專利名稱：利用酪丁酸梭菌發酵甘蔗渣水解液生產丁酸的工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及生產丁酸的工藝，尤其是利用酪丁酸梭菌發酵甘蔗渣水解液生產丁酸的工藝，屬于有機酸發酵技術領域。
背景技術：
正丁酸(Butyric acid，以下簡稱丁酸)，又名酪酸，分子中含有四個碳原子，是以直鏈型方式相連接的短鏈飽和脂肪酸，具有刺激性氣味，極稀溶液也有汗臭味。丁酸常以酯的形式或游離狀態存在于自然界中。丁酸是一種多用途的精細化學品，廣泛應用于食品、化學和醫藥等行業。在食品工業中配制糖果、飲料調味劑，在香料工業中用于配制果子香精； 丁酸纖維素在防老化、耐水性、收縮性等方面均優于醋酸纖維素；醋酸丁酸纖維素酯能溶于許多溶劑中，與樹脂、塑料互混能力比單醋酸纖維素酯強，并具有良好的耐熱、耐光和抗濕性；還能用于醫藥中間體的制備，如Y-氨基丁酸的抗缺氧能力顯著，(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多種血管緊張素轉化酶抑制劑的重要中間體，用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾病；此外，丁酸鈉鹽還可作為替代抗生素的飼料添加劑飼喂家禽，以促進生長。目前，丁酸的生產工藝以化學合成法為主，包括正丁醛氧化法、丙烯羰基合成法、 丁醇氧化法等，其中以間歇式丁醛氧化制備丁酸工藝在工業上的應用最為廣泛，但工藝復雜操作條件苛刻，環境污染嚴重等傳統化工普遍存在的問題沒有得到有效解決。隨著化石性資源日漸枯竭、傳統化工造成環境的嚴重污染以及人們對生物基化學品和生物能源需求的快速增加，化學工業呈現出從石油基到生物基的轉變趨勢。在這一轉變過程中，可再生生物質資源利用和生物加工是一個重大的研究方向，特別是非糧原料和廢棄生物質已成為當前生物煉制工程的熱點。另外，由于丁酸和下游衍生產品相當比例應用于食品、飼料和醫藥等行業，從生物質出發經過生物合成的丁酸(稱為生物丁酸)更受歡迎。微生物發酵法利用的產丁酸菌多為專性厭氧菌，主要包括梭菌屬iClostridiimd、 丁酸弧菌屬(伽化乃>功_^0)、丁酸桿菌屬力acteri腫)、八疊球菌屬、Sarcina、、真桿菌屬iEubac terium )、梭桿菌屬(.Fusobac terium )禾口巨球形菌屬(Megasphaera )等。其中，梭菌屬細菌為革蘭氏陽性的產芽孢桿菌，屬化能異養型的專性厭氧菌，易從土壤、廢水、 動物消化系統、乳制品污染環境中分離得到，生長培養基配方簡單，對環境的適應性強，已成為眾多國內外學者研究微生物發酵生產丁酸的出發菌株。在眾多產丁酸菌株中，酪丁酸 ■ (Clostridium tyrobutyricum)能代謝葡萄糖、木糖和果糖合成丁酸、乙酸、氫氣和二氧化碳，相比于丙酮-丁醇菌株，其代謝途徑簡單，主產物丁酸產量穩定、得率高，副產物氫氣產量高，亦能利用廉價的生物質資源作為原料，具有廣闊的商業應用前景。但迄今為止， 由于生物發酵法生產丁酸存在原料成本高(占產品成本的20-50%)、單位體積產量低(質量濃度小于100 g/L)、副產物乙酸含量高等缺點，使其始終無法替代化學合成法，因此，尋找廉價的基質原料，在此基礎上探索高效穩定的發酵工藝以提高單位體積丁酸產量并降低副產物，對于生物法制備丁酸的工業化應用具有重要的現實意義。
甘蔗渣主要由半纖維素和木聚糖構成，經水解可生成葡萄糖和木糖。而酪丁酸梭菌能夠利用葡萄糖、木糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、甘油等生產丁酸，而且能夠利用多種非糧作物(如木薯)及工農業廢棄物(乳清、玉米皮酸水解物、甘蔗糖蜜、木薯渣水解液和玉米漿等)生產丁酸，表明丁酸發酵能夠充分利用多種可再生資源轉化的可發酵性糖，是生物煉制工程中最有前景的方向之一。運用傳統發酵工藝生產丁酸往往出現生產效率低、細胞生長對丁酸的選擇性低、 終產物的抑制作用導致丁酸濃度和得率低等難題，這些也造成丁酸分離難度大和成本高。 纖維床生物反應器(FBB)是由美國俄亥俄州立大學的楊尚天教授等人在改進傳統的填充床反應器性能的基礎上設計出的一種簡單、高效的生物反應器，適用于厭氧微生物固定化發酵，并首先應用于丙酸發酵。纖維床生物反應器選擇棉纖維織物等纖維材料作為固定細胞的載體，具有以下優點①材料化學惰性，對細胞不具毒害作用，也不會被細胞降解，不影響微生物的生長代謝；②具有較高的孔隙率(>95%)和比表面積(>40 m2/m3)，因此具有良好的傳質性能；③具有較高的載體活性，即固定化細胞的活性回收率高；④單位體積固定的細胞數多(細胞密度最高可達70 g/L)；⑤容易獲得，價格便宜，固定化成本低；⑥制備方法簡單，固定化過程溫和，適于大規模生產；⑦有較高的機械強度(以不銹鋼絲支撐能進一步強化其機械強度)，能較長時間使用；⑧生物、化學及熱力學穩定，因此成為一種理想的細胞固定載體。

發明內容
本發明目的是提供一種利用酪丁酸梭菌發酵甘蔗渣水解液生產丁酸的工藝。一方面，可以降低微生物發酵法生產丁酸的成本，提高丁酸發酵產率和得率，另一方面，可以資源化利用甘蔗渣等農業廢棄物。本發明的利用纖維床固定化發酵甘蔗渣生產丁酸的工藝，包括以下步驟
1)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸鈉的強化培養基平板上劃線后，置37 °C培養72小時；酪丁酸梭菌(編號ATCC 25755)的分類命名中文名為酪丁酸梭菌，拉丁文學名為Clostridium i_Frotoi_F_ri / ，酪丁酸梭菌購自位于美國華盛頓的美國典型培養物保藏中心((American Type Culture Collection)。2)將步驟1)平板上的單菌落接種于含50 mL生長培養基的100 mL厭氧瓶中培養 72小時，得到一級種子；
3)取1.5 mL 一級種子接種于含50 mL生長培養基的100 mL厭氧瓶中培養72小時， 得到二級種子，作為發酵母種；
4)取3mL發酵母種接種于含100 mL生長培養基的500 mL厭氧瓶中培養48小時后，接種于含2 L生長培養基的5 L預發酵罐中進行M小時的擴大培養，使菌體濃度達到6. 0-10. 0 g/L，利用蠕動泵以60-100 mL/min的速度將經擴大培養的培養液泵入纖維床生物反應器內，維持循環，當游離的菌體濃度降為1.0-3.0 g/L，將上述的培養液更換為甘蔗渣水解液發酵培養基進行批次發酵、補料發酵或反復批次發酵，得到丁酸；發酵過程中， 攪拌轉速控制在150 rpm，溫度設定為37° C，用6 mol/L的NaOH維持pH在6. 0 ；
上述的甘蔗渣水解液發酵培養基成分包括總糖70 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨 5 g/L、(NH4)2SO4 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgS047H20 0.6 g/L、FeSOJH2O 0. 03 g/L ；所說的總糖為甘蔗渣水解液配制而成，其中甘蔗渣水解液制備方法如下將烘干后的甘蔗渣與 0. 3mol/L硫酸以質量比1:10混合，于121°C水解30 min，過濾，離心取上清，將pH值調至 6. 0 ；
上述的生長培養基成分為葡萄糖30 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨5 g/L、(NH4) 2S04 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgS047H20 0.6 g/L、FeS047H20 0. 03 g/L ；
上述的強化培養基是在生長培養基的基礎上添加50 mg / mL 丁酸鈉，培養條件 37° C、pH 6. 0、厭氧環境。本發明以甘蔗渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應器進行固定化發酵，若甘蔗渣水解液僅批次發酵得到的丁酸濃度較低，會給后續分離帶來較大困難。為了進一步提高丁酸產量，在發酵過程中，當總糖濃度接近0時，可采用補充甘蔗渣水解液，形成以甘蔗渣水解液為碳源的固定化補料發酵生產丁酸工藝。為了反復利用纖維床生物反應器進行固定化發酵，也可以甘蔗渣水解液為碳源，反復進行批次發酵，形成以甘蔗渣水解液為碳源的固定化反復批次發酵工藝。實現固定化發酵生產丁酸的連續性，并降低生產成本。本發明的有益效果在于
從糧食安全和生產成本角度，研究利用非糧原料一甘蔗渣水解液發酵生產丁酸的生物煉制工藝。甘蔗渣水解液的預處理工序操作條件溫和，設備簡單，易于進行工業放大，對提高丁酸產量效果明顯。發酵過程中，纖維床生物反應器能有效大量固定活力高、代謝能力強的菌體(50-70 g/Ι)，有利于簡化操作流程，省去反復接種、擴大培養以及清洗罐體等工序，延長工作周期(可連續操作1-3個月)，提高運行過程的穩定性，反復批次發酵甘蔗渣水解液仍能維持較高的糖酸轉化率(0. 38-0. 50 g/g發酵糖)，具有廣闊的工業化前景。本發明工藝簡單，以甘蔗渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應器進行固定化發酵，可以資源化利用甘蔗渣等農業廢棄物，降低發酵法生產丁酸的成本，提高丁酸發酵產率和得率，同時可省去反復接種，并連續長期穩定運行，易于進行工業放大。


圖1是發酵丁酸的纖維床生物反應器系統示意圖中1.攪拌式預發酵罐；2.雙向蠕動泵；3.纖維床固定化裝置；4. PH電極； 5. pH監測器；6.尾氣吸收裝置；7.儲堿瓶；8.氮氣補入裝置。圖2是批次發酵丁酸的動力學圖；圖中
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HB- WjSflI ................不 τ — 4jBJi ',‘― J Bl —資一 OOi,.,。圖3是補料發酵丁酸的動力學圖；圖中
蘭5糖-一本糖一二^ 乙睡一+:_ 丁_ 一*一 。圖4是反復批次發酵丁酸的動力學圖；圖中
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具體實施例方式實施例1
5本實施例給出的是以甘蔗渣水解液為碳源進行纖維床固定化酪丁酸梭菌批次發酵丁酸的工藝，步驟如下
1)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸鈉的強化培養基平板上劃線后，37 °C培養72小時。酪丁酸梭菌(編號ATCC 25755)的分類命名中文名為酪丁酸梭菌，拉丁文學名為Clostridium i_Frotoi_F_ri / ，酪丁酸梭菌購自位于美國華盛頓的美國典型培養物保藏中心((American Type Culture Collection)。強化培養基成分包括葡萄糖30 g/Ι，酵母抽提物5 g/Ι，蛋白胨5 g/1，(NH4) 2S04 3 g/1, K2HPO4 1.5 g/1, MgS047H20，0.6 g/1, FeS047H20 0. 03 g/1, 50 mg/mL 丁酸鈉， 培養條件37° C、PH 6. 0、厭氧環境。2) 將平板上的單菌落接種于含50 ml生長培養基的100 ml血清瓶中培養72 小時，得到一級種子。生長培養基成分為葡萄糖30 g/Ι、酵母抽提物5 g/Ι、蛋白胨5 g/ 1、(NH4)2SO4 3 g/1、K2HPO4 1.5 g/1、MgS047H20 0.6 g/1、FeS047H20 0. 03 g/1 ；
3)取1.5 ml 一級種子接種于含50 ml生長培養基的100 ml厭氧瓶中培養72小時， 得到發酵母種；
4)取3mL發酵母種接種于含100 mL生長培養基的500 mL厭氧瓶中培養48小時后，接種于含2 L生長培養基的5 L攪拌式預發酵罐中進行M小時的擴大培養，使菌體濃度達到8.0 g/L，利用蠕動泵以80 mL/min的速度將經擴大培養的培養液泵入如圖1所示的纖維床生物反應器內，進行循環，當大部分菌體固定在纖維床內，即游離的菌體濃度降為2. 0 g/ L時，將上述培養液更換為甘蔗渣水解液發酵培養基，繼續發酵。攪拌轉速控制在150 rpm, 發酵溫度為37° C，用6 mo/L NaOH維持pH在6. 0 ；
圖1中攪拌式預發酵罐通過管路連接右邊帶有恒溫水夾套的玻璃柱材質纖維床固定化裝置(0 50 mm X 310 mm)。其中185 mm X 300 mm棉布織物(厚5 mm，空隙率90 %) 用不銹鋼絲網固定成螺旋狀，置于反應器柱體內，底部填充25-38 mm高的玻璃彈簧以使流體分布均勻，其工作體積為480 ml。上述的甘蔗渣水解液發酵培養基成分包括總糖70 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨 5 g/L、(NH4) 2S04 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgS047H20 0.6 g/L、FeS047H20 0. 03 g/ L。總糖為甘蔗渣水解液配制而成，其中甘蔗渣水解液制備方法如下將烘干后的甘蔗渣與 0. 3mol/L硫酸按質量比1:10混合，于121°C水解30 min，過濾，離心取上清，將pH值調至 6. 0 ；
待發酵液中糖濃度接近0時即停止發酵，批次發酵丁酸的動力學如圖2所示。實施例2
本實施例給出的是以甘蔗渣水解液為碳源纖維床固定化酪丁酸梭菌補料發酵丁酸的工藝，步驟如下
1)同實施例1步驟1);
2)同實施例1步驟2);
3)同實施例1步驟3);
4)操作步驟同實施例1步驟4)，區別在于當發酵液中糖濃度接近0時，補加甘蔗渣水解液，共補加3批，直至發酵產物丁酸的終濃度不再增加。發酵186小時后總糖濃度不再下降，氣相色譜法測得丁酸終濃度為62. 8 g/L。補料發酵丁酸的動力學如圖3所示。
實施例3
本實施例給出的是以甘蔗渣水解液為碳源纖維床固定化酪丁酸梭菌反復批次發酵丁酸的工藝，步驟如下
1)同實施例1步驟1);
2)同實施例1步驟2);
3)同實施例1步驟3);
4)操作步驟同實施例1步驟4)，區別在于發酵過程中當糖濃度接近0時更換新的甘蔗渣水解液發酵培養基，共更換5批，氣相色譜法測得丁酸平均終濃度為22. 9 g/L，反復批次發酵丁酸的動力學如圖4所示。
權利要求
1.利用酪丁酸梭菌發酵甘蔗渣水解液生產丁酸的工藝，其特征是包括以下步驟1)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50mg / mL丁酸鈉的強化培養基平板上劃線后，置37 °C培養72小時；2)將步驟1)平板上的單菌落接種于含50mL生長培養基的100 mL厭氧瓶中培養72小時，得到一級種子；3)取1.5 mL 一級種子接種于含50 mL生長培養基的100 mL厭氧瓶中培養72小時，得到二級種子，作為發酵母種；4)取3mL發酵母種接種于含100 mL生長培養基的500 mL厭氧瓶中培養48小時后，接種于含2 L生長培養基的5 L預發酵罐中進行24小時的擴大培養，使菌體濃度達到6. 0-10. 0 g/L，利用蠕動泵以60-100 mL/min的速度將經擴大培養的培養液泵入纖維床生物反應器內，維持循環，當游離的菌體濃度降為1.0-3.0 g/L，將上述的培養液更換為甘蔗渣水解液發酵培養基進行批次發酵、補料發酵或反復批次發酵，得到丁酸；發酵過程中，攪拌轉速控制在150 rpm，溫度設定為37° C，用6 mol/L的NaOH維持pH在6. 0 ；上述的甘蔗渣水解液發酵培養基成分包括總糖70 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨5g/L、(NH4)2SO4 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7Η20 0.6 g/L、FeSO4.7Η20 0. 03 g/L ；所說的總糖為甘蔗渣水解液配制而成，其中甘蔗渣水解液制備方法如下將烘干后的甘蔗渣與0. 3mol/L硫酸以質量比1:10混合，于121°C水解30 min，過濾，離心取上清，將pH值調至6. 0 ；上述的生長培養基成分為葡萄糖30 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨5 g/L、(NH4)2S04 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7Η20 0.6 g/L、FeS04*7H20 0. 03 g/L ；上述的強化培養基是在生長培養基的基礎上添加50 mg/mL 丁酸鈉，培養條件37° C、pH 6. 0、厭氧環境。
全文摘要
本發明公開的利用酪丁酸梭菌發酵甘蔗渣水解液生產丁酸的工藝，步驟包括將酪丁酸梭菌接種于種子培養基中，得到一級種子；取一級種子接種于種子培養基，得到二級種子作為發酵母種；將發酵母種接種于預發酵罐中經擴大培養后，將培養液泵入纖維床生物反應器內，維持循環，當游離的菌體濃度降為1.0-3.0g/L，將培養液更換為甘蔗渣水解液發酵培養基進行批次發酵、補料發酵或反復批次發酵，得到丁酸；本發明工藝簡單，以甘蔗渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應器進行固定化發酵，可以資源化利用甘蔗渣等農業廢棄物，降低發酵法生產丁酸的成本，提高丁酸發酵產率和得率，同時可省去反復接種，并連續長期穩定運行，易于進行工業放大。
文檔編號C12R1/145GK102559782SQ201210042829
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者徐志南, 施周銘, 王金, 蔡謹, 黃磊 申請人:浙江大學