專利名稱：耐輻射異常球菌r1 hin蛋白基因培育耐鹽植物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及耐福射異常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl)HIN蛋白基因(DR1372，GeneID =1798946)的新功能，具體涉及該基因增強植物對鹽脅迫抗性方面的應用。
背景技術：
鹽堿、干旱和凍害是限制植物生長發育的重要逆境因子，在脅迫過程中植物體會誘導合成一系列的功能蛋白，以保護植物體細胞在脅迫條件下免受傷害(Shinozaki,2007)。大量研究表明，HIN蛋白在植物抵御高鹽等非生物脅迫的過程中發揮著重要作用。D. radiodurans Rl含有的HIN蛋白基因DR1372編碼的蛋白屬于LEA2家族成員，對胚乳發育和植物生長器官的滲透脅迫有保護作用(Campbell et al.，1997 ;Close et al. , 1997 ；Brawley et al. , 1998 ；Mtwisha et al. ,1998)。 但目前未見耐輻射異常球菌Rl HIN蛋白基因(DR1372，GeneID :1798946)在提高植物耐鹽性方面的功能的研究報道。

發明內容
本發明的目的是從D. radiodurans Rl基因組中發現能夠提高植物對鹽抗性的基因。并將該基因轉入植物，使轉入該基因的植物獲得耐鹽的能力。本發明通過如下研究發現，Deinococcus radiodurans Rl的HIN蛋白基因(DR1372)具有耐鹽脅迫的功能，可用于培育耐鹽性狀的植物I、獲得含有H radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)的重組工程菌株I)通過 PCR 從 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因組擴增出 D. radioduransRl HIN蛋白基因(DR1372)，基因序列號為=GeneID :1798946。其大小為495 bp，該基因編碼164個氨基酸，將其克隆于載體pGEMT-easy上，構建了含有完整HIN蛋白基因的重組質粒 pGEMT-hin ；2)將HIN蛋白基因(DR1372)連接于pRADZ3穿梭質粒上，該質粒含有能在大腸桿菌和耐輻射異球菌中都起作用的groEL啟動子，構建含有groEL啟動子的完整HIN蛋白基因(DR1372)重組質粒 pRADZ3-hin G ；3)將導入HIN蛋白基因(DR1372)的重組質粒pRADZ3_hin G轉入受體大腸桿菌JM109中，獲得重組菌株JM-hin (詳見實施例I)；2、含有HIN蛋白基因工程菌株的耐鹽實驗實驗證實，經4M NaCl鹽溶液沖擊后，含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)的JM-hin重組菌株生長狀況良好，菌落數高于只含空質粒的JM-Z3菌株(見實施例2及圖4)。該工程菌株具有耐受4M NaCl沖擊的能力。此實驗表明D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)具有增強原核生物耐鹽的能力。
3、HIN蛋白基因(DR1372)在油菜中表達及轉基因植株的耐鹽性鑒定I)將D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)連接到植物表達載體pBI121中，構建具有HIN蛋白基因(DR1372)的重組質粒pBI121_hin ;2)將pBI121_hin重組質粒轉化油菜中，獲得了能夠耐受鹽脅迫的轉基因油菜植株; 此實驗表明D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)具有培育耐鹽植物的用途(見實施例3)。


圖I是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)序列的PCR產物驗證電泳圖譜；圖2是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)及groEL啟動子構建原核表達載體的驗證電泳圖譜；圖3是在鹽沖擊試驗前的含有空載體和含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)序列的原核表達載體的大腸桿菌的生長情況的菌落照片，其中a是含有空表達載體的大腸桿菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)表達載體的大腸桿菌重組菌株;圖4是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)的原核表達載體及空載體的大腸桿菌(E. coli)在含4M NaCl培養基中的生長情況的菌落照片，圖中的菌株如下a是含有空表達載體的大腸桿菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)表達載體的大腸桿菌重組菌株;圖5是在350mmol. L 1的NaCl培養基上轉D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)油菜與非轉基因油菜的耐鹽試驗結果比較。圖中順序從左至右，左起第I盆是非轉基因油菜，第2 5盆是轉入D. radiodurans RlHIN 蛋白基因(DR1372)的油菜。
具體實施方案以下實施例中所舉的質粒、菌株只是用于對本發明作進一步詳細說明，并不對本發明的實質內容加以限制。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所舉的質粒、菌株來源如下克隆載體pGEMT-easy :為Promrga公司市售產品；穿梭質粒pRADZ3 :為本實驗室保存；植物表達載體pBI121 :為Clontech公司市售產品；大腸桿菌JM 109 :為北京全式金公司市售產品。農桿菌EHA 105由本實驗室保存實施例I D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)序列在大腸桿菌中的表達
根據已公布的D. radiodurans Rl基因組中的HIN蛋白基因(DR1372)序列設計I對PCR特異性引物，從D. radiodurans Rl基因組DNA中擴增完整的核苷酸序列Up 5' ATTA ACTAGT* GAGCTATGAAGAAGATGGCTTTTG3;；Down 5' ACGC CATATG TCCTCAAAACACCGATAAAG3;。上述黑斜體部分是酶切位點。通過PCR方法從D. radiodurans Rl的基因組中擴增出目的基因序列，反應條件940C IOmin, [94°C 60sec,55°C 30sec,72°C 60sec] 30 個循環，72°C IOmin, PCR 產物經膠回收后，克隆于載體pGEMT-easy上，命名為pGEMT_hin，并測序驗證；然后通過Spel/Ndel雙酶切獲得含有粘性末端的及含有啟動子groEL的pRADZ3載體，將HIN蛋白基因(DR1372) 連接于PRADZ3載體上，構建大腸桿菌表達載體pRADZ3-hinG，將該表達載體轉化大腸桿菌JM109，經PCR、酶切，測序驗證插入序列正確(見圖I，2)，將該重組菌株命名為JM-hin。將含有pRADZ3空質粒的E. coli JMl09命名為JM-Z3。實施例2含D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)重組菌株的耐鹽實驗一、實驗方法I、將實施例I中獲得的2個重組大腸桿菌分別接種于20mL LB液體培養基(含Amp抗生素)中，搖瓶過夜(37°C )培養后，再分別轉接于IOOmL的LB液體培養基中，盡量保持接種量的一致，培養至0D_ ^ 0. 5即可。2、取IOmL的菌液離心后，在等體積的4M NaCl鹽溶液里沖擊2h，每個樣品立即用無菌去離子水倍比稀釋至10_4，取10 μ L點在LB固體培養基表面，經37°C培養16h，觀察菌落形成情況并照相。二、實驗結果圖3顯示，4M NaCl鹽溶液沖擊前含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)的JM-hin菌株與含空質粒的JM-Z3菌株生長狀態基本一致；4M NaCl鹽溶液沖擊后，含有D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)的JM-hin重組菌株生長狀況良好，菌落數明顯高于只含空質粒的JM-Z3菌株(見圖4)。三、實驗結論D. radiodurans Rl HIN蛋白基因(DR1372)增強了原核生物耐鹽的能力。實施例3 HIN蛋白基因(DR1372)在油菜中表達及轉基因植株的耐鹽性實驗(一 )農桿菌介導轉化油菜實驗I.根癌農桿菌EHA105感受態的制備I)挑取單菌落，接種于5mL YEB液體培養基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250rpm振蕩培養過夜；2)取 2mL 菌液，加入 50mL YEB 液體培養基(含 Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm 振蕩培養至OD600 O. 6 ;3)將菌液轉至50mL無菌離心管中，冰浴30min,5000Xg離心5min ；4)棄上清，沉淀用2mL 20mM CaCl2重浮，每份100 μ L分裝到I. 5mL離心管中，液
氣中保存備用。2.重組質粒DNA轉入農桿菌I)將約Iyg的pBI 121-hin質粒DNA分別加入到100μ L EHA105感受態細胞中，混勻，冰浴5min ；2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉至37°C水浴中溫浴5min ；3)加入ImL YEB液體培養基，在28°C搖床上250rpm復蘇4 5h ;4)取適量菌液涂布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB固體培養基上，置28 °C培養24 48h。3.農桿菌的質粒的提取I)挑取菌落于含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB液體培養基中(YEB :胰蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂O. 5g/L)，28°C，250rpm振蕩培養20h ；
2)取 I. 5mL 菌液離心后，棄上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM pH 8. O, NaClIOmM, EDTA IOmM pH 8. O)洗滌2次，棄上清，加入預冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mMTris-HClpH8. O, IOmM EDTA pH 8. O, RNase A 100 μ g/mL) 300 μ L，用移液器反復抽吸混勻，室溫靜置IOmin ；3)加入新鮮配置的溶液II (O. 2M NaOH, I % SDS) 600 μ L，上下顛倒幾次混勻；4)加入預冷的溶液III (5Μ乙酸鉀pH 5. 2，冰醋酸11. 5mL，加水至IOOmL) 450 μ L，充分混勻，冰浴5min，4°C 12000 Xg離心5min，取上清用O. 6倍體積的異丙醇沉淀；5)沉淀加入 50yL TE (Tris-HCI I Ommo I/L, Immo I/LEDTA, pH 8· O)溶解后，經PCR、Bam HI、Sac I雙酶切驗證。4.油菜無菌苗的準備及農桿菌介導的HIN蛋白基因(DR1372)遺傳轉化I)油菜無菌苗的培養甘藍型油菜(Brassica napus L. ) (84100-18)種子在超凈工作臺上用滅菌水浸泡IOmin, 10 %的NaClO滅菌12min，再用O. I %的升汞溶液消毒7_8min，用滅菌水洗3_5遍，并把滅菌的油菜種子均勻地擺放在無激素的預培養基上(7. 5%瓊脂)。光照培養，4-5 d齡油菜幼苗最適于遺傳轉化。2)預培養用75%的酒精和高溫消毒滅菌的剪刀剪掉子葉和生長點，剪取油菜無菌苗緊鄰生長點下約O. 5cm長的下胚軸，置于預培養基(MS+6-BA 2mg/L+2,4-D lmg/L+AgN03 2. 5 mg/L+AS 19. 62mg/L)上，光照預培養2d。3)農桿菌的培養在50mL LB液體培養基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入
O.ImLhin-EHA 105菌液，28°C下220rpm振蕩培養16h左右，室溫下4000 Xg離心lOmin，棄上清液，菌體用滅菌的MS液體培養基(含AS 100 μ mol/L)懸浮，稀釋到原體積的5_20倍，在28°C下220rpm振蕩培養lh，使菌液的0D_ ^ 0. 5。4)共培養把預培養2d的下胚軸放入菌液中浸染lmin，用藥勺撈出下胚軸，放在滅菌的吸水紙上，吸干下胚軸上的多余菌液，再放到覆蓋有滅菌濾紙的預培養基上，用封口膜封好培養皿，25 °C左右，于暗處共培養約2d(暗培養)。5)誘導培養把共培養2d的下胚軸放到誘導培養基(MS+6-BA 2mg/L+AgN03 2. 5mg/L)上，用封口膜封好培養皿，25°C左右光照培養，每2周繼代I次，直至長出膨大的愈傷組織。6)選擇培養把膨大的愈傷組織轉移到篩選培養基(MS+6-BA 2mg/L+AgN03 2. 5mg/L+Kan100mg/L)上，用封口膜封好培養皿，25°C左右光照培養，每2周繼代I次，直至長出苗。7)生根培養當幼芽長到l-2cm高時，把它們從愈傷組織上分離，轉移到生根培養基上(1/2MS+NAA O. 5mg/L+Kan 25mg/L)進行生根培養。在抗生素篩選條件下，約87%的芽在2周后形成根。8)煉苗和移栽
生根后的幼苗長到5-6cm高時，半敞開培養瓶蓋子，進行煉苗；待幼苗適應外界環境以后，轉移到室內滅菌的蛭石中栽種培養，并用1/2MS培養液澆灌。當幼苗生長至7-9cm時，將幼苗移植到泥土中生長，然后再進行下一步實驗。(二)含HIN蛋白基因(DR1372)序列轉基因油菜的耐鹽性鑒定實驗I、實驗目的鑒于該核苷酸序列已被證明在大腸桿菌中對鹽脅迫具有抗性，進一步對轉基因植株進行耐鹽性鑒定。2、實驗方法采用不同的NaCl濃度(0、50、100、150、250和350mmol. T1NaCl)分別對轉基因油菜植株和非轉基因油菜植株進行生長情況的觀察。3、實驗結果在沒有NaCl處理的情況下，轉基因油菜和非轉基因油菜的生長狀況沒有明顯的
差異;在添加50mmol. T1NaCl的情況下，非轉基因油菜仍然能保持生長，但生長的速率比轉基因油菜要緩慢一些，表明低鹽條件下，野生型植株生長已明顯受到抑制；當NaCl的濃度增加到100和150mmol. L—1時，非轉基因的油菜葉片最初變黃、接著葉片逐漸萎蔫，20d后全部死亡；當NaCl濃度為250mmol. Γ1時，非轉基因的油菜葉片迅速發黃、葉片萎焉，幼葉幾乎停止生長，并向葉背面翻卷，大約在IOd后死亡；當NaCl濃度增加到350mmol. L_\非轉基因油菜苗均在l_2d內開始發黃，4_5d后幾乎全部死亡，而轉基因油菜均能夠存活4周以上。從圖5可知轉基因油菜可在350mmol.I/1濃度的NaCl培養基上正常生長，非轉基因油菜在350mmol. Γ1濃度的NaCl培養基上干枯死亡。結果證明，該基因對鹽的脅迫確有抗性。而在上述各種NaCl濃度下，轉入HIN蛋白基因(DR1372)的油菜均能正常生長。上述實驗結果見表I :表I轉基因油菜和非轉基因油菜對鹽脅迫的比較
權利要求
1.Deinococcus radiodurans Rl HIN 蛋白基因(DR1372, GeneID :1797273)培育耐鹽植物的用途。
2.含Deinococcusradiodurans Rl HIN蛋白基因的重組質粒。
3.含Deinococcusradiodurans Rl HIN蛋白基因的重組工程菌株。
4.含Deinococcusradiodurans Rl HIN蛋白基因的重組質粒培育耐鹽植物的用途。
5.權利要求4所述的用途，所述重組質粒是能在大腸桿菌表達的質粒。
6.權利要求4所述的用途，所述重組質粒是能在植物中表達的質粒。
7.權利要求4所述的用途，所述重組質粒轉化的宿主細胞培育耐鹽植物的用途。
8.權利要求7所述的用途，所述宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。
9.權利要求I或4所述的用途，所述植物是油菜。
全文摘要
本發明發現耐輻射異球菌Deinococcus radiodurans R1中的HIN蛋白基因(DR1372)具有增強原核生物及植物的抗逆能力。本發明構建了包含上述基因的重組載體，把它們分別導入原核及真核宿主細胞。實驗證明，HIN蛋白基因(DR1372)在原核宿主細胞和植物中表達后，均能增強其耐鹽抗性。
文檔編號C12N15/70GK102851305SQ201210046708
公開日2013年1月2日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者王勁, 江世杰, 張維, 陳明, 陳震, 林敏 申請人:中國農業科學院生物技術研究所