專利名稱：一種牛白細胞介素32γ亞型的分子克隆/穩轉細胞系的建立及其方法
技術領域：
本發明屬于基因克隆領域，涉及ー種牛白細胞介素32 Y亞型的分子克隆/穩轉細胞系的建立及其方法。
背景技術：
白細胞介素32，原命名為細胞殺傷因子4型變體(NK4)。是Kim等在用基因芯片研究IL18高誘導表達因子吋，發現有一種高表達細胞因子樣基因，編碼炎癥性細胞因子， 因此命名為白細胞介素32。目前研究發現，人類IL-32基因定位于人染色體16pl3. 3上，含有8個外顯子，通過不同的可變剪切成6種構型，分別為α、β、Υ、δ、ε和ζ，其中Υ型在其N端有ー個疏水信號肽，可介導該蛋白跨膜表達。IL-32的6種構型都具有生物活性，其中以Y構型[Ji-Da Choi, Su-Young Bae, et al. Identificationof the most active interleukin-32isoform[J]. Inmmunology, 2008,126 :535-542]的生物活性最強,可能與其N端信號肽有一定關系。研究表明IL-32的主要作用是通過NF-K B [Kim SH, Han S Y，etal. Interleukin-32 A Cytokine and Inducer of TNF a [J],Immunity,2005,22 131-142]和P38-MAPK磷酸化途徑誘導TNF-a、IL-Ιβ、IL-6和趨化因子的產生。因為IL-32主要由IFN-Y誘導產生，且IL-32mRNA在免疫組織中的表達高于其它組織中的表達，這表明IL-32在固有性免疫中發揮作用[李莉，寶福凱.白介素-32及其與炎癥性疾病的關系研究進展[J].中國熱帶醫學，2010，10(6)]。固有性免疫是依賴于非特異性免疫細胞的病原體識別受體的免疫，具有代表性的病原體識別受體是Toll樣受體(Toll-likereceptors, TLRs)和核苷酸結合的寡聚化結構域蛋白(Nucleotidebinding oligomerization domainprotein, NOD),通過對病原體相關分子模式(Pathogen-associated moleculepatterns, PAMP,病原體表面的保守分子)的識別而發揮作用。IL-32協同NODl和N0D2配體，通過胱天蛋白酶-I依賴的信號通路激活IL-I β和IL-6。同時，由于IL-32誘導多種細胞因子的產生且與多種炎癥性疾病密切相關，掲示了IL-32在適應性免疫應答中也發揮作用，是ー種前炎癥反應細胞因子，它與疾病的嚴重性程度有夫，尤其是自身免疫性炎癥性疾病。自從2005年白細胞介素32基因被命名以來，對于其研究主要集中于人上。直至2010年10月，才有人克隆出了牛白介素32的beta構型[Jun Jaekal, Hyunjhung Jhun,et al.しloning and characterization οι bovineinterleukm-32 beta isform[J].Veterinary Immunology andlmmunopathology, 2010,137 :166-171]并且有研究猜測，小鼠中無此基因的存在。本發明通過分子克隆研究，克隆出牛白細胞介素32基因ga_a亞型，并對其功能進行驗證。

發明內容
本發明的目的在于提供一種牛白細胞介素32 Y亞型的分子克隆/穩轉細胞系的建立及其方法，牛IL-32Y基因(GenBank序列號為JQ327711，未經公布)的表達可以提高動物機體內其他相關免疫因子的表達，并進一歩提高動物免疫系統的免疫作用，且有文章報道該基因對抵抗結核桿菌有一定的效用，因此，該基因的克隆及其基本功能驗證，將為解決牛結核桿菌病的轉基因克隆牛提供可靠的基因選擇。本發明的技術解決方案是一種克隆牛IL-32 Y基因的方法，其特殊之處在于通過將人IL-32與牛的基因比對，分子克隆了牛IL-32Y基因。ー種整合牛IL-32Y基因的真核表達載體，其特殊之處在于包含目的基因牛IL-32 Y及通過IRES序列與其相連的GFP序列；包括抗性篩選基因neo基因。上述的整合牛IL-32 Y真核表達載體，其特征在于該載體通過用BamHI和SalI酶切將牛IL-32Y基因克隆到表達載體pIRES2-EGFP載體上。上述載體的小鼠巨噬細胞，其特征在干其宿主細胞是小鼠巨噬細胞系RAW264. 7，通過脂質體轉染的方法將目的基因牛IL-32Y整合到小鼠巨噬細胞的基因組中。上述小鼠巨噬細胞用于檢測牛IL-32Y的功能，判斷其是否具有調節IL-Ιβ、IL-6、MIP2以及TNFa細胞因子的產生或表達。ー種整合牛IL-32Y基因的真核表達載體的構建方法，其特殊之處在于，該方法包括I)牛IL-32 Y基因克隆I. I)根據牛IL-32Y與牛IL-32 β序列的開放閱讀框比較可知，牛IL-32 Y比牛IL-32i3多了一段序列，據此可將牛IL-32Y基因根據特殊設計引物分為3段克隆i、用牛 IL-32 3 cDNA 片段擴增 rl ；ii、用牛基因組擴增牛IL-32 Y特有片段r2;iii、用牛IL_32i3cDNA片段擴增r3 ;然后將3片段用PCR方法拼接，產生一段完整序列的牛IL-32Y基因；其中首尾兩端設計分別含有BamHI和SalI酶切位點，其引物如下正向引物IF :5’ -cgGGATCC ATGTGCTTCGCTAAGAGAGACC-3，；反向引物IR :5’ -GAGCTTCTTAC CGATAACACCCTGAAAGAAGC-3’ ；正向引物2F :5’ -GGGTGTTATCG GTAAGAAGCTCAITTCCACGTATAG-3’ ；反向引物2R :5’ -CAAGGTTGTG CTGTGAACAGAGATGGACTTGAG-3’ ；、
正向引物3F:5’ -CTCTGTTCACAG CACAACCTTGTAGATGAATTTTTCG_3’ ；反向引物3R : 5 ’ -tataGTCGAC TTAGACCTGGATGAGGCTTCTG-3 ’ ；I. 2)取成體秦川黃牛脾臟中約IOmg組織，采用Trizol方法提取脾臟組織中的總RNA，利用cDNA試劑盒反轉錄成第一鏈cDNA ；I. 3)以cDNA為模板，用引物對IF和3R，用Taq system PCR擴增牛IL-32基因，得到牛 IL-32 β ;反應條件是 94°C 3min ；94°C 30sec ；58°C 30sec ；72°C 45sec ；30 個循環；72°C延伸 IOmin ;4°C保存；
1.4)取成體秦川黃牛脾臟中約IOmg組織，用BIOTAC提取基因組試劑盒提取牛基因組；I. 5) PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，與pGEM-T Easy載體連接并轉化到DH5 α細菌，經藍白斑篩選挑選重組子，用EcoRI酶切鑒定為陽性的質粒進行測序，測序正確的陽性克隆命名為PGEM-T-IL32并用生物學軟件進行序列分析；I. 6)用PFU system PCR擴增rl、r2、r3片段，·其中rl,r3以cDNA為模板，分別用引物對IF和1R、3F和3R，r2以牛基因組為模板，用引物2F和2R，反應條件均為94°C 2min ；94°C 30sec ；58°C 30sec ；72°C 80sec ；30 個循環；72°C延伸 IOmin ;4°C保存；得到片段 rl、r2、r3 ;然后以上述rl、r2為模板，用引物IF和2R，上述反應條件進行擴增，得到rl_2片段；再以上述rl-2、r3為模板，用引物IF和3R，上述反應條件進行擴增，得到rl_2_3片段；即為牛IL-32 Y基因；I. 7) PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用BamHI和SalI酶切，與pET_41a連接并轉化到DH5 α細菌，用BamHI和SalI酶切鑒定為陽性的質粒進行測序，測序正確的陽性克隆命名為pET-41a-IL32 Y并用生物學軟件進行序列分析；2)牛IL-32 Y真核表達載體構建2. I)以 pIRES2-EGFP 載體為骨架，將 pET_41a_IL32 y、pIRES2_EGFP 分別用BamHI, BglII酶切并用Klenow酶補平，再分別用SalI酶切，回收IL32 Y基因片段和PIRES2-EGFP載體，用T4DNA連接酶連接過夜，將連接產物轉化入DH5a細菌，用NheI和BamHI酶切篩選陽性克隆；得表達載體pIRES_IL32 y -GFP ；2. 2) pIRES_IL32 Y -GFP 載體的驗證小鼠巨噬細胞RAW264. 7用含有體積百分比為10% FBS的高糖DMEM培養液，在370C的CO2孵箱中常規培養；將巨噬細胞接種于24孔板，24h后更換無血清的DMEM培養液，同時準備用脂質體-2000轉染重組質粒pIRES-IL32 y -GFP，轉染6h后棄去培養液，PBS沖洗3遍，48h后用熒光顯微鏡觀察GFP的表達。ー種利用上述pIRES-IL32 Y -GFP載體穩定轉染小鼠巨噬細胞RAW264. 7細胞的方法，其特殊之處在于，該方法包括I)小鼠巨噬細胞RAW264. 7細胞的培養I. I)在37°C解凍一管小鼠巨噬細胞RAW264. 7成系細胞，離心；I. 2)棄去培養液，加入Iml培養液重懸細胞，所述培養液為含體積百分比10% FBS的高糖DMEM ;轉移至含有4ml培養液60mm培養皿，在CO2孵箱中37°C培養；I. 3)待小鼠巨噬細胞RAW264. 7細胞密度達到70%-80%時，棄去培養液，加入2mlPBS洗滌細胞，所述PBS無Ca2+/Mg2+，棄去PBS加入質量百分比O. 25 %的胰酶消化細胞，待大多數細胞變圓、飄起時，用含有體積百分比10% FBS的DMEM培養液終止消化，使用移液器吹打混勻轉移到離心管中，1000轉離心5分鐘后，棄去培養液并懸浮，按照I : 3的比例傳代，置于CO2孵箱中37°C培養；I. 4)以此小鼠RAW264. 7巨噬細胞作為轉染并G418藥物篩選的宿主細胞；2)pIRES-IL32 Y -GFP載體穩定轉染小鼠巨噬細胞2. I)轉染前I天，將小鼠巨噬細胞RAW264. 7接種至60mm培養皿；培養液為含體積白飯比10% FBS、不含青霉素、鏈霉素的高糖DMEM ；
2. 2)當細胞匯合達到全皿的10% -15%時，按照脂質體2000說明書陳述的方法將重組質粒pIRES-IL32 y -GFP轉染小鼠巨噬細胞，以pIRES_EGF載體作為陽性對照；2. 3)在轉染前lh，將培養液換為無血清、無雙抗的DMEM ;將6 μ gDNA和15 μ L脂質體分別用50 μ L Opti-MEMEI Reduced Serum Medium進行稀釋,室溫孵育5min,將二者混合，再在室溫下孵育20min ；2. 4)最后將DNA/脂質體混合物逐滴加至培養孔內，在體積白飯比5 % CO2和飽和濕度下37°C培養；
2. 5)轉染6h后換為含體積百分比10% FBS的高糖DMEM ;轉染24h后，更換含有終濃度為700μ g/mL G418的細胞培養液進行篩選；同吋，以未轉染的小鼠巨噬細胞RAW264. 7作為陰性對照；2.6)每隔3-4天換液，篩選3-4周，直至長出陽性細胞克隆，在皿底標記克隆位置；2. 7)挑取克隆并逐個將陽性克隆傳至48孔培養板，一個孔接一個克隆；培養液中G418含量減半；待細胞匯合達到70 80%，胰酶消化后傳至六孔培養板；以同樣的方法，將六孔培養板中的細胞傳至60mm培養皿擴增；最后將60mm培養皿中的細胞消化后凍存。3)pIRES-IL32 y -GFP載體穩定表達小鼠巨噬細胞RAW264. 7的鑒定3. I)擴大培養pIRES-IL32Y-GFP陽性小鼠巨噬細胞，提取mRNA，反轉錄后并以cDNA為模板，PCR鑒定IL32 Y基因是否整合到小鼠巨噬細胞中并穩定表達IL32mRNA ；3. 2)取未轉染的正常小鼠巨噬細胞為陰性對照，取質粒pIRES-IL32 Y-GFP為陽性對照；根據引物IF和2R進行PCR擴增；3. 3)PCR 反應條件是 94°C 3min ；94°C 30sec ；58°C 30sec ；72°C Imin ；30 個循環；72°C延伸 IOmin ;4°C保存；3. 4)PCR產物經質量百分比I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。上述以G418藥物篩選是I)以6418藥物篩選小鼠巨噬細胞，？11 5-1し32￥-6 載體上含有1^0基因，整合有該載體并表達neo基因的小鼠巨噬細胞能夠在一定濃度的G418篩選時存活，未整合該載體的小鼠巨噬細胞在該濃度下死亡；需要篩選小鼠巨噬細胞的G418最小致死濃度；2)小鼠巨噬細胞G418最小致死濃度的測定將小鼠巨噬細胞接種12孔板的6個孔，次日換液，每孔分別加入以終濃度100，300，500，700，900，和ΙΙΟΟμ g/mL G418進行培養，其間每隔3天換液一次，培養至3周；當細胞培養液中的G418濃度等于或大于700 μ g/mL時，所有小鼠巨噬細胞都死亡，就G418對小鼠巨噬細胞胞的最小致死量是700 μ g/mL。ー種用上述穩定轉染？11 3-1し32￥-6 載體的小鼠巨噬細胞檢測細胞因子IL-I β、IL-6、MIP2以及TNF α表達情況的方法，其特殊之處在于，該方法包括I)將上述穩定轉染pIRES-IL32 Y -GFP載體的小鼠巨噬細胞采用Trizol方法提取細胞中的總RNA，并用DNA酶去除污染DNA，再用反轉錄試劑盒反轉錄成第一鏈cDNA ；2) Real-Time PCR以cDNA 為模板，用下列引物，RealTime PCR 檢測小鼠 IL-I β、IL-6、ΜΙΡ2、TNF α等細胞因子的表達情況；反應條件是94°C 3min ；94°C 20sec ；60°C 30sec ；40個循環；4°C保存；引物序列如下人工合成的小鼠ILl β 引物 F :5’ -CCTGAACTCAACTGTGAAATGCC-3’人工合成的小鼠ILl β 引物 R :5’ -CCAGGTCAAAGGTTTGGAAGC-3’人工合成的小鼠TNF α 引物 F : 5 ’ -CGGCATGGATCTCAAAGACAAC-3 ’人工合成的小鼠TNF α 引物 R : 5 ’ -CGGCAGAGAGGAGGTTGACTTT-3 ’人工合成的小鼠IL6 引物 F :5’ -GCCTTCTTGGGACTGATGCTG-3’
人工合成的小鼠IL6 引物 R :5’ -CTCATTTCCACGATTTCCCAG-3’ A人工合成的小鼠ΜΙΡ2 引物 F :5’ -GTCAATGCCTGAAGACCCTGC-3’人工合成的小鼠ΜΙΡ2 引物 R :5’ -GGCTTCAGGGTCAAGGCAAA-3’本發明具有以下特點I、本發明通過人與牛的DNA序列比對，分子克隆了牛IL-32 Y基因(GenBank序列號為JQ327711，未經公布)。并構建了真核表達載體，該載體含有啟動子CMV，能夠實現目的基因在小鼠巨噬細胞中高效表達。2、本發明將牛IL-32 Y真核表達載體轉染到小鼠巨噬細胞中，構建轉基因的小鼠巨噬細胞系；經過G418篩選獲得陽性細胞，并通過PCR驗證目的基因IL-32Y整合到小鼠巨噬細胞的基因組中，建立了 5株穩轉細胞系。3、用穩轉牛IL-32 Y的小鼠巨噬細胞系進行細胞水平驗證，檢測IL-I β、IL-6,MIP2、TNFa等細胞因子的表達變化。


圖IA是PCR擴增牛IL-32 β的結果圖；圖IB是EcoRI單酶切檢測pGEM_T_IL32 β的結果圖；圖2Α是PCR擴增牛IL-32 Y片段Y K y2, y3, Yト2、Y 1-2-3的結果圖；圖2Β 是 BamHI 和 SalI 雙酶切鑒定 pET41_IL32 Y圖3A是IL-32 Y真核細胞表達載體pIRES_IL32 Y -GFP的載體圖譜；圖3B是NheI和BamHI雙酶切鑒定pIRES_IL32 y -GFP載體的結果圖；圖4是pIRES-IL32 y -GFP載體轉染小鼠巨噬細胞RAW264. 7后篩選穩定克隆免疫熒光圖；圖5是pIRES-IL32 Y -GFP載體穩定轉染小鼠巨噬細胞PCR鑒定的結果圖；圖6 是 Real-Time PCR 檢測 IL-1 β、IL-6、ΜΙΡ2、TNF α 等細胞因子的表達。
具體實施例方式本發明首先克隆牛IL-32 Y基因，然后構建牛IL-32 Y表達載體PIRES-IL32 y -GFP,通過脂質體法將外源表達載體pIRES_IL32 y -GFP轉染入小鼠巨噬細胞。經G418篩選獲得陽性細胞，經PCR鑒定證實目的基因牛IL-32Y基因整合到小鼠巨噬細胞的基因組中并穩定表達該mRNA。將轉染牛IL-32 Y的巨噬細胞進行功能驗證，檢測IL-Ιβ、IL-6、MIP2、TNF α等細胞因子的表達情況。具體所涉及的試劑和材料如下
G418,高糖 DMEM, Trizol,細胞轉染試劑 Lipofectamine 2000 和Opti_MEMRIReduced Serum Medium 購自美國 Invitrogen 公司；EDTA 和 Trypsin 購自美國Sigma公司；FBS購自Hyclone公司；細胞培養板和培養皿購自Corning公司；DNA maker購自天根公司；pGEM_T Easy載體和質粒提取試劑盒購自Promega公司；限制性核酸內切酶、Taq DNA聚合酶、PFU DNA聚合酶、T4DNA連接酶、dNTP、Klenow酶、和反轉錄試劑盒由Fermentas公司提供；基因組提取試劑盒購自Axygene ;小鼠巨噬細胞RAW264. 7購自中南大學湘雅中心實驗室。下面結合附圖和實驗作進一歩詳細說明。I、牛IL-32 Y基因克隆根據牛IL-32 Y與牛IL-32 β序列的開放閱讀框比較可知，牛IL-32 Y比牛IL-32i3多了一段序列，所以可以據此將牛IL-32 Y基因根據特殊設計引物分為3段克隆
(I)、用牛IL-32i3cDNA片段擴增rl ; (2)、用牛基因組擴增牛IL-32 Y特有片段r2 ;(3)、用牛IL-32i3cDNA片段擴增r3 ;然后將3片段用PCR方法拼接，產生一段完整序列的牛·IL-32 Y基因。其中首尾兩端設計分別含有BamHI和SalI酶切位點。其引物如下，正向引物IF :5’ -C gGGATCC ATGTGCTTCGCTAAGAGAGACC-3，；反向引物IR : 5 ’ - GAGCTTCTTAC CGATAACACCCTGAAAGAAGC-3 ’ ；正向引物2F : 5，- GGGTGTTATCG GTAAGAAGCTCATTTCCACGTATAG-3，；反向引物2R : 5，- CAAGGTTGTG CTGTGAACAGAGATGGACTTGAG-3，；正向引物3F : 5，- CTCTGTTCACAG CACAACCTTGTAGATGAATTTTTCG-3，；反向引物3R : 5，-tataGTCGAC TTAGACCTGGATGAGGCTTCTG-3 ’ ；下劃線為酶切位點BamHI和Sail，粗體為拼接序列小寫字體為保護序列。引物有北京奧科公司合成。I. I牛IL-32 3基因的合成取成體秦川黃牛脾臟中約IOmg組織，采用Trizol方法提取脾臟組織中的總RNA，利用cDNA試劑盒反轉錄成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，用弓I物對IF和3R，用Taq酶擴增牛IL-32 基因，得到牛 IL-32 β ;反應條件是 94°C 3min ；94°C 30sec ；58°C 30sec ；72°C 45sec ；30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，與pGEM_T Easy載體連接并轉化到DH5a細菌，經藍白斑篩選挑選重組子，對EcoRI酶切鑒定為陽性的質粒進行測序，測序正確的陽性克隆命名為pGEM-T-IL32i3并用生物學軟件進行序列分析。PCR結果如圖IA所示，酶切檢測如圖IB所示，泳道I是重組質粒pGEM-T-IL32 β經EcoRI酶切后產生516bp特異性條帶，電泳結果與預期結果一致。測序結果通過Blast比對分析表明，擴增的秦川黃牛 IL_32 β 的序列與 Genebank 中 NW_001494274. I (Bos taurus breedHereford chromosome 25genomic scaffold)比對得到IL32序列有七個喊基不同。有5個氨基酸不同，經氨基酸ニ級結構比較可知其變化對ニ級結構沒有影響。IL320基因雖然較為保守，但在不同品種間存在多態性，造成這種突變可能是種屬間差異產生的ー種多態現象。I. 2牛IL-32 Y基因的合成用PFU system PCR擴增rl、r2、r3片段，其中rl、r3以cDNA為模板，分別用引物對IF和1R、3F和3R，r2以牛基因組為模板，用引物2F和2R，反應條件均為94°C，2min ；94°C 30sec ；58°C 30sec ；72°C 80sec ；30 個循環；72°C延伸 IOmin ;4°C保存；得到片段 rl、!■2、1'3;然后以上述1'1、1'2為模板，用引物ぴ和2R，上述反應條件進行擴增，得到rl-2片段；再以上述rl-2、r3為模板，用引物IF和3R，上述反應條件進行擴增，得到rl_2_3片段；SP為牛IL-32 Y基因；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用BamHI和Sal I酶切，與pET_41a連接并轉化到DH5 α細菌，用BamHI和SalI酶切鑒定為陽性的質粒進行測序，測序正確的陽性克隆命名為pET-41a-IL32 Y并用生物學軟件進行序列分析；PCR結果如圖3、4、5所示，pET-41a-IL32 Y酶切檢測如圖6所示，泳道I是重組質粒pET-41a-IL32 Y經酶切后產生657bp特異性條帶，電泳結果與預期結果一致。2、牛IL-32 Y真核表達載體的結構及其構建2. lpIRES-IL32 Y -GFP 的構建含有IL-32 Y基因和啟動子(CMV)以及抗性篩選基因(Neo)的pIRES2_EGFP載體。篩選基因(Neo)用來篩選含有該載體的重組細胞，進而檢測細胞因子誘導效率。以 pIRES2-EGFP 載體為骨架，將 pET_41a_IL32 y、pIRES2_EGFP 分別用 BamHI、BglII酶切并用Klenow酶補平，再分別用SalI酶切，回收IL32 Y基因片段和pIRES2_EGFP載體，用T4DNA連接酶連接過夜，將連接產物轉化入DH5 α細菌，用NheI和BamHI酶切鑒定陽性克隆；得表達載體PIRES-IL32 y -GFP (如圖6)。2. 2pIRES-IL32 Y -GFP 載體的驗證小鼠巨噬細胞RAW264. 7用含有10% FBS的高糖DMEM培養液，在37°C的CO2孵箱中常規培養。將巨噬細胞接種于24孔板，24h后更換無血清的DMEM培養液，同時準備用脂質體-2000轉染重組質粒pIRES-IL32 y -GFP (具體方法按脂質體-2000說明書進行)，轉染48h后照相，pIRES-IL32 y -GFP轉染小鼠巨噬細胞有效。3. pIRES-IL32 y -GFP 穩定轉染小鼠巨噬細胞 RAW264. 73. I小鼠巨噬細胞RAW264. 7的培養在37°C解凍一管小鼠巨噬細胞RAW264. 7成系細胞，離心。棄去培養液，加入Iml培養液(含10% FBS的高糖DMEM)重懸細胞，轉移至含有4ml培養液60mm培養皿，在CO2孵箱中37°C培養。待牛成纖維細胞密度達到70% -80%時，棄去培養液，加入2ml PBS無Ca2VMg2+洗滌細胞，棄去PBS，加入O. 25%的胰酶消化細胞，待大多數細胞變圓、飄起吋，用含有10% FBS的DMEM培養液終止消化，使用移液器吹打混勻轉移到離心管中，1000轉離心5分鐘后，棄去培養液并懸浮，按照I : 3的比例傳代，置于CO2孵箱中37°C培養。取傳代2-3次的巨噬細胞作為轉染的宿主細胞。本發明以G418藥物篩選巨噬細胞，由于pIRES-IL32 y -GFP載體上含有neo基因，因此整合有該載體并表達neo基因的巨噬細胞能夠在一定濃度的G418篩選時存活，而未整合該載體的巨噬細胞在該濃度下死亡。因此需要篩選正常巨噬細胞的G418最小致死濃度。小鼠巨噬細胞G418最小致死濃度的測定將小鼠巨噬細胞接種12孔板的6個孔，次日換液，每孔分別加入以終濃度100，300，500，700,900和1100 μ g/mL G418進行培養，其間每隔3天換液一次，培養至3周。當細胞培養液中的G418濃度等于或大于700 μ g/mL吋，所有巨噬細胞都死亡，就G418對牛皮膚成纖維細胞的最小致死量是700 μ g/mL。3. 2pIRES-IL32 Y -GFP載體穩定轉染小鼠巨噬細胞轉染前I天，將小鼠巨噬細胞接種至60mm培養皿。培養液為含10% FBS、不含青、霉素、鏈霉素的高糖DMEM。當細胞匯合達到全皿的10% -15%時，按照脂質體2000說明書陳述的方法將重組質粒PIRES-IL32 y -GFP轉染小鼠巨噬細胞，以pIRES-EGFP載體作為陽性對照。在轉染前lh，將培養液換為無血清、無雙抗的DMEM。將6 μ gDNA和15 μ L脂質體分別用500 μ L Opti-MEMEI Reduced SerumMedium進行稀釋,室溫孵育5min,將二者混合，再在室溫下孵育20min。最后將DNA/脂質體混合物逐滴加至培養孔內，在5% CO2和飽和濕度下37°C培養。轉染6h后換為含10% FBS的高糖DMEM。轉染24h后，更換含有終濃度為700 μ g/mL G418的細胞培養液進行篩選；同吋，以未轉染的小鼠巨噬細胞作為陰性對照。每隔3-4天換液，篩選3-4周，直至長出陽性細胞克隆，用記號筆在皿底標記克隆位置。挑取克隆并逐個將陽性克隆傳至48孔培養板，ー個孔接ー個克隆。此后培養液中G418含量減半(400yg/mL)。待細胞達到70 80%匯合時，胰酶消化后傳至六孔培養板。以同樣的方法，將六孔培養板中的細胞傳至60mm培養皿擴增。最后將60mm培養皿中的細胞消化后凍存。本發明篩選的陽性細胞都是穩定轉染pIRES-IL32 Y -GFP載體的小鼠巨噬細胞。載體整合到細胞的基因組上，隨著細胞DNA的復制而復制。在穩定轉染的過程中， 11 5-1し32￥-6 載體攜帶的01^啟動子，IL32Y基因和neo基因等元件會整合到宿主細胞的基因組中，通過G418篩選3周后達到穩定轉染的目的，表現為篩選的細胞呈G418抗性。以上通過穩定轉染篩選整合有PIRES-IL32 ￥-6 載體細胞，得到含有1し32_￥基因的小鼠巨噬細胞。3. 3pIRES-IL32 Y -GFP載體穩定轉染小鼠巨噬細胞表達基因情況的鑒定擴大培養PIRES-IL32 y -GFP陽性小鼠巨噬細胞，提取RNA并進行反轉錄，以此cDNA為模板，PCR鑒定IL32Y基因是否在小鼠巨噬細胞中表達；取未轉染質粒的正常小鼠巨噬細胞為陰性對照，取質粒pIRES-IL32 y -GFP為陽性對照。PCR擴增引物對為IF和2R。PCR 反應條件是 94で 3min ；94°C 30sec ；60°C 30sec ；72°C 50sec ;30 個循環；72で延伸IOmin ;4°C保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測結果如圖5所示，其中泳道M為DNA marker,泳道I是陰性對照，泳道2_4為穩定轉染pIRES_IL32 y -GFP的小鼠巨噬細胞，泳道5為陽性對照。結果表明，pIRES-IL32 y -GFP載體在宿主細胞小鼠巨噬細胞中穩定表達IL32mRNA。4、以穩定轉染？11 5-1し32￥-6 載體的小鼠巨噬細胞檢測IL-1 β、IL-6, MIP2、TNFa等細胞因子的表達以未轉染的小鼠巨噬細胞為陰性對照組，以pIRES-IL32 Y-GFP載體的小鼠巨噬細胞為樣品組，以穩定轉染人PIRES-IL32 y -GFP載體的小鼠巨噬細胞為陽性對照組，將此3組樣品提取RNA并進行反轉錄，以此cDNA為模板，進行Real-TimePCR，檢測IL-I β、IL_6、TNFa、MIP2等細胞因子的表達變化情況。結果表明，IL-I β、TNF a、MIP2的表達量較陰性對照上升，IL-6的表達下降，但其趨勢均與陽性對照一致。
核苷酸序列表
〈110>西北農林科技大學
〈120>—種牛白細胞介素32^亞型的分子克隆/穩轉細胞系的建立及其方法
〈140〉
〈141〉
<160>1
<210>1
<211>30
〈212>DNA
〈213〉人工合成的牛IL32 Y引物IF
<400>1
cgggatccat gtgcttcgct aagagagacc 30·
<210>2
〈211>32
〈212>DNA
〈213〉人工合成的牛IL32 Y引物IR
<400>2
gagcttctta ccgataacac cctgaaagaa gc 32
<210>3
<211>36
〈212>DNA
〈213〉人工合成的牛IL32 Y引物2F
〈400>3
gggtgttatc ggtaagaagc tcatttccac gtatag 36
<210>4
<211>33
〈212>DNA
〈213〉人工合成的牛IL32 Y引物2R
<400>4
caaggttgtg ctgtgaacag agatggactt gag 33
<210>5
<211>37
〈212>DNA
〈213〉人工合成的牛IL32 Y引物3F
<400>5
ctctgttcac agcacaacct tgtagatgaa tttttcg 37
<210>6
<211>32
〈212>DNA
〈213〉人工合成的牛IL32 Y引物2R
<400>6
tatagtcgac ttagacctgg atgaggcttc tg 32
<210>7
<211>657
〈212>DNA
〈213〉人工合成的牛IL32 Y基因
<400>7
agctcatttc cacgtatagc tggggttcag gaggcctggg ttctgctggg tgaagctgag 120
aacattctgg cccacttggg acccagcaga gagaagaacc gagattcttt tactcaagtc 180
catctctgtt cacagcacaa ccttgtagat gaatttttcg atacaatgga aaatgaacca 240
tttaaagtca tggataatca cattcaagag aacagtcccg aaaccctgaa ggagtccagt j60
cccttgcttc aggaagcaca gcaagaagta cgctgcagaa tccagagacg ctccgtcgcc 420
acctctctgg aggtccagaa tccggaagag agcatctggg ccagagccct gcggcagttc 480
ttgggcattc tgcagagttt cctgtccggg tgtcgggatg cgctcacctg gctgtgggag 540
aaggccgcgg cctgcctaca ggccgtctgc agtgcggtgg aggccctctg ggaagtgctc 600
〈210>8
〈211>23
〈212>DNA
〈213>人工合成的小鼠ILli3引物F
<400>8
cctgaactca actgtgaaat gcc23
<210>9
〈211>21
〈212>DNA
〈213>人工合成的小鼠ILlP引物R
<400>9
ccaggtcaaa ggtttggaag c21
<210>10
<211>21
〈212>DNA
〈213〉人工合成的小鼠IL6引物F
<400>10
gccttcttgg gactgatgct g21
<210>11
<211>22
〈212>DNA
〈213〉人工合成的小鼠IL6引物R
<400>11
ctcatttcca cgatttccca ga22
<210>12
<211>22
〈212>DNA
〈213>人工合成的小鼠IL6引物F
<400>12
cggcatggat ctcaaagaca ac22
<210>13
<211>22
〈212>DNA
〈213>人工合成的牛IL32Y引物2R
<400>13
cggcagagag gaggttgact tt22
<210>14
〈211>21
〈212>DNA
〈213〉人工合成的小鼠IL6引物F
<400>14
gtcaatgcct gaagaccctg c21
<210>15
<211>20
〈212>DNA
〈213〉人工合成的牛IL32 Y引物2R
<400>15
ggcttcaggg tcaaggcaaa20
權利要求
1.一種克隆牛IL-32Y基因的方法，其特征在于通過將人IL-32與牛的基因比對，分子克隆牛IL-32 Y基因，GenBank序列號為JQ327711。
2.ー種整合牛IL-32Y基因的真核表達載體，其特征在于包含目的基因牛IL-32Y及通過IRES序列與其相連的GFP序列；包括抗性篩選基因neo基因。
3.根據權利要求2所述的整合牛IL-32Y真核表達載體，其特征在于該載體通過用BamHI和SalI酶切將牛IL-32 Y基因克隆到表達載體pIRES2_EGFP載體上。
4.ー種含有權利要求2所述載體的小鼠巨噬細胞，其特征在于其宿主細胞是小鼠巨噬細胞系RAW264. 7，通過脂質體轉染的方法將目的基因牛IL-32 Y整合到小鼠巨噬細胞的基因組中，并表達其蛋白。
5.根據權利要求4所述小鼠巨噬細胞，其特征在于該小鼠巨噬細胞用于檢測牛IL-32 Y的功能，判斷其是否具有調節IL-I β、IL-6、ΜΙΡ2以及TNF α細胞因子的產生或表達。
6.—種整合牛IL-32 Y基因的真核表達載體的構建方法，其特征在于，該方法包括 I)牛IL-32 Y基因克隆 I.I)根據牛IL-32 Y與牛IL-320序列的開放閱讀框比較可知，牛IL-32 Y比牛IL-32i3多了一段序列，據此可將牛IL-32 Y基因根據特殊設計引物分為3段克隆 i、用牛IL-32i3cDNA片段擴增rl； ii、用牛基因組擴增牛IL-32Y特有片段r2； iii、用牛IL-32β cDNA片段擴增r3 ； 然后將3片段用PCR方法拼接，產生一段完整序列的牛IL-32Y基因；其中首尾兩端設計分別含有BamHI和SalI酶切位點，其引物如下正向引物 IF :5’ -C gGGATCC ATGTGCTTCGCTAAGAGAGACC-3，；反向引物 IR :5’ -GAGCTTCTTAC CGATAACACCCTGAAAGAAGC-3’ ；正向引物 2F:5’ -GGGTGTTATCG GTAAGAAGCTCAITTCCACGTATAG-3’ ；反向引物 2R:5’ -CAAGGTTGTG CTGTGAACAGAGATGGACTTGAG-3’ ；正向引物 3F:5’ -CTCTGTTCACAG CACAACCTTGTAGATGAATITTTCG-3’ ；反向引物 3R :5’ -tataGTCGAC TTAGACCTGGATGAGGCTTCTG-3，； I.2)取成體秦川黃牛脾臟中約IOmg組織，采用Trizol方法提取脾組織中的RNA，利用cDNA試劑盒反轉錄成第一鏈cDNA ； · 1.3)以cDNA為模板，用引物IF和3R，擴增牛IL-32基因，得到牛IL-320 (GenBank序列號為 JQ327712);反應條件是 94°C 3min ；94°C 30sec ；58°C 30sec ；72°C 45sec ;30 個循環；72°C延伸 IOmin ;4°C保存； ·1.4)取成體秦川黃牛脾臟中約IOmg組織，用BIOTAC提取基因組試劑盒提取牛基因組； I.5)PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，與pGEM-T Easy載體連接并轉化到DH5 α細菌，經藍白斑篩選挑選重組子，用EcoRI酶切鑒定為陽性的質粒進行測序，測序正確的陽性克隆命名為PGEM-T-IL32，并用生物學軟件進行序列分析； I.6)用PFU system PCR擴增rl、r2、r3片段，其中rl、r3以cDNA為模板，分別用引物對IF和1R、3F和3R，r2以牛基因組為模板，用引物2F和2R，反應條件均為94°C 2min ；94°C 30sec ；58°C 30sec ；72°C 80sec ；30 個循環；72°C延伸 IOmin ;4°C保存；得到片段 rl、r2、r3;然后以上述1'1、1'2為模板，用引物ぴ和2R，及上述反應條件進行擴增，得到rl-2片段；再以上述rl-2、r3為模板，用引物IF和3R，得到rl-2_3片段；即牛的IL-32 Y基因； .1.7) PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用BamHI和SalI酶切，與pET_41a連接并轉化到DH5 α細菌，用BamHI和SalI酶切鑒定為陽性的質粒進行測序，測序正確的陽性克隆命名為pET-41a-IL32 Y并用生物學軟件進行序列分析； 2)牛IL-32 Y真核表達載體構建 .2.I)以 pIRES2-EGFP 載體為骨架，將 pET_41a_IL32 y、pIRES2_EGFP 分別用 BamHI、BglII酶切，并用Klenow酶補平，再分別用SalI酶切，回收IL32 Y基因片段和pIRES2_EGFP載體，用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產物轉化DH5 α細菌，用NheI和BamHI酶切篩選陽性克隆；得到表達載體pIRES-IL32 y -GFP ； . 2.2)pIRES-IL32 y -GFP 載體的驗證 小鼠巨噬細胞RAW264. 7用含有體積百分比為10% FBS的高糖DMEM培養液，在37°C的CO2孵箱中常規培養；將巨噬細胞接種于24孔板，24h后更換無血清的DMEM培養液，同時準備用脂質體-2000轉染重組質粒pIRES-IL32 y -GFP，轉染6h后棄去培養液，PBS沖洗3遍，48h后用熒光顯微鏡觀察GFP的表達。
7.ー種利用權利要求6所述pIRES-IL32 y -GFP載體穩定轉染小鼠巨噬細胞RAW264. 7細胞的方法，其特征在于，該方法包括 1)小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞的培養 I. I)在37°C解凍一管小鼠巨噬細胞RAW264. 7成系細胞，離心； I. 2)棄去培養液，加入Iml培養液重懸細胞，所述培養液為含體積百分比10% FBS的高糖DMEM ;轉移至含有4ml培養液60mm培養皿，在CO2孵箱中37°C培養； I. 3)待小鼠巨噬細胞RAW264. 7細胞密度達到70%-80%時，棄去培養液，加入2ml PBS洗滌細胞，所述PBS無Ca2+/Mg2+。棄去PBS加入質量百分比為O. 25%的胰酶消化細胞，待大多數細胞變圓、飄起時，用含有體積百分比10% FBS的DMEM培養液終止消化，使用移液器吹打混勻轉移到離心管中，1000轉離心5分鐘后，棄去培養液并懸浮，按照I : 3的比例傳代，置于CO2孵箱中37°C培養； .1.4)以小鼠RAW264. 7巨噬細胞作為轉染和G418藥物篩選的宿主細胞； 2)pIRES-IL32y -GFP載體穩定轉染小鼠巨噬細胞 .2.I)轉染前I天，將小鼠巨噬細胞RAW264. 7接種至60mm培養皿；培養液為含體積百分比10% FBS、不含青霉素、鏈霉素的高糖DMEM ； .2.2)當細胞匯合達到全皿的10% -15%時，按照脂質體2000說明書陳述的方法將重組質粒pIRES-IL32 y -GFP轉染小鼠巨噬細胞，以pIRES2_EGFP載體作為陽性對照； .2.3)在轉染前lh，將培養液換為無血清、無雙抗的DMEM ;將6 μ gDNA和15 μ L脂質體分別用50 μ L Opti-MEMEI Reduced Serum Medium進行稀釋，室溫孵育5min,將二者混合，再在室溫下孵育20min ； .2.4)最后將DNA/脂質體混合物逐滴加至培養孔內，在體積百分比為5% CO2和飽和濕度下37°C培養； .2.5)轉染6h后換為含體積百分比10% FBS的高糖DMEM ;轉染24h后，更換含有終濃度為700μ g/mL G418的細胞培養液進行篩選；同吋，以未轉染的小鼠巨噬細胞RAW264. 7作為陰性對照； .2.6)每隔3-4天換液，篩選3-4周，直至長出陽性細胞克隆，在皿底標記克隆位置； .2.7)挑取克隆并逐個將陽性克隆傳至48孔培養板，一個孔接一個克隆；培養液中G418含量減半；待細胞匯合達到70 80%，胰酶消化后傳至六孔培養板；以同樣的方法，將六孔培養板中的細胞傳至60mm培養皿擴增；最后將60mm培養皿中的細胞消化后凍存； 3)pIRES-IL32 y -GFP載體穩定表達小鼠巨噬細胞RAW264. 7的鑒定 .3.I)擴大培養pIRES-IL32 y -GFP陽性小鼠巨噬細胞，提取mRNA，反轉錄后并以cDNA為模板，PCR鑒定IL32 Y基因是否整合到小鼠巨噬細胞中并穩定表達IL32 YmRNA ； .3.2)取未轉染的正常小鼠巨噬細胞為陰性對照，取質粒pIRES-IL32 Y-GFP為陽性對照；根據引物IF和2R進行PCR擴增； . 3.3)PCR 反應條件是 94°C 3min ；94°C 30sec ；58°C 30sec ；72°C Imin ；30 個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存； .3.4)PCR產物經質量百分比為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
8.根據權利要求7所述利用pIRES-IL32y -GFP載體穩定轉染小鼠巨噬細胞RAW264. 7細胞的方法，其特征在于，所述以G418藥物篩選是 1)以G418藥物篩選小鼠巨噬細胞，pIRES-IL32y -GFP載體上含有neo基因，整合有該載體并表達neo基因的小鼠巨噬細胞能夠在一定濃度的G418篩選時存活，未整合該載體的小鼠巨噬細胞在該濃度下死亡；需要篩選小鼠巨噬細胞的G418最小致死濃度； 2)小鼠巨噬細胞G418最小致死濃度的測定 將小鼠巨噬細胞接種12孔板的6個孔，次日換液，每孔分別加入以終濃度100，300，500，700，900和1100 μ g/mL G418進行培養，其間每隔3天換液一次，培養至3周；當細胞培養液中的G418濃度等于或大于700 μ g/mL時，所有小鼠巨噬細胞都死亡，就G418對小鼠巨噬細胞胞的最小致死量是700 μ g/mL。
9.一種用權利要求7所述穩定轉染pIRES-IL32 y -GFP載體的小鼠巨噬細胞檢測細胞因子IL-I β、IL-6、MIP2以及TNF α表達情況的方法，其特征在于，該方法包括 1)將上述穩定轉染PIRES-IL32y -GFP載體的小鼠巨噬細胞采用Trizol方法提取細胞中的總RNA，并用DNA酶去除污染DNA，再用cDNA試劑盒反轉錄成第一鏈cDNA ；2)Real-TimePCR 以cDNA為模板，用下列引物，RealTime PCR檢測小鼠IL-1 β、IL-6、MIP2、TNF α等細胞因子的表達情況；反應條件是94°C 3min ；94°C 20sec ；60°C 30sec ；40個循環；4°C保存；引物序列如下 人工合成的小鼠 ILl β 引物 F :5’ -CCTGAACTCAACTGTGAAATGCC-3’ 人工合成的小鼠 ILl β 引物 R :5’ -CCAGGTCAAAGGITTGGAAGC-3’ 人工合成的小鼠 TNFa 引物 F :5’ -CGGCATGGATCTCAAAGACAAC-3’ 人工合成的小鼠 TNFa 引物 R:5’ -CGGCAGAGAGGAGGTTGACTTT-3’ 人工合成的小鼠 IL6 引物 F :5’ -GCCTTCTTGGGACTGATGCTG-3’ 人工合成的小鼠 IL6 引物 R :5’ -CTCATTTCCACGATTTCCCAG-3’ A 人工合成的小鼠 MIP2 引物 F :5’ -GTCAATGCCTGAAGACCCTGC-3’人工合成的小鼠 MIP2 引物 R :5’ -GGCTTCAGGGTCAAGGCAAA-3 ’。
全文摘要
一種牛白細胞介素32γ亞型的分子克隆/穩轉細胞系的建立及方法，將該基因在牛基因組中定位，并初步驗證功能；用人的IL32基因序列在在NCBI及牛基因組數據庫中進行序列比對，找出牛IL-32γ的構型，并在牛脾臟組織中進行分子克隆，該克隆出的基因序列已被NCBI收錄(GenBank序列號為JQ327711，未經公布)；然后構建一種包含該牛IL-32γ的表達載體pIRES-IL32γ-GFP，以及一種基于該載體的包含牛IL-32γ基因的小鼠巨噬細胞系RAW264.7，驗證牛IL-32γ具有誘導IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等細胞因子的功能。
文檔編號C12N5/10GK102660552SQ201110458380
公開日2012年9月12日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者張軍林, 王華巖, 程祥, 魏育蕾 申請人:西北農林科技大學