專利名稱：鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌oxa-23 突變基因的熒光定量pcr 試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐藥基因的檢測試劑盒及方法。具體而言，本發(fā)明根據(jù)新篩選的 0XA-23基因突變的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌菌株，設(shè)計了檢測0XA-23突變的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌的熒光定量PCR試劑盒，本發(fā)明也涉及其檢測方法。
背景技術(shù)：
不動桿菌是ー類非發(fā)酵、嚴(yán)格需氧的革蘭陰性桿菌，普遍存在于自然界中。不動桿菌屬至少可分為32個基因種型，其中鮑曼不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌、不動桿菌基因種型3 及13TU通過常規(guī)表型鑒定難以區(qū)分，合稱為鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌復(fù)合體。鮑曼不動桿菌為不動桿菌屬中最常見的ー種革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界的水及土壌、醫(yī)院環(huán)境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為條件致病菌。該菌在醫(yī)院環(huán)境中分布很廣且可以長期存活，極易造成危重患者的感染，因此常從被感染患者的血、 尿、膿液及呼吸道分泌物等標(biāo)本中分離出，在非發(fā)酵菌中感染僅次于假單胞菌。鮑曼不動桿菌在醫(yī)院分布以I⑶病區(qū)最多，其次為呼吸內(nèi)科患者。感染的病人多是老年患者、危重疾病及機(jī)體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和長期使用廣譜抗生素治療的患者。又因為該菌對濕熱紫外線及化學(xué)消毒劑有較強(qiáng)抵抗力，常規(guī)消毒只能抑制其生長而不能殺滅，而抵抗力弱或有創(chuàng)傷的患者可能被從醫(yī)務(wù)人員的手或消毒不徹底的醫(yī)療器械所帯有的細(xì)菌感染的機(jī)會較多。近年來，不動桿菌屬在臨床樣本中的分離率逐年提高，而鮑曼不動桿菌約占其中的80% -90%。鮑曼不動桿菌可引起呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、尿路感染、敗血癥、創(chuàng)ロ感染及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等。由于鮑曼不動桿菌具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和獲得外源性耐藥基因的能力，因而極易造成醫(yī)院內(nèi)的播散流行。鮑曼不動桿菌可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等可移動基因元件，獲得對多種抗菌藥物的耐藥性。對I株歐洲克隆I多藥耐藥菌株的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，在一段長約86kb的染色體片段上聚集了 45個耐藥基因，包括VEB-I、AmpC、 多種氨基糖苷類抗菌藥物修飾酶，形成了被稱為AbaRl的耐藥基因島。該耐藥基因島與假單胞菌屬、沙門菌屬和大腸埃希菌的基因片段具有同源性，證實為獲得性外來序列。在另I 株歐洲克隆II的MDRAB (ACI⑶)的染色體中亦發(fā)耐藥基因島AbaR2。鮑曼不動桿菌整合外源性基因的能力，使其具有對臨床所用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的巨大潛力。在眾多的耐藥基因中內(nèi)酰胺酶基因是鮑曼不動桿菌最主要的耐藥基因，包括超廣譜￠-內(nèi)酰胺酶類(屬 A類，包括TEM-型、SHV-型、SM-型、PER-型等基因)、金屬酶類(屬B類，包括MP和VM 基因)、0XA型酶(屬D類)等。0XA-23型酶，水解青霉素和頭孢菌素、碳青霉烯，使菌株產(chǎn)生對亞胺培南類抗生素的耐藥性[Livermore DM, Woodford N. Carbapenemases a problem in waiting. Curr Opin Microbiol,2000,3(5) :489-495.]。多藥耐藥鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌的出現(xiàn)，給醫(yī)院感染控制及臨床治療帶來了極大的困難，由于感染的病人多是老年患者、危重疾病及機(jī)體抵抗力弱的患者，如不及時選擇鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌敏感的抗生素進(jìn)行治療，將會危及患者的生命安全。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明公開了鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌0XA-23突變基因的實時熒光定量PCR試劑盒及其方法。本發(fā)明首先公開了鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌0XA-23突變基因的實時熒光定量 PCR試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括特異性引物、特異性探針、標(biāo)準(zhǔn)DNA模板以及其他常規(guī)熒光定量PCR試劑。本發(fā)明的試劑盒可采用以下方法實施根據(jù)新篩選出的D類P -內(nèi)酰胺酶耐藥基因0XA-23的突變體的序列，所述突變體核苷酸序列為Sequence NO. 3,其所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為Sequence NO. 7。根據(jù) Sequence NO. 3設(shè)計探針和上、下游引物。所述的上游和下游引物的序列分別見Sequence NO. 4 和 Sequence NO. 5,所述的探針序列見 Sequence NO. 6?；蛘甙猩鲜鲂蛄械南?’端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85 %的序列。所述探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)色基團(tuán)FAM，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)BHQ。采用25 yl 反應(yīng)體積,姆個反應(yīng)中含12. 5 U I通用PCR反應(yīng)混合物[TaqMan Universal PCR Master Mix(2X)];上、下游引物各IOnM(上下引物序列分別為Sequence NO. 4和Sequence NO. 5)； 400nM探針(探針序列為Sequence NO. 6) ；2u I DNA模板；補(bǔ)無菌水至25^1。反應(yīng)條件為 950C IOmin 后，以 95°C 40s 和 60°C Imin 循環(huán) 45 次。本發(fā)明采用VITEK32細(xì)菌鑒定儀及GNS448藥敏板進(jìn)行藥敏試驗，檢測D類P -內(nèi)酰胺酶耐藥基因0XA-23的突變體菌株對抗生素的敏感性，結(jié)果顯示，所述突變體菌株對頭孢噻肟、丁胺卡拉、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酷、慶大霉素、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦耐藥，對頭孢哌酮/舒巴坦和左氧氟沙星較為敏感。本發(fā)明提供了檢測鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌0XA-23突變基因的實時熒光定量 PCR試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明所述的熒光定量PCR試劑盒可以用于0XA-23基因突變的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌菌株的檢測。


圖I.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒各濃度對應(yīng)循環(huán)參數(shù)(Ct值)。圖中曲線從左到又依次代表標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為 IO8Copies/ u 1> IO7Copies/ U 1> IO6Copies/ U 1> IO5Copies/ U 1> IO4Copies/ U I、 IO3Copies/ U I、IO2Copies/ U I 時的突光定量 PCR 曲線。圖2. 0XA-23突變基因與0XA-23基因序列比對圖。三角形所指的位點為突變位點。圖3. 0XA-23突變基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與0XA-23基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列比對圖。三角形所指的位點為突變位點。
具體實施例方式實施例I :鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌耐藥基因0XA-23新序列的確定
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I.菌株來源 從2009年10月至2011年5月我們收集了對抗生素高度耐藥(特別對亞胺培南耐藥)的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌32株。所述32株標(biāo)本來源于病人的痰液。2. 0XA-23引物設(shè)計本發(fā)明設(shè)計了ー對D類@ -內(nèi)酰胺酶耐藥基因0XA-23的特異性引物，所述引物的序列見SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。3.0XA-23基因的擴(kuò)增以上述32株鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌裂解液為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為(25ul體系):模板DNA (細(xì)菌裂解液)2ul，引物I和2各2ul，TaqE 0. 25ul (0. 5U)，IOXBuffer 2. 5ul, dNTP 2ul，用 ddH20 補(bǔ)足至 25ul。PCR 儀反應(yīng)條件如下預(yù)變性95°C5min循環(huán)(35個):變性94°C 30秒退火55で30秒延伸72°C 30 秒延伸72で5min4. 0XA-23基因擴(kuò)增產(chǎn)物回收將PCR產(chǎn)物做瓊脂糖電泳，在紫外燈下切下目的條帶，利用QIANGEN快速膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收的產(chǎn)物送上海生エ測定。5.測序結(jié)果與BLASTn比對，只發(fā)現(xiàn)其中I株編號為AB37的菌株0XA-23群陽性， 確定與0XA-23基因相似，其核苷酸序列見SEQ ID NO :3，蛋白質(zhì)序列見SEQ ID NO :7，所述核苷酸突變位點見圖2，所述核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)突變位點見圖3。實施例2 :檢測0XA-23新序列的實時熒光定量PCR試劑盒制備I.引物設(shè)計與探針合成根據(jù)上述實施例I得到的SEQ ID N0:3序列。采用ABI primer Express 2. 0軟件設(shè)計探針和引物(上?；倒竞铣?。上游引物序列見SEQ ID NO :4和下游引物序列見SEQ ID NO :5，探針序列見SEQ ID NO :6。所述探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)色基團(tuán)FAM，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)BHQ。2.標(biāo)準(zhǔn)DNA模板制備采用上一步所述的上下游引物對以上述的AB37的菌株為模板擴(kuò)增出200bp片段， PCR產(chǎn)物純化(QIAgen,German)并連接到PGM-T克隆載體后轉(zhuǎn)化到DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。特異引物篩選陽性克隆后提取質(zhì)粒DNA，此質(zhì)粒DNA即為標(biāo)準(zhǔn)DNA模板，為本領(lǐng)域研究人員根據(jù)設(shè)計的引物和所述模板通過分子學(xué)實驗可直接得到其序列信息，此處不再贅述。采用 NanoDrop ND-1000核酸定量儀定量質(zhì)粒DNA,使標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度范圍在IO8 102copies/ U I, 作為所述熒光定量試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品。3.熒光定量 PCR 反應(yīng)液10mmol/L 的 dNTP、25mmol/L 的 MgCl2。4.熒光定量 PCR IOxBuffer 500mM KClUOOmM Tris-HClU % Triton X-IOO05.陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品無菌雙蒸水。6.熒光定量PCR反應(yīng)條件熒光定量PCR儀為Line-Gene K (杭州博日，中國)，25微升反應(yīng)體系包括 12. 5u I 2 X TaqMan Universal PCR Master Mix (美國 ABI 公司)，上、下游引物各 IOnM(上下引物序列分別為Sequence NO. 4和Sequence NO. 5) ;400nM探針(探針序列為Sequence NO. 6)，2 ill DNA模板、加ddH20至25微升。反應(yīng)程序為95°C IOmin預(yù)變性，接45個循環(huán) 95°C 40s,60°C lmin。無菌水用于陰性對照。
實施例3體外檢測實驗I.靈敏性檢測將標(biāo)準(zhǔn)DNA模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，使標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度范圍在IO8 IO2Copies/ U I，作為熒光定量試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品。熒光定量PCR反應(yīng)條件，25微升反應(yīng)體系12. 5 ill 2 X TaqMan Universal PCR Master Mix (美國ABI公司)，上、下游引物各IOnM(上下引物序列分別為 Sequence NO. 4 和 Sequence NO. 5), 400nM探針(探針序列為 Sequence NO. 6), 2 U I梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板、加ddH20至25微升。反應(yīng)程序為95°C IOmin預(yù)變性，接45 個循環(huán)95°C 40s,60°C lmin。無菌水用于陰性對照。檢測結(jié)果見圖1，靈敏分析顯示最小能檢測到IOOcopies/反應(yīng)。本實驗批內(nèi)重復(fù)3 次，批間重復(fù)3次以分析其重復(fù)性。重復(fù)性結(jié)果顯示批內(nèi)CV%< 5%內(nèi)，批間CV%< 10%o 說明本試劑盒具有良好的重復(fù)性。2.特異性檢測I)陰性對照菌株肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、惡臭假單胞菌、 鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌，以上菌株均來自中國微生物菌株保藏管理委員會。2)陽性對照株為本室分離的0XA-23基因突變的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌4個克隆。3)PCR 反應(yīng)體系為12. I 2 X TaqMan Universal PCR Master Mix(美國 ABI 公司)，上、下游引物各IOnM(上下引物序列分別為Sequence NO. 4和Sequence NO. 5)，400nM 探針(探針序列為Sequence NO. 6), 2 U I各菌種DNA提取液和標(biāo)準(zhǔn)DNA質(zhì)粒、加ddH20至 25微升。反應(yīng)程序為95°C IOmin預(yù)變性，接45個循環(huán)95°C 40s,60°C lmin。特異性結(jié)果分析顯示，只有本室分離的0XA-23基因突變的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌的4個克隆為陽性，其它樣品均為陰性，所以本試劑盒檢測特異性達(dá)到100%。實施例3鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌耐藥基因0XA-23新突變體菌株的藥物敏感實驗本發(fā)明采用VITEK32細(xì)菌鑒定儀及GNS448藥敏板進(jìn)行藥敏試驗，檢測D類P -內(nèi)酰胺酶耐藥基因0XA-23的突變體菌株對抗生素的敏感性，用銅綠假單胞菌(ATCC 27853) 及大腸埃希菌(ATCC25922)作為藥敏質(zhì)控菌株，結(jié)果判斷按CLSI2000標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，結(jié)果如下
表
權(quán)利要求
1.ー種0XA-23突變蛋白，其序列如SEQ ID N0:7所示。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸，其特征在干其序列如SequenceNO. 3所示。
4.ー種檢測權(quán)利要求2或3的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌0XA-23突變基因的實時熒光定量PCR試劑盒，包括特異性引物和特異性探針，所述特異性引物包括上游引物和下游引物上游引物其序列為Sequence NO. 4，或者包含Sequence NO. 4序列的向5’端延長的序列；下游引物其序列為Sequence NO. 5,或者包含Sequence NO. 5序列的向5’端延長的序列；所述特異性探針其序列為Sequence NO. 6,或者包含Sequence NO. 6序列的向5’或3’ 端延長的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒可以用于含有0XA-23突變基因的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌引起的疾病早期抗菌藥物的選擇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的抗菌藥物優(yōu)選左氧氟沙星。
7.權(quán)利要求2或3所述的核苷酸在制備檢測0XA-23突變的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌菌株的試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌OXA-23突變基因的熒光定量PCR試劑盒及其方法。本發(fā)明根據(jù)新篩選出的鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌D類β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因OXA-23的突變體的序列設(shè)計了特異寡核苷酸引物和探針。本發(fā)明所述的熒光定量PCR試劑盒可以用于檢測鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌。
文檔編號C12N15/31GK102603875SQ201110442340
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者戚永孝, 梁勇, 王冬國, 王海寶 申請人:臺州市立醫(yī)院