專利名稱：副溶血性弧菌多重定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一種革蘭陰性嗜鹽性弧菌,是弧菌屬內比較重要的致病菌之一，主要存在于近海岸的魚貝類等海產品、海水及其沉積物中， 是沿海地區夏、秋季食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌，可引起急性胃腸道癥狀。目前副溶血性弧菌的發病率已居各種微生物食源性疾病之首，并明顯高于位居第二的沙門菌食物中毒，尤其在沿海地區的發病率更是居高不下。據報道，副溶血性弧菌菌體攜帶多種毒素基因，這些基因表達的毒素蛋白是造成食物中毒的主要原因。傳統的副溶血性弧菌的鑒定方法主要包括分離培養、生化試驗、血清分型等，因其操作復雜、周期長，已不能滿足目前實際工作(傳染病現場診斷、流行趨勢分析等)的需要，而且對于毒素的診斷多使用經典細胞學手段，無法實現標準化判定。因此建立一種快速、敏感、特異的檢測和鑒定相關毒素的方法對預防和控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期診斷具有十分重要的意義。副溶血弧菌的tdh (耐熱直接溶血毒素)、tlh (不耐熱溶血毒素)、toxR(毒素表達調控蛋白基因)和 trh (耐熱直接相關溶血毒素)是目前報道該菌攜帶的主要毒素基因，與海產品食物中毒具有密切關系，準確和快速的明確病原是有效預防傳染病大面積發生和傳播的前提和基礎。 實時熒光定量PCR是近幾年發展起來的新型檢測技術，具有快速、準確、可定量等優勢，其中TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、復合探針、染料及分子信標等方法目前已成功應用到病原菌分子診斷領域。

發明內容
本發明目的是提供一種副溶血性弧菌四種相關毒素基因的多重熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，能夠對副溶血性弧菌四種相關毒素基因進行準確、有效地甄別。本發明采用的技術方案收是一種副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR檢測試劑盒，主要包括特異性引物和探針以及PCR反應試劑，所述特異性引物和探針由副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、 不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因(trh)的特異性引物和探針組成tdh 上游引物5' -TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3'；tdh 下游引物5' -TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3'；tdh熒光探針5' -FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3'；tlh 上游引物5' -CCAGAAGAGCACGGTTTC-3'；tlh 下游引物5' -GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3'；tlh熒光探針
5' -VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3'；
toxR 上游引物5' -TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3'；
toxR 下游引物5' -TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3'；
toxR突光探針
5' -R0X-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3'；
trh 上游引物5' -TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3'；
trh 下游引物5' -CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3'；
trh突光探針
5' -CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3'；
其中FAM、VIC、ROX和CY5為不同波長的熒光報告基團，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團。
本發明的關鍵在于擴增引物的設計，試劑盒中其他組成，可按本領域常規進行選
擇。PCR反應試劑包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR緩沖液可采用市購商品，也可自行配制，例如將Tris-HCl、KC1、MgCl2等按比例混合進行配制， 進行檢測時，將PCR反應試劑和擴增引物和探針混合，再加入待測樣品或對照品，即可進行 PCR擴增反應。為達到定量檢測的目的，所述試劑盒還可包括副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因 (tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因 (trh)的標準品,所述標準品序列如下tdh 標準品tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca ；tlh標準品 ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc ；toxR 標準 品ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca ；trh 標準 品tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt eg。本發明還涉及一種副溶血性弧菌毒素基因多重熒光定量PCR檢測方法，所述方法包括(I)提取待測樣品DNA ；(2)以待測樣品DNA為模板，加入副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因(trh)的特異性引物和探針，PCR緩沖液，脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反應液，進行PCR 擴增，以非靶細菌為陰性對照于相同條件下進行PCR擴增，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數增長，則判斷為陽性；所述特異性引物和探針如前所述。為達到定量檢測的效果，所述方法可同時以副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因 (tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因 (trh)標準品的梯度濃度的DNA溶液進行熒光PCR檢測，分別根據拷貝濃度的對數值與各標準品Ct值的關系繪制得到標準曲線，測得樣品DNA的Ct值后，對照相應標準曲線獲得樣品 DNA中相應基因的拷貝濃度；所述標準品序列如前所述。所述PCR反應條件如下95°C預變性5分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒進行40個循環
擴增，最后置4°C。熒光采集在每個循環的退火溫度時進行。本發明的有益效果主要體現在本發明針對副溶血弧菌毒素基因提供了一種快速、敏感、特異的多重熒光定量PCR檢測試劑盒和檢測方法，為及時控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期診斷提供了基礎。


圖I 為標準品檢測結果;1 7 分別為 30ng、3ng、0. 3ng、30pg、3pg、0. 3pg、30fg/ uL標準品；圖2為四種毒素基因對應的標準曲線'Y :對應的Ct值；X :基因的質量數。圖3為陽性菌株DNA檢測結果；1為tdh基因，2為toxR基因，3為tlh基因，4為 trh基因。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例I :標準品的犾得I、材料pGEM-T-Easy克隆系統、PCR相關試劑及Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司， 377 型測序儀(ABI 公司)、Bio-Rad icycler PCR 儀(Bio-Rad 公司)、ABI7500 fast 定量 PCR儀(ABI公司)。2、引物及探針設計與合成以副溶血性弧菌tdh(耐熱直接溶血素)基因(Genbank注冊號為⑶971653)、 tlh (不耐熱溶血素)基因(Genbank注冊號為AY829372)、toxR(毒素表達調控蛋白)基因(Genbank注冊號為JN188468)和trh(耐熱相關溶血素)基因(Genbank注冊號為 DQ359749)為模板，使用Primer Express TM(V3. 0，美國ABI公司)軟件分析TaqMan引物和探針位點，從中選擇最佳組合。由上海輝睿生物科技有限公司進行引物和探針的合成與純化。3、陽性參考品的制備以副溶血性弧菌標準株(ATCC 17802)做為模板，用DNA提取試劑提取基因組DNA， 用分光光度計測定濃度，取I. O μ L (50ng/ μ L)做PCR反應模板，分別用上述的上下游引物在Bio-Rad icycler PCR儀上進行PCR擴增PCR反應液組成如下2 x PCR bufferlO.OfiL
上游引物(10pM)l^iL
下游引物(10pM)l^iL
DNA 聚合酶(5U/pL )0.2^iL
dNTPs (各 250mM)1.6^iL (dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質的量比 1: 1: 1: 1)
基因組 DNA ( 50ng/^iL )1 ^iL去離子水補足至20 U L。PCR條件為94°C 5分鐘變性，94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 30秒進行35個循環擴 增，最后于72°C延伸5分鐘后置4°C。PCR產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后即用克隆系統插入pGEM-T-Easy克隆載 體，并將陽性克隆經測序驗證。tdh (耐熱直接溶血素)、tlh(不耐熱溶血素)、toxR(毒素 表達調控蛋白)和trh(耐熱相關溶血素)基因對應的片段長度分別為100bp、81bp、89bp 和80bp片段，即為標準品，測定濃度并換算成質量/體積，分別命名為質粒tdh、tlh、toxR 和 trho4、結果經測序，上述設計標準品完全與預期相符，回收的標準品片段序列如下tdh (耐熱直接溶血素)基因標準品序列tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca。tlh(不耐熱溶血素)基因標準品序列 ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc。toxR(毒素表達調控蛋白)基因標準品序列ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca。trh(耐熱相關溶血素)基因標準品序列tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt eg。實施例2 :多重熒光定量PCR法檢測副溶血性弧菌四種相關毒素基因方法的建立1、質粒DNA及其他細菌DNA提取采用基因組DNA提取試劑提取細菌基因組DNA，采用質粒DNA提取試劑盒提取陽 性質粒DNA，分別取1. Oil L(50ng/ii L)做模板，用檢測用上下游引物在ABI7500 fast定量 PCR儀(ABI公司)上進行PCR擴增。PCR反應液組成如下IOx PCR buffer5 · O pL
tdh 上游引物(ΙΟμΜ)l.OpL
tdh 下游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
tlh 上游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
tlh 下游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
toxR 上游引物(ΙΟμΜ)2·4μ!ν
toxR 下游引物(ΙΟμΜ)2ΛμΙ
trh 上游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
trh 下游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
tdh 熒光探針(ΙΟμΜ)\ΛμL
tlh 熒光探針(ΙΟμΜ)\ΛμL
toxR 焚;光探針(ΙΟμΜ)\ΛμL
trh 熒光探針(ΙΟμΜ)\ΛμL
DNA 聚合酶(5U/pL )0.5pL
dNTPs (各 250mM)4·0μΙ^
(dATP, dTTP, dCTP、dGTP 物質的量比 I: I: I: I)
質粒 DNA (tdh、tlh、toxR、trh 各 50ng/pL)或模板 DNA去離子水補足至50 μ LoPCR反應條件為95°C預變性5分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒進行40個循環擴增， 最后置4°C，熒光采集在每個循環的退火溫度時進行。以非靶細菌志賀菌(ACCC04121)為陰性對照于相同條件下進行PCR檢測，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若待測模板熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數增長，則判斷為陽性。同時在相同條件下以不同濃度標準品進行檢測，并繪制標準曲線。待測DNA的測定結果經儀器處理根據標準曲線計算出檢測副溶血性弧菌含有 tdh (耐熱直接溶血素)、tlh (不耐熱溶血素)、toxR(毒素表達調控蛋白)和trh (耐熱相關溶血素)基因的數量。以腸出沙門氏菌(CICC21490)、血性大腸桿菌(EHEC)0157 :H7 (ATCC43889)，致病性大腸桿菌(EPEC) (ATCC 43887)，腸產毒性大腸桿菌(ETEC) (ATCC35401)，腸侵襲性大腸桿菌(EIEC) (ATCC 43893)，創傷弧菌(CICC 10383)等按照上述方法進行檢測，結果均為陰性，說明本發明方法特異性好。2.檢測結果標準品檢測結果參見圖1，標準曲線參見圖2，其中tdh基因標準方程(FAM) Y = -3. 5782Χ lgX+38. 406, R2 = O. 9695 ；toxR 基因標準方程(ROX) Y = -3. 9223XlgX+39. 3586, R2 = O. 9819 ；tlh 基因標準方程 (VIC) Y = -3. 6574XlgX+41. 3161, R2 = O. 9889 ；trh 基因標準方程(CY5) Y =-3. 7139XlgX+40. 0543，R2 = 0. 9987。陽性菌株DNA檢測結果見圖3 ;1為tdh基因，Ct值為26. 05，基因濃度為2. 84pg/ μ L ;2為toxR基因，Ct值為28. 30，基因濃度為O. 67pg/μ L ；3為tlh基因，Ct值為29. 62， 基因濃度為I. 59pg/ μ L ；4為trh基因，Ct值為29. 61，基因濃度為O. 65pg/y L。
權利要求
1.一種副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR檢測試劑盒，主要包括特異性引物和探針以及PCR反應試劑，所述特異性引物和探針由副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因(trh)的特異性引物和探針組成tdh 上游引物5' -TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3'； tdh 下游引物5' -TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3'； tdh突光探針5' -FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3'； tlh 上游引物5' -CCAGAAGAGCACGGTTTC-3'； tIh 下游引物5' -GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3'； tlh突光探針5' -VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3'； toxR 上游引物5' -TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3'； toxR 下游引物5' -TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3'； toxR突光探針5' -R0X-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3'； trh 上游引物5' -TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3'； trh 下游引物5' -CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3'； trh突光探針5' -CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3'；其中FAM、VIC、R0X和CY5為不同波長的熒光報告基團，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因(trh)的標準品，所述標準品序列如下tdh 標準 品tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca ；tlh 標準 品ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc ；toxR 標準品ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca ；trh標準品tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt eg。
3.一種副溶血性弧菌毒素基因多重熒光定量PCR檢測方法，所述方法包括(1)提取待測樣品DNA；(2)以待測樣品DNA為模板，加入副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因(trh)的特異性引物和探針，PCR緩沖液，脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反應液，進行PCR擴增，以非靶細菌為陰性對照于相同條件下進行PCR擴增，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數增長，則判斷為陽性；所述特異性引物和探針如下tdh 上游引物5' -TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3'； tdh 下游引物5' -TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3'； tdh突光探針5' -FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3'； tIh 上游引物5' -CCAGAAGAGCACGGTTTC-3'； tIh 下游引物5' -GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3'； tlh突光探針5' -VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3'； toxR 上游引物5' -TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3'； toxR 下游引物5' -TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3'； toxR突光探針5' -R0X-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3'； trh 上游引物5' -TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3'； trh 下游引物5' -CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3'； trh突光探針5' -CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3'；其中FAM、VIC、R0X和CY5為不同波長的熒光報告基團，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同時以副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因(trh)標準品的梯度濃度的DNA溶液進行熒光PCR檢測，分別根據拷貝濃度的對數值與各標準品Ct值的關系繪制得到標準曲線，測得樣品DNA的Ct值后，對照相應標準曲線獲得樣品DNA中相應基因的拷貝濃度；所述標準品序列如下tdh 標準 品tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca ；tlh 標準 品ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc ；toxR 標準品ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca ；trh標準品tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt eg。
5.如權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反應條件如下95°C預變性5分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒進行40個循環擴增，最后置4°C。
全文摘要
本發明提供了一種副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。所述試劑盒主要包括特異性引物和探針以及PCR反應試劑，所述特異性引物和探針由副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達調控蛋白基因(toxR)和耐熱相關溶血素基因(trh)的特異性引物和探針組成。本發明針對副溶血弧菌毒素基因提供了一種快速、敏感、特異的多重熒光定量PCR檢測試劑盒和檢測方法，為及時控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期診斷提供了基礎。
文檔編號C12Q1/06GK102605055SQ20121004206
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月23日 優先權日2012年2月23日
發明者葉菊蓮, 張政, 王復甦, 羅蕓, 金大智 申請人:浙江省疾病預防控制中心