專利名稱：一株對草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一株具有固氮作用及高抗草甘膦能力的克雷伯氏細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
充分發(fā)揮農(nóng)業(yè)微生物資源寶庫的作用，積極發(fā)掘新的生防微生物資源是農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)研究的重要內(nèi)容。近年來，大量施用化肥、農(nóng)藥造成的資源浪費及土壤、地下水體污染已引起了世界各國的廣泛重視。利用生物固氮是減少氮肥施用量最為有效的途徑， 生物固氮資源的研究、開發(fā)和利用在我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位。聯(lián)合固氮效率雖不及共生固氮高，但其分布廣，受益作物多，因而是一類不可忽視的固氮體系。目前已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)具有重要價值的作物如甘蔗、水稻、小麥、玉米、牧草等禾本科植物均可與固氮菌進(jìn)行聯(lián)合固氮作用。聯(lián)合固氮菌除了能為宿主提供氮素以外，還同時具有分泌生長素、溶磷、增強(qiáng)植株抗病性、抗逆境等多方面的促進(jìn)植物生長的作用。針對長期單一施用化學(xué)肥料帶來的土壤肥力下降，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降和農(nóng)業(yè)環(huán)境污染加劇等一系列對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的負(fù)面影響，積極發(fā)掘和利用聯(lián)合固氮作用的潛力對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展更具特殊的意義。草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型，廣譜滅生性除草劑，對40多種一年生，多年生，單子葉和雙子葉木本，草本植物有殺傷作用，對多年生草的地下組織破壞力尤強(qiáng)，廣泛用于橡膠園，果樹，茶園，桑園，甘蔗田和林業(yè)除草。草甘膦理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、不破壞土壤環(huán)境、對大多數(shù)植物具有滅生性等其它除草劑所不可比擬的優(yōu)點，是全世界除草劑使用量最大的品種之一。但是草甘膦在殺滅雜草的同時對農(nóng)作物同樣有著殺死作用，從而限制了其使用范圍和使用時間。草甘膦進(jìn)入植物體內(nèi)，抑制5—烯醇丙酮基莽草酸一 3 一磷酸合酶(EPSP合酶)，使植物不能合成它生存所必需的某些芳香氨基酸，導(dǎo)致植物死亡。而人及動物與植物的代謝不同不需要合成那些芳香氨基酸，因此草甘膦對人及動物安全。生物降解是草甘膦降解的最主要途徑。許多微生物對草甘膦具有降解作用，草甘膦微生物降解的主要中間產(chǎn)物是毒性極低的氨甲基磷酸(AMPA)，最終產(chǎn)生為水、二氧化碳與磷酸。在自然環(huán)境中特別是在長期使用草甘膦等除草劑地區(qū)的土壤中，存在種類繁多的能耐受或降解草甘膦的細(xì)菌。單株細(xì)菌降解草甘膦的研究從八十年代初開始，在根瘤菌科、節(jié)桿菌、肺炎克氏桿菌等均分離到草甘膦降解菌。在土壤、垃圾和水體樣品中也能分離到高抗或降解草甘膦的細(xì)菌菌株。若將來源于微生物的草甘膦抗性基因克隆后轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，可加強(qiáng)植物對草甘膦的抗性，或增加植物降解甘膦的能力，從而可解除草甘膦對農(nóng)作物的危害。如果能有高抗或降解草甘膦的農(nóng)作物出現(xiàn)，則既能大大地節(jié)省農(nóng)業(yè)生產(chǎn)費用，又能極大地促進(jìn)草甘膦工業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的針對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐的實際問題和需要，篩選出對甘蔗生長具有顯著促進(jìn)作用，同時對草甘膦具有高抗活性的聯(lián)合固氮菌，為研制促甘蔗生長微生物菌劑及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的研究、應(yīng)用提供新的微生物資源。本發(fā)明采取的技術(shù)方案
本發(fā)明所述的甘鹿內(nèi)生固氮菌屬于克雷伯氏菌(Klebsiella sp.),該菌株已于2011年11月3日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 5439。該菌株由甘蔗根際分離獲得，通過無氮培養(yǎng)基篩選、固氮酶活性測定、固氮酶基因nifH擴(kuò)增及序列分析，確定其為聯(lián)合固氮菌；經(jīng)菌株形態(tài)、16S rDNA序列分析，把該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)細(xì)菌。菌株命名為GG08160，其最適生長溫度為30°C，最適生長pH為7. O 7. 2。本發(fā)明菌株GG08160具有聯(lián)合固氮能力及降解無機(jī)磷的功能，對甘蔗幼苗生長具 有顯著促進(jìn)作用，在草甘膦含量達(dá)250mM的培養(yǎng)基質(zhì)中仍能正常生長，具有高抗草甘膦的活性，具有良好的應(yīng)用前景，可作為植物生長的促生菌，同時可為草甘膦的生物降解研究提供新的微生物資源或基因資源，為促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供資源和保障。


圖I菌株GG08160在不同濃度草甘膦液體培養(yǎng)基中的生長情況；
圖2菌株GG08160在Pikovaskaia’ s培養(yǎng)基平板上的生長情況；
圖3菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進(jìn)作用(增加植株的干重);
圖4菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進(jìn)作用(增加植株含氮量)；
圖5菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進(jìn)作用(植株長勢及聯(lián)合固氮效率)。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明。實施例I本發(fā)明菌株的分離
稱取附著在甘鹿根表土 5g放入45mL滅菌水中，搖床上180r/min, 28°C恒溫振蕩30min分散微生物細(xì)胞，靜置lOmin，即得KT1稀釋液，用滅菌水10倍系列稀釋，各取100 μ L涂在Ashby 培養(yǎng)基(成分為蔗糖 10g, NaCl O. 2g，KH2PO4 O. 2g，MgSO4 · 7H20 O. 2g，CaSO4 · 2H20O.lg，CaCO3 5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0)平板上，在28°C培養(yǎng)2_3d至長出單菌落。用接種針挑取不同單菌落，在Ashby平板上劃線純化3次得到單一菌落。將純化后的單菌落接種于LB培養(yǎng)基(成分為胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH 7.0)平板上，4°C存放，供近期使用；純化的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將菌液與終濃度為15%甘油混合，_80°C冰箱長期保存。實施例2本發(fā)明菌株的固氮酶活性
采用乙炔還原乙烯法(acetylene reduction assay,ARA)測定固氮酶活性。將GG08160活化后在Ashby液體培養(yǎng)基中生長48h，取ImL菌液接種于滅菌的含IOmL Ashby液體培養(yǎng)基的60mL磨口小口瓶中，培養(yǎng)24h后從瓶內(nèi)抽出5mL氣體，然后再注入5mL乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用氣相色譜儀檢測乙烯生成量，以nmolC2H4/h. mL表示固氮酶活性。以巴西甘蔗內(nèi)生固氮菌G. diazotrophicus PAL5為陽性對照，以接種ImL滅活菌液的處理作為空白對照。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明菌株的固氮酶的乙炔還原乙烯活性為1632nmol C2H4/h，與陽性對照巴西甘鹿內(nèi)生固氮菌模式菌株G. diazotrophicus PAL5的固氮酶活性1675nmol
C2H4/h 相當(dāng) ο實施例3本發(fā)明菌株的nifH基因及16S rDNA的克隆分析
PCR擴(kuò)增模板的制備將菌株GG08160活化后接種到LB液體培養(yǎng)基(成分為胰蛋白胨IOg,酵母浸出物5g,氯化鈉IOg,蒸懼水IOOOmL, pH 7. O),培養(yǎng)20h后離心收集菌體備用。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按產(chǎn)品說明書從新鮮的細(xì)菌LB培養(yǎng)物中提取本發(fā)明菌株的基因組DNA，保存于-20°C，DNA含量約為50_100ng/ μ L。nifH 基因分析擴(kuò)增引物為 PolyF (TGCGAYCCSAARGCBGACTC)和 PolyR (ATSGCCATCATYTCRCCGGA)，PCR 反應(yīng)程序為94°C 3min 預(yù)變性，然后進(jìn)行 94°C Imin，55 °Clmin，72°C lmin，30個循環(huán)，最后72°C IOmin0 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以固氮葡糖醋酸桿菌G. diazotrophicus PAL5菌株(Gillis et al. , 1989)為陽性對照，以大腸桿菌E. coli DH5a菌株為陰性對照。將nifH擴(kuò)增產(chǎn)物回收以后克隆到T載體上，按寶生物工程(大連)有限公司(簡稱TaKaRa)的pMDTM18_T Vector克隆試劑盒說明來操作。經(jīng)PCR驗證的陽性克隆送上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果在GenBank登錄和比對分析。菌株的16S rDNA序列分析利用細(xì)菌16S通用引物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)擴(kuò)增細(xì)菌的 16S rRNA 基因。PCR 反應(yīng)程序為94°C 3min預(yù)變性，然后進(jìn)行94°C 55s, 50°C 50s, 72°C lmin，35個循環(huán)，最后72°C IOmin0 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物回收以后克隆到T載體上，選擇陽性克隆送上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果在GenBank登錄和比對分析。nifH PCR擴(kuò)增得到的片段測序分析結(jié)果表明GG08160菌株含有鑰鐵固氮酶鐵蛋白基因nifH序列(登錄號FJ823000) ；16S rDNA序列分析結(jié)果(登錄號FJ823051)表明本發(fā)明菌株與克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)細(xì)菌的同源性達(dá)98%。綜合菌株的菌落形態(tài)、nifH基因及16S rDNA的序列分析結(jié)果，將本發(fā)明菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)細(xì)菌。實施例4本發(fā)明菌株對草甘膦的耐受能力測定
以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向LB液體培養(yǎng)基中加入草甘膦銨鹽(購自廣西自主化工有限公司)，配制含草甘膦終濃度分別為0，50，100，150，200，250，300mM的系列培養(yǎng)基。菌株GG08160接種到LB液體培養(yǎng)基于30°C，180rpm培養(yǎng)24h作為母液，取20 μ L母液加入50mL上述含不同濃度草甘膦的培養(yǎng)基中，30°C, 180rpm條件下培養(yǎng)48h后,測定培養(yǎng)液的OD600。測定結(jié)果見圖1，GG08160對草甘膦具有較強(qiáng)的耐受能力，在草甘膦濃度達(dá)250mM的培養(yǎng)基上能保持良好的生長，在300mM草甘膦培養(yǎng)上仍有少量生長。實施例5本發(fā)明菌株對無機(jī)磷的降解特性
待測菌株活化培養(yǎng)后取Iml菌液，IOOOOrpm離心5min，除去上清，然后用滅菌水IOOOOrpm離心5min洗菌2次，用滅菌水稀釋10倍得到菌懸液。取供試菌株菌懸液10 μ I點接種于盛有 Pikovaskaia’s 培養(yǎng)基(成分葡萄糖 10g, (NH4)2SO4 0. 5g，NaCl 0. 3g，KClO. 3g, MgSO4 · 7H20 0. 3g, MnSO4 · 4H20 0. 03g, FeSO4 · 7H20 0. 03g, Ca3(PO4)2 5g,瓊脂粉 15g,蒸餾水1000mL，pH 7.0)的培養(yǎng)皿中，重復(fù)4次，置于28°C下培養(yǎng)3d。觀察接種菌株周圍有無透明圈形成，測量透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的大小，根據(jù)溶磷圈的透明度D/d的比值大小判斷細(xì)菌解磷能力強(qiáng)弱。實驗結(jié)果見圖2,GG08160菌株可在Pikovaskaia’ s平板培養(yǎng)基上形成透明圈,表明該菌株可分泌一些酸性物質(zhì)，并向周圍的培養(yǎng)基擴(kuò)散，使菌落周圍的磷酸鹽[Ca3 (PO4) 2]溶解，即該菌株具有降解無機(jī)磷特性，菌株的溶磷圈直徑D (菌落+透明圈)與菌落直徑(d)的比值(D/d)為I. 32。實施例6本發(fā)明菌株對甘蔗組培苗生長的促進(jìn)作用
供試菌株分別為GG08160以及巴西甘鹿內(nèi)生固氮菌G. diazotrophicus PAL5菌株。以蛭石甘蔗組培苗移栽后的栽培基質(zhì)，按比例每kg基質(zhì)加入IOmg (15NH4) 2S04 (15N原子百分超
10.11)，分裝到塑料盆中。將供試菌株分別活化后在LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，用滅菌水懸浮離心清洗2次后稀釋到每毫升1-2X IO8個細(xì)胞。將煉苗后生長一致的甘蔗組培苗移栽到裝有栽培基質(zhì)的塑料盆中，每盆澆入上述供試菌株GG08160的菌懸液IOOmL,置于28V、光周期14h光-IOh暗光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。IOd后再以IOOmL同樣濃度的菌懸液灌根接種，繼續(xù)在限菌條件下培養(yǎng)。以接種等量同樣濃度的PAL5菌株的菌懸液為陽性對照，空白對照接種等量滅菌水。50d后對甘蔗組培苗的生長情況進(jìn)行記錄，收獲植株并洗凈栽培基質(zhì)，冷凍干燥后測定植株干重、含氮量及15N含量，計算固氮效率。固氮效率根據(jù)公式Ndfa =100X [l-(atom% 15N接種植株/atom% 15N對照植株)]計算。試驗測定結(jié)果表明接種GG08160能顯著促進(jìn)甘蔗組培苗的生長(圖3_圖5)，甘蔗組培苗的干重和總氮含量分別比空白對照增加了 42. 56%和38. 64% (圖3、圖4);植株從空氣中獲得氮的百分率(固氮效率)平均為9. 75% (圖5);而接種PAL5菌株的甘蔗組培苗的干重及總氮含量增長率分別為29. 35%和35. 25%，固氮效率為10. 09%。
權(quán)利要求
1.一株對草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌，其特征在于菌株命名為GG08160，具有高抗草甘膦的活性，能與甘蔗聯(lián)合固氮并顯著促進(jìn)甘 蔗幼苗的生長。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株具有固氮作用及高抗草甘膦能力的克雷伯氏細(xì)菌及其應(yīng)用。該菌株由甘蔗根際分離獲得，通過無氮培養(yǎng)基篩選、固氮酶活性測定、固氮酶基因nif H擴(kuò)增及序列分析，確定其為聯(lián)合固氮菌；經(jīng)菌株形態(tài)、16S rDNA序列分析，把該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)細(xì)菌。菌株命名為GG08160。本發(fā)明菌株具有聯(lián)合固氮能力及降解無機(jī)磷的功能，對甘蔗幼苗生長具有顯著促進(jìn)作用，在草甘膦含量達(dá)250mM的培養(yǎng)基質(zhì)中仍能正常生長，具有高抗草甘膦的活性，具有良好的應(yīng)用前景，可作為植物生長的促生菌，同時為草甘膦的生物降解研究提供新的微生物資源或基因資源，為促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供資源和保障。
文檔編號C12R1/22GK102965296SQ20121002982
公開日2013年3月13日 申請日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者胡春錦, 李楊瑞, 史國英, 林麗, 魏源文, 鄧智年, 李楠 申請人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所