專利名稱：一種原位檢測線粒體dna片段整合到核基因組中的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法。
背景技術(shù)：
線粒體是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的半自主性細(xì)胞器，能夠獨(dú)立進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)的表達(dá)，在細(xì)胞的能量代謝、自由基的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡等過程中都發(fā)揮著重要作用。 與核基因組相比，線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)缺乏組蛋白保護(hù)，而且沒有有效的損傷修復(fù)系統(tǒng)，因此極易受到攻擊，是致癌物作用的重要靶點(diǎn)。mtDNA的損傷包括突變、整合和不穩(wěn)定性改變。線粒體受到損傷后，mtDNA可在短期內(nèi)裂解，而且由于細(xì)胞內(nèi)核酸降解酶活性下降不能有效清除，因此產(chǎn)生大量游離的mtDNA。另一方面，胞質(zhì)中的mtRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄也可生成 mtDNA。這些mtDNA通過細(xì)胞核膜的核孔進(jìn)入核內(nèi)，隨機(jī)整合到核基因組中。如果這種整合出現(xiàn)在癌基因或抑癌基因上，便可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生癌變。已在多種人類腫瘤如肺癌、肝癌、 腎癌、乳腺癌中檢測到了這種改變。例如，在HelaTG細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)mtDNA細(xì)胞色素C氧化酶 (COX)亞單位整合入C-myc基因內(nèi)，產(chǎn)生了含有C-myc和COX融合遺傳信息的mtRNA。因而 mtDNA與核內(nèi)DNA(nDNA)的整合可能是腫瘤發(fā)生的重要基礎(chǔ)。因此，檢測線粒體DNA整合到核基因組中的狀況能反映出線粒體的遺傳損傷，對于評價(jià)基因組的穩(wěn)定性具有重要的意義。目前原位檢測線粒體基因組的方法是采用末端轉(zhuǎn)移(Nick translation)的方法對靶向全長的線粒體DNA序列進(jìn)行原位雜交。但是由于線粒體DNA整合到核基因組中具有隨機(jī)性，并非是全長的線粒體基因整合進(jìn)入核基因組，因而需要較短的探針采用更加靈敏的方式來檢測線粒體基因整合到核基因組中的狀況。熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA 與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。目前，F(xiàn)ISH技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物及微生物的研究中，成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要技術(shù)手段。目前FISH技術(shù)主要是針對細(xì)胞核DNA進(jìn)行的。例如在腫瘤學(xué)研究和臨床中采用 FISH技術(shù)檢測位于染色體17qll. 2_ql2的HER-2基因的擴(kuò)增情況，可用于指導(dǎo)臨床上赫賽汀(Here印tin)的用藥；EGFR基因擴(kuò)增情況可用于指導(dǎo)分子靶向藥物吉非替尼的用藥。針對核基因組DNA的染色質(zhì)原位雜交采用的熒光探針一般較長，以保證寡核苷酸探針的特異性，商品化的熒光探針長達(dá)400KB。而線粒體DNA的總長度僅有20KD，而由于雙鏈斷裂而整合進(jìn)入細(xì)胞核DNA中的片段常常更短。因而需要在檢測較短DNA片段的時(shí)候提高雜交的特異性。并且由于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均有幾十至數(shù)百個(gè)線粒體基因組的拷貝，細(xì)胞質(zhì)中的線粒體DNA會(huì)與熒光探針雜交而形成較強(qiáng)的雜交信號，因而需要提高細(xì)胞核內(nèi)熒光探針與整合到基因組中mtDNA的雜交信號。目前還未曾見用于線粒體DNA的檢測。因此，提供一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法。該方法能夠?qū)€粒體DNA整合到核基因組中進(jìn)行原位檢測，特異性好。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法，包括如下步驟獲得組織切片，經(jīng)預(yù)處理后獲得第一切片；設(shè)計(jì)長度為50 70bp的探針并用熒光素標(biāo)記；所述探針序列與所述線粒體DNA 序列互補(bǔ)；取無關(guān)DNA與所述第一切片混合后獲得第二切片；取所述探針與所述第二切片混合，雜交、復(fù)染，熒光顯微檢測；所述無關(guān)DNA與所述線粒體DNA不結(jié)合。細(xì)胞中有些物質(zhì)(比如某些蛋白質(zhì))會(huì)吸附DNA(比如有些細(xì)胞中的DNA結(jié)合蛋白，對任何DNA都有親和力)，這樣如果帶有熒光的DNA與之非特異性結(jié)合，觀察到熒光點(diǎn)， 會(huì)有假陽性結(jié)果出現(xiàn)，但是這并非是探針和匹配的DNA結(jié)合所致，因此，為了消除此類非特異性的結(jié)合，加入一些無關(guān)的DNA，讓其去結(jié)合那些容易結(jié)合DNA的物質(zhì)，減小DNA探針與那些容易結(jié)合DNA的物質(zhì)結(jié)合的幾率，增大DNA探針結(jié)合靶序列DNA的幾率，探針結(jié)合就會(huì)更具有特異性。對細(xì)胞中線粒體DNA整合到核基因組中進(jìn)行原位檢測，可以同時(shí)結(jié)合蛋白質(zhì)免疫熒光實(shí)驗(yàn)等，有助于檢測線粒體基因組整合過程中的相關(guān)蛋白(比如同時(shí)采用紅色熒光羅丹明標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，如果紅色和綠色重合后成為黃色，則說明某種蛋白與線粒體整合是共定位的，二者可能功能上相關(guān))。因此，先加入無關(guān)的DNA，可以結(jié)合在某些易于吸附DNA的地方；再加入探針DNA， 則可減少或消除探針DNA的非特異性結(jié)合。探針長度小于50bp雜交的特異性難以得到保證；大于70bp后，短片段的整合難以檢測出(假陰性)。探針的序列可根據(jù)線粒體序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，只要滿足探針序列與線粒體DNA序列互補(bǔ)即可，無關(guān)DNA序列亦根據(jù)線粒體序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，只要滿足無關(guān)DNA與線粒體DNA不結(jié)合即可。本發(fā)明提供的探針序列、無關(guān)DNA序列并不限制本發(fā)明。原位檢測小鼠線粒體DNA整合到核基因組時(shí)，探針序列如SEQ ID NO :1所示，無關(guān) DNA序列如SEQ ID NO 2所示。原位檢測大鼠線粒體DNA整合到核基因組時(shí)，探針序列如SEQ ID NO :3所示，無關(guān) DNA序列如SEQ ID NO 2所示。作為優(yōu)選，雜交為在65 85°C雜交5min，置于40 45°C雜交10 14h。
作為優(yōu)選，所述熒光素包括異硫氰酸熒光素(FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC)、四乙基羅丹明(RB200)、量子點(diǎn)(quantum dot)、Cy3或Cy5中的一種或兩者以上的混合物。作為優(yōu)選，預(yù)處理包括除蛋白、除RNA的步驟。在細(xì)胞中，DNA不是裸露的，上面有RNA、蛋白質(zhì)等等結(jié)合，采用RNAse，蛋白酶等處理樣品，能更好的使DNA暴露出來，降低背景(噪音)、以及假陽性。優(yōu)選地，預(yù)處理具體為采用終濃度為100 300 μ g/ml的蛋白酶K，35 40°C下孵育15 45min，采用終濃度為50 200 μ g/ml的RNAse，37°C下孵育15min。優(yōu)選地，所述預(yù)處理還包括取采用終濃度為0. 2mol/L的NaCl溶液，60°C處理Ih 的步驟。作為優(yōu)選，所述預(yù)處理還包括在15 35 °C下于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次 5min ；甲醛固定IOmin ；依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2min，自然干燥的步
馬聚ο本發(fā)明提供一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法。該方法能夠度線粒體DNA整合到核基因組中進(jìn)行原位檢測，特異性好。


圖1示實(shí)施例1熒光原位雜交檢測結(jié)果；其中，圖1㈧示正常小鼠小腸組織線粒體DNA探針雜交檢測結(jié)果；圖I(B)示正常小鼠小腸組織DAPI染細(xì)胞核結(jié)果；圖I(C)示正常小鼠小腸組織線粒體DNA探針雜交和DAPI染色疊加結(jié)果；圖I(D)示8Gy X射線照射小鼠小腸組織線粒體DNA探針雜交檢測結(jié)果；圖1 (E)示8Gy X射線照射小鼠小腸組織DAPI 染細(xì)胞核結(jié)果；圖I(F)示8Gy X射線照射小鼠小腸組織線粒體DNA探針雜交和DAPI染色疊加結(jié)果；虛線圓圈內(nèi)可見熒光信號，表明能檢測到線粒體基因整合到細(xì)胞核中；圖2示實(shí)施例2熒光原位雜交檢測結(jié)果；其中，圖2(A)示正常大鼠肺組織線粒體 DNA探針雜交檢測結(jié)果；圖2(B)示正常大鼠肺組織DAPI染細(xì)胞核結(jié)果；圖2(C)示正常大鼠肺組織線粒體DNA探針雜交和DAPI染色疊加結(jié)果；圖2 (D)示染氡(1 ) 120工作水平的大鼠肺組織線粒體DNA探針雜交檢測結(jié)果；圖2(E)示染氡(foi)120工作水平的大鼠肺組織 DAPI染細(xì)胞核結(jié)果；圖2(F)示染氡(foi)120工作水平的大鼠肺組織線粒體DNA探針雜交和DAPI染色疊加結(jié)果；虛線圓圈內(nèi)可見熒光信號，表明能檢測到線粒體基因整合到細(xì)胞核中。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供了一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法，包括如下步驟
獲得組織切片，經(jīng)預(yù)處理后獲得第一切片；設(shè)計(jì)長度為50 70bp的探針并用熒光素標(biāo)記；所述探針序列與所述線粒體DNA 序列互補(bǔ)；取無關(guān)DNA與所述第一切片混合后獲得第二切片；取所述探針與所述第二切片混合，雜交、復(fù)染，熒光顯微檢測；所述無關(guān)DNA與所述線粒體DNA不結(jié)合。原位檢測小鼠線粒體DNA整合到核基因組時(shí)，探針序列如SEQ ID NO :1所示，無關(guān) DNA序列如SEQ ID NO 2所示。原位檢測大鼠線粒體DNA整合到核基因組時(shí)，探針序列如SEQ ID NO :3所示，無關(guān) DNA序列如SEQ ID NO 2所示。作為優(yōu)選，雜交為在65 85°C雜交5min，置于40 45°C雜交10 14h。作為優(yōu)選，所述熒光素包括異硫氰酸熒光素(FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC)、四乙基羅丹明(RB200)、量子點(diǎn)(quantum dot)、Cy3或Cy5中的一種或兩者以上的混合物。20 X SSC 配方如下=Na3Citrate2H2O 88. 2g ；NaCl 175. 5g ；DEPC H2O 至 1L。稀釋 10 倍得到2 X SSC。作為優(yōu)選，預(yù)處理包括除蛋白、除RNA的步驟。優(yōu)選地，預(yù)處理具體為采用終濃度為100 300 μ g/ml的蛋白酶K，35 40°C下孵育15 45min，采用終濃度為50 200 μ g/ml的RNAse，37°C下孵育15min。優(yōu)選地，預(yù)處理還包括采用終濃度為0. 2mol/L的NaCl溶液，60°C處理Ih的步驟。作為優(yōu)選，預(yù)處理還包括在15 35°C下于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；甲醛固定IOmin ；依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2min，自然干燥的步驟。本發(fā)明提供一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法。該方法能夠度線粒體DNA整合到核基因組中進(jìn)行原位檢測，特異性好。本發(fā)明提供的一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法中，所用原料、 試劑均可由市場購得。其中，探針由上海生工生物工程有限公司合成。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例1正常小鼠和8Gy X射線照射的小鼠小腸組織mtDNA整合入核基因組檢測(1)組織用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片3_5μπι，置于載玻片上。(2)組織置于65°C烘烤過夜。(3)將組織切片置于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%的乙醇中5分鐘。(4)將組織切片依次室溫置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇各2分鐘脫水。最后將玻片置于去離子水中3分鐘。(5)室溫下于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(6)采用終濃度為200 μ g/ml的蛋白酶K工作液，37°C下孵育30分鐘；然后采用終濃度為100 μ g/ml的RNAse工作液，37°C下孵育15分鐘；再將載玻片放入終濃度為0. 2M 的NaCl溶液中，60°C處理1小時(shí)。(7)室溫下于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。
(8)甲醛固定10分鐘。(9)將組織切片依次室溫置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2分鐘，自然干燥玻片。(10)合成靶向小鼠線粒體基因的探針，序列如SEQ ID NO :1所示，并采用FITC熒光素在探針的上下游末端均進(jìn)行標(biāo)記。將無關(guān)DNA (序列如SEQ ID NO 2所示)稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，混合5min后，將熒光標(biāo)記的DNA探針稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片。73°C雜交5分鐘，置于42°C中雜交過夜。(11)移去蓋玻片，將載波片置于0. 3% NP-40-2XSSC溶液中，漂洗1-2分鐘。(12)自然干燥玻片，采用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察玻片。結(jié)果顯示在正常小鼠的小腸組織中，熒光信號分布在細(xì)胞核周圍，見圖1(A)，在細(xì)胞核中沒有熒光信號，見圖1(A)、圖I(B)和圖1(C)，表明熒光探針可與細(xì)胞質(zhì)中的線粒體的DNA雜交，而不會(huì)與正常的細(xì)胞核基因組中的DNA序列雜交。而在8Gy X射線照射后的小鼠的小腸組織中，在虛線圈所示的細(xì)胞的細(xì)胞核中能觀察到熒光信號，見圖1(D)、圖I(E) 和圖1(F)，表明在8Gy X射線照射后的小鼠的小腸組織中能檢測到線粒體的DNA整合到了細(xì)胞核中。實(shí)施例2正常大鼠和染氡0 ) 120工作水平的大鼠肺組織mtDNA整合入核基因組檢測。(1)組織用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片3_5μπι，置于載玻片上。(2)組織置于65°C烘烤過夜。(3)將組織切片置于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%的乙醇中5分鐘。(4)將組織切片依次室溫置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇各2分鐘脫水。最后將玻片置于去離子水中3分鐘。(5)室溫下于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(6)采用終濃度為200yg/ml的蛋白酶K工作液，37°C下孵育30分鐘；然后采用終濃度為100 μ g/ml的RNAse工作液，37°C下孵育15分鐘；再將載玻片放入終濃度為0. 2M 的NaCl溶液中，60°C處理1小時(shí)。(7)室溫下于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(8)甲醛固定10分鐘。(9)將組織切片依次室溫置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2分鐘，自然干燥玻片。(10)合成靶向大鼠線粒體基因的探針(序列如SEQ ID NO 3所示)，并采用FITC 熒光素在DNA的上下游末端均進(jìn)行標(biāo)記。將無關(guān)DNA (5，-序列如SEQ ID NO 2所示-3，)稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，混合5min后，將熒光標(biāo)記的DNA探針稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片。76V雜交5分鐘，置于42°C中雜交過夜。(11)移去蓋玻片，將載波片置于0. 3% NP-40-2XSSC溶液中，漂洗1-2分鐘。(12)自然干燥玻片，采用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察玻片。
結(jié)果顯示在正常大鼠的肺組織中，細(xì)胞個(gè)體較小，熒光信號分布在細(xì)胞核周圍，見圖2(A)，在細(xì)胞核[DAPI染色，圖2⑶]中沒有熒光信號，見圖2(A)和圖2(C)，表明熒光探針可與細(xì)胞質(zhì)中的線粒體的DNA雜交，而不會(huì)與正常的細(xì)胞核基因組中的DNA序列雜交。而在染氡(I n)120工作水平的大鼠肺組織中，在虛線圈所示的細(xì)胞的細(xì)胞核中能觀察到熒光信號，見圖2(D)、圖2(E)和圖2(F)，表明在染氡(foi)120工作水平的大鼠肺組織中能檢測到線粒體的DNA整合到了細(xì)胞核中。實(shí)施例3正常小鼠和8Gy X射線照射的小鼠小腸組織mtDNA整合入核基因組檢測(1)組織用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片3_5μπι，置于載玻片上。(2)組織置于65°C烘烤過夜。(3)將組織切片置于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%的乙醇中5分鐘。(4)將組織切片依次室溫置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇各2分鐘脫水。最后將玻片置于去離子水中3分鐘。(5)室溫下于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(6)采用終濃度為100yg/ml的蛋白酶K工作液，35°C下孵育45分鐘；然后采用終濃度為50μ g/ml的RNAse工作液，37°C下孵育15分鐘；再將載玻片放入終濃度為0. 2M 的NaCl溶液中，60°C處理1小時(shí)。(7)室溫下于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(8)甲醛固定10分鐘。(9)將組織切片依次室溫置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2分鐘，自然干燥玻片。(10)合成靶向小鼠線粒體基因的探針(序列如SEQ ID NO :1所示)，并采用FITC 熒光素在探針的上下游末端均進(jìn)行標(biāo)記。將無關(guān)DNA (序列如SEQ ID NO 2所示)稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，混合5min后，將熒光標(biāo)記的DNA探針稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片。65°C雜交5分鐘，置于45°C中雜交過夜(IOh)。(11)移去蓋玻片，將載波片置于0. 3% NP-40-2XSSC溶液中，漂洗1-2分鐘。(12)自然干燥玻片，采用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察玻片。結(jié)果顯示在正常小鼠的小腸組織中，熒光信號分布在細(xì)胞核周圍，在細(xì)胞核中沒有熒光信號，表明熒光探針可與細(xì)胞質(zhì)中的線粒體的DNA雜交，而不會(huì)與正常的細(xì)胞核基因組中的DNA序列雜交。而在8Gy X射線照射后的小鼠的小腸組織中，在虛線圈所示的細(xì)胞的細(xì)胞核中能觀察到熒光信號，表明在8Gy X射線照射后的小鼠的小腸組織中能檢測到線粒體的DNA整合到了細(xì)胞核中。實(shí)施例4正常大鼠和染氡0 ) 120工作水平的大鼠肺組織mtDNA整合入核基因組檢測。(1)組織用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片3_5μπι，置于載玻片上。(2)組織置于65°C烘烤過夜。(3)將組織切片置于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%的乙醇中5分鐘。
(4)將組織切片依次室溫置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇各2分鐘脫水。最后將玻片置于去離子水中3分鐘。(5)室溫下于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(6)采用終濃度為300yg/ml的蛋白酶K工作液，40°C下孵育15分鐘；然后采用終濃度為200 μ g/ml的RNAse工作液，37°C下孵育15分鐘；再將載玻片放入終濃度為0. 2M 的NaCl溶液中，60°C處理1小時(shí)。(7)室溫下于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(8)甲醛固定10分鐘。(9)將組織切片依次室溫置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2分鐘，自然干燥玻片。(10)合成靶向大鼠線粒體基因的探針(序列如SEQ ID NO 3所示)，并采用FITC 熒光素在DNA的上下游末端均進(jìn)行標(biāo)記。將無關(guān)DNA (序列如SEQ ID NO 2所示)稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，混合5min后，將熒光標(biāo)記的DNA探針稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片。70°C雜交5分鐘，置于40°C中雜交過夜(14h)。(11)移去蓋玻片，將載波片置于0.3% NP-40-2XSSC溶液中，漂洗1_2分鐘。(12)自然干燥玻片，采用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察玻片。結(jié)果顯示在正常大鼠的肺組織中，細(xì)胞個(gè)體較小，熒光信號分布在細(xì)胞核周圍在細(xì)胞核中沒有熒光信號，表明熒光探針可與細(xì)胞質(zhì)中的線粒體的DNA雜交，而不會(huì)與正常的細(xì)胞核基因組中的DNA序列雜交。而在染氡(foi)120工作水平的大鼠肺組織中，在虛線圈所示的細(xì)胞的細(xì)胞核中能觀察到熒光信號，表明在染氡0 ) 120工作水平的大鼠肺組織中能檢測到線粒體的DNA整合到了細(xì)胞核中。實(shí)施例5正常小鼠和8Gy X射線照射的小鼠小腸組織mtDNA整合入核基因組檢測(1)組織用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片3_5μπι，置于載玻片上。(2)組織置于65°C烘烤過夜。(3)將組織切片置于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%的乙醇中5分鐘。(4)將組織切片依次室溫置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇各2分鐘脫水。最后將玻片置于去離子水中3分鐘。(5)室溫下于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(6)采用終濃度為150yg/ml的蛋白酶K工作液，37°C下孵育38分鐘；然后采用終濃度為150 μ g/ml的RNAse工作液，37°C下孵育15分鐘；再將載玻片放入終濃度為0. 2M 的NaCl溶液中，60°C處理1小時(shí)。(7)室溫下于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(8)甲醛固定10分鐘。(9)將組織切片依次室溫置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2分鐘，自然干燥玻片。(10)合成靶向小鼠線粒體基因的探針(序列如SEQ ID NO :1所示)，并采用FITC 熒光素在探針的上下游末端均進(jìn)行標(biāo)記。
將無關(guān)DNA(序列如SEQ ID NO 2所示)稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，混合5min后，將熒光標(biāo)記的DNA探針稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片。85°C雜交5分鐘，置于43°C中雜交過夜(1池)。(11)移去蓋玻片，將載波片置于0.3% NP-40-2XSSC溶液中，漂洗1_2分鐘。(12)自然干燥玻片，采用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察玻片。結(jié)果顯示在正常小鼠的小腸組織中，熒光信號分布在細(xì)胞核周圍，在細(xì)胞核中沒有熒光信號，表明熒光探針可與細(xì)胞質(zhì)中的線粒體的DNA雜交，而不會(huì)與正常的細(xì)胞核基因組中的DNA序列雜交。而在8Gy X射線照射后的小鼠的小腸組織中，在虛線圈所示的細(xì)胞的細(xì)胞核中能觀察到熒光信號，表明在8Gy X射線照射后的小鼠的小腸組織中能檢測到線粒體的DNA整合到了細(xì)胞核中。實(shí)施例6正常大鼠和染氡0 ) 120工作水平的大鼠肺組織mtDNA整合入核基因組檢測。(1)組織用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片3_5μπι，置于載玻片上。(2)組織置于65°C烘烤過夜。(3)將組織切片置于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%的乙醇中5分鐘。(4)將組織切片依次室溫置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇各2分鐘脫水。最后將玻片置于去離子水中3分鐘。(5)室溫下于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(6)采用終濃度為250yg/ml的蛋白酶K工作液，38°C下孵育20分鐘；然后采用終濃度為100 μ g/ml的RNAse工作液，37°C下孵育15分鐘；再將載玻片放入終濃度為0. 2M 的NaCl溶液中，60°C處理1小時(shí)。(7)室溫下于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。(8)甲醛固定10分鐘。(9)將組織切片依次室溫置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各2分鐘，自然干燥玻片。(10)合成靶向大鼠線粒體基因的探針(序列如SEQ ID NO 1所示)，并采用FITC 熒光素在DNA的上下游末端均進(jìn)行標(biāo)記。將無關(guān)DNA (序列如SEQ ID NO 2所示)稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，混合5min后，將熒光標(biāo)記的DNA探針稀釋到0. 2 μ M，取10 μ L混勻后滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片。80°C雜交5分鐘，置于45°C中雜交過夜(Ilh)。(11)移去蓋玻片，將載波片置于0.3% NP-40-2XSSC溶液中，漂洗1_2分鐘。(12)自然干燥玻片，采用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察玻片。結(jié)果顯示在正常大鼠的肺組織中，細(xì)胞個(gè)體較小，熒光信號分布在細(xì)胞核周圍，在細(xì)胞核中沒有熒光信號，表明熒光探針可與細(xì)胞質(zhì)中的線粒體的DNA雜交，而不會(huì)與正常的細(xì)胞核基因組中的DNA序列雜交。而在染氡(foi)120工作水平的大鼠肺組織中，在虛線圈所示的細(xì)胞的細(xì)胞核中能觀察到熒光信號，表明在染氡0 ) 120工作水平的大鼠肺組織中能檢測到線粒體的DNA整合到了細(xì)胞核中。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法，其特征在于，包括如下步驟獲得組織切片，經(jīng)預(yù)處理后獲得第一切片；設(shè)計(jì)長度為50 70bp的探針并用熒光素標(biāo)記；所述探針序列與所述線粒體DNA序列互補(bǔ)；取無關(guān)DNA與所述第一切片混合后獲得第二切片；取所述探針與所述第二切片混合，雜交、復(fù)染，熒光顯微檢測；所述無關(guān)DNA與所述線粒體DNA不結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述線粒體DNA為小鼠線粒體DNA，所述探針序列如SEQ ID NO 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述線粒體DNA為大鼠線粒體DNA，所述探針序列如SEQ ID NO 3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述無關(guān)DNA序列如SEQIDN0:2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述雜交為在65 85°C雜交5min，置于 40 45°C雜交10 14h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光素包括異硫氰酸熒光素、四甲基異硫氰酸羅丹明、四乙基羅丹明、量子點(diǎn)、Cy3、Cy5中的一種或兩者以上的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理包括除蛋白、除RNA的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理具體為采用終濃度為100 300 μ g/ml的蛋白酶K，;35 40°C下孵育15 45min，采用終濃度為50 200 μ g/ml的 RNAse，37°C 下孵育 15min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理還包括取采用終濃度為 0. 2mol/L 的 NaCl 溶液，60°C處理 Ih0
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理還包括在15 35°C下于 2X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；甲醛固定IOmin ；依次置于70%乙醇、85%乙醇和 100%乙醇各2min，自然干燥的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種原位檢測線粒體DNA整合到核基因組中的方法。該方法能夠度線粒體DNA整合到核基因組中進(jìn)行原位檢測，特異性好。
文檔編號C12Q1/68GK102534018SQ20121002179
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月31日
發(fā)明者張舒羽, 曹建平, 曹毅, 童建 申請人:蘇州大學(xué)