糜狀；
3、用等體積(與糜狀的組織塊等體積)的膠原酶I (Worthington公司)37°C消化50min，期間適當的搖晃，以便消化均勻。消化過程也可放在37°C的搖床內；
4、用20%完全培養基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]中和膠原酶的活性并且輔助過濾。
為了節約，可選用5%的完全培養基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA公司)，1 %雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]，收集濾液，1500rpm離心3分鐘；
5、取上層白色脂肪層培養在12cm2的培養瓶中，用20%的完全培養基充滿培養瓶， 倒置培養在37°C，5% CO2的培養箱中；
6、七天后，倒掉培養基，加入2-3ML的20%的完全培養基常規培養。(流程如圖1 所示)
七天后，脂肪細胞內的脂滴基本消失。但是有時七天后觀察一些細胞仍會存在脂滴，這種情況下，可以延長倒置培養的時間。
開始培養時脂肪細胞呈圓形漂浮在最上層。在培養第3/4天，有些細胞貼附在培養瓶的上壁上生長。七天后細胞內脂滴丟失，成長梭形生長。(如圖2所示)
二、DFAT細胞的鑒定
取21天的DFAT細胞常規免疫細胞化學染色檢測Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表達(以上檢測的分子均為心肌細胞的標識分子)。結果表明 Sarcomeric Action、肌鈣蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成陽性的，HCN4弱陽性，這與實施例 1結果是一致的。
實施例4
一、兔去分化脂肪細胞的培養
成年荷蘭大白兔(第二軍醫大學實驗動物中心，3kg左右)
1、相對無菌的狀態下，取出成體兔腹股溝處白色脂肪組織；
2、用0. IM的磷酸緩沖液(PBQ洗三遍后，將組織剪成糜狀；
3、用等體積(與糜狀的組織塊等體積)的膠原酶I (Worthington公司)37°C消化 45min，期間適當的搖晃，以便消化均勻。消化過程也可放在37°C的搖床內；
4、用20%完全培養基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]中和膠原酶的活性并且輔助過濾。
為了節約，可選用5%的完全培養基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養基(DMEM，PAA公司)，1 %雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]，收集濾液，IOOOrpm離心3分鐘；
5、離心后取上層部分洗1-2遍(純化作用)。每次離心1500rpm，1分鐘；
6、取上層白色脂肪層培養在12cm2的培養瓶中，用20%的完全培養基充滿培養瓶， 倒置培養在37°C，5% CO2的培養箱中；
7、七天后，倒掉培養基，加入2-3ML的20%的完全培養基常規培養。(流程如圖1所示)七天后，脂肪細胞內的脂滴基本消失。但是有時七天后觀察一些細胞仍會存在脂滴，這種情況下，可以延長倒置培養的時間。開始培養時脂肪細胞呈圓形漂浮在最上層。在培養第3/4天，有些細胞貼附在培養瓶的上壁上生長。七天后細胞內脂滴丟失，成長梭形生長。(如圖2所示)二、DFAT細胞的鑒定取21天的DFAT細胞常規免疫細胞化學染色檢測Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表達(以上檢測的分子均為心肌細胞的標識分子)。結果表明 Sarcomeric Action、肌鈣蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成陽性的，HCN4弱陽性，這與實施例 1結果是一致的。
權利要求
1.一種從成體兔的成熟脂肪細胞誘導分化為心肌樣細胞的方法，具體步驟如下A、分離出成體兔的白色脂肪組織；B、酶消化法獲得上層白色脂肪層部分；C、采用天花板法培養后再常規培養；用20%完全培養基或者5%的完全培養基，中和膠原酶I并過濾，收集過濾液 1000-1500rpm 離心 3_5min ；D、取上層白色細胞層采用20%的完全培養基倒置培養至少七天后常規培養； 所述的完全培養基配方為FBS、高糖培養基和抗青霉素-鏈霉素。
2.根據權利要求1所述的一種從成體兔的成熟脂肪細胞誘導分化為心肌樣細胞的方法，其特征在于分離出成體兔的白色脂肪組織后用0. IM的PBS沖洗，剪成糜狀。
3.根據權利要求1或2所述的一種從成體兔的成熟脂肪細胞誘導分化為心肌樣細胞的方法，其特征在于步驟B中，用膠原酶I，37°C的環境下消化40-50min。
4.一種如權利要求1、2或3的方法制備得到的從成體兔的成熟脂肪細胞誘導分化得到的心肌樣細胞。
全文摘要
本發明涉及細胞生物學去分化及誘導分化的技術領域。去分化的脂肪細胞(DFAT)可從白色脂肪組織中獲取，DFAT細胞通過一定的誘導培養方法可以分化為多種間質細胞系，具有成骨、成脂、成軟骨、成肌的能力。本發明的目的是從成體兔的成熟脂肪細胞培養兔的DFAT，并誘導分化為心肌樣細胞。本發明選用成體兔的白色脂肪組織，通過膠原酶I等體積消化，并采用20％完全培養基，天花板培養的方法使成熟的脂肪細胞去分化為DFAT細胞，并有心肌細胞的形態及標識分子的表達。本發明為組織工程提供了種子細胞，為基礎研究帶來便捷，為臨床應用帶來前景。
文檔編號C12N5/077GK102492653SQ201110404788
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者張傳森, 張喜, 李曉童 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學