專利名稱：高耐受細胞株的篩選方法
技術領域：
本申請涉及生物工程技術，特別是適合于大規模生產用的高耐受細胞株的篩選和
培養方法。
背景技術：
生物反應器在動物細胞規?；囵B中的應用也是生物制藥領域的發展趨勢，很多生物制藥公司均致力于開發相關產品的發酵工藝，以滿足公司產品能夠在低成本大規模情況下進行產品的制備。隨著全球對生物制品的需求量的增大，生物反應器的規模也不斷地提高。此時，動物細胞大規模培養也就成了生物制藥領域最重要的關鍵技術之一。
但是，在發酵規模不斷放大的過程中，細胞生長的微環境發生了很大的變化，細胞 生長受到顯著影響，甚至導致細胞死亡。當細胞高密度生長達到一定程度，由于其自身特性不同，其工藝參數耐受情況也不盡相同。隨著細胞密度的增長，主要底物氧化還原代謝加劇，傳質及傳熱過程需要進行調整，加大攪拌及提高通氣量是最主要的手段，伴隨而來的是細胞不可避免的受到的一系列物理損傷。底物的大量消耗會導致副產物的大量產生，對各類細胞有較高的毒性，同時，底物耗竭會造成細胞生長代謝停滯進而導致大量細胞快速死亡。因此，工藝參數是限制發酵規模的重要問題，各種工藝的開發依賴于細胞株能夠耐受微環境各項參數指標的變化，篩選獲得能夠在生物反應器中的高耐受細胞株顯得尤為重要。采用高耐受細胞株，不僅能夠實現細胞株在無血清、無蛋白或者化學成分限定培養基中的生長代謝和廣物表達，同時，還能大幅度的提聞細胞株的生長代謝機能，增強細胞株抵抗微環境的各種惡劣變化，以此實現控制細胞增殖水平、延長細胞培養周期，解決規模化放大參數的限制、降低成本等目標，進而提高規?；囵B的效能。

發明內容
本申請涉及適合于大規模生產用的高耐受細胞株的制備和篩選方法。本申請的一方面提供了一種高耐受細胞株的篩選方法，包括選取可生長細胞株，將其進行體外培養，改變細胞培養條件從而迫使細胞在不良生長環境中生長代謝，進而篩選獲得適應于所述不良生長環境的高耐受細胞株，其特征在于，所述改變的細胞培養條件包括細胞培養液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、PH值、溶氧濃度或攪拌速度，或所述細胞培養條件的兩種或兩種以上的任意組合。在一些實施方式中，本申請的高耐受細胞株的篩選方法包括改變兩種或兩種以上選自以下組的細胞培養條件細胞培養液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、PH值、溶氧濃度以及攪拌速度。在一些實施方式中，可改變三種或三種以上所述的細胞培養條件。在一些實施方式中，可改變四種或四種以上所述的細胞培養條件。在一些實施方式中，可改變五種或五種以上所述的細胞培養條件。在一些實施方式中，可改變六種或六種以上所述的細胞培養條件。如果通過改變或調整多種細胞培養條件來篩選高耐受細胞株，所述細胞培養條件可同時改變或調整，也可分先后分別改變或調整，也可以有些培養條件同時改變，有些培養條件單獨改變。例如，在一些實施方式中，可同時改變細胞培養液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、PH值、溶氧濃度以及攪拌速度，將細胞進行培養，挑選出適應于改變后的培養條件的高耐受細胞株。在一些實施方式中，在細胞培養過程中可以按預定的順序依次改變培養條件，比如先改變滲透壓，再改變乳酸濃度，再改變氨濃度，再改變PH值，再改變溶氧濃度，再改變攪拌速度等，又比如先改變滲透壓，再改變攪拌速度，再改變乳酸濃度和氨濃度等，又比如先改變滲透壓和PH值，再改變攪拌速度，再改變乳酸濃度和氨濃度等。在一些實施方式中，在細胞培養過程中改變的細胞培養條件中至少有兩種分別進行改變，即不是同時改變。例如，在一些實施方式中，先改變初始細胞密度、滲透壓、PH值和攪拌速度，然后再改變乳酸濃度和氨濃度。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是逐步提高滲透壓使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，以預定的梯度，比如50mQ或IOOmQ，逐步提高滲透壓。在一些實施方式中，培養液中初始的滲透壓為大約280mQ或320mQ。在一些實施方式中，培養條件中滲透壓改變的范圍為300 600m Q。在一些實施方式中，培養液中滲透壓被一次性調整到預定的極限滲透壓值，例如400mQ、500mQ或600m Q，直接篩選出可在極限滲透壓值條件下存活的、生長代謝狀態良好的高耐受細胞株。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是逐步降低溶氧濃度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，以預定的梯度，比如5%或10%，逐步降低溶氧濃度。在一些實施方式中，培養液中初始溶氧濃度為80%或70%。在一些實施方式中，培養液中溶氧濃度的范圍在10% _80%、20% 80%、或者30% -80%。在一些實施方式中，培養液中溶氧濃度被一次性調整到預定的極限溶氧濃度值，例如10%或15%，直接篩選出可在極限溶氧濃度條件下存活的、生長代謝狀態良好的高耐受細胞株。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是逐步提高乳酸濃度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，以預定的梯度，比如5mM、10mM、20mM、40mM或80mM，逐步提高乳酸濃度。在一些實施方式中，培養液中初始乳酸濃度為OmM。在一些實施方式中，細胞培養條件中乳酸濃度的改變范圍為0 60mM，0 80mM，0 IOOmM或I 120mM等。在一些實施方式中，培養液中乳酸濃度被一次性調整到預定的極限乳酸濃度值，例如IlOmM或120mM，直接篩選出可在極限乳酸濃度條件下存活的、生長代謝狀態良好的高耐受細胞株。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是逐步提高氨濃度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，以預定的梯度，比如2mM、4mM、6mM、8mM、10mM，逐步提高氨濃度。在一些實施方式中，培養液中初始氨濃度為OmM。在一些實施方式中，細胞培養條件中氨濃度的改變范圍為0 10mM，0 15mM，或0 20mM等。在一些實施方式中，培養液中氨濃度被一次性調整到預定的極限氨濃度值，例如IOmM或20mM，直接篩選出可在極限氨濃度條件下存活 的、生長代謝狀態良好的高耐受細胞株。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是同時逐步提高乳酸濃度和氨濃度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是同時逐步提高乳酸濃度、氨濃度以及滲透壓使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是同時逐步提高乳酸濃度、氨濃度以及pH值使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是逐步提高pH值使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，培養液中初始pH值為6. 5。在一些實施方式中，細胞培養條件中PH值的變化范圍可以為6. 5 7. 8。在一些實施方式中，培養液中pH值被一次性調整到預定的極限pH值，例如7. 8，直接篩選出可在極限pH值條件下存活的、生長代謝狀態良好的高耐受細胞株。在一些實施方式中，改變細胞培養條件可以是逐步提高攪拌速度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。在一些實施方式中，以預定的梯度逐步提高攪拌速度，比如 40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、lOOrpm、llOrpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm。在一些實施方式中，培養液初始攪拌速度為40rpm、60rpm、80rpm或lOOrpm。在一些實施方式中，細胞培養條件中攪拌速度的變化范圍可以為40 150rpm，40 200rpm，40 250rpm,或40 300rpm等。在一些實施方式中，攪拌速度被一次性調整到預定的極限攪拌速度，例如200rpm或300rpm，直接篩選出可在極限攪拌速度條件下存活的、生長代謝狀態良好的高耐受細胞株。在一些實施方式中，可以在營養物低濃度條件下篩選高耐受細胞株。比如，營養物濃度低于該細胞常規培養條件下起始營養物濃度的50%、30%或者更低的濃度。常規起始營養物濃度例如可以是，新鮮的EX-CELL 302無血清培養基(JRH BI0SCIENCE公司，貨號24326C)所含的營養物濃度，新鮮的EX-CELL 620無血清培養基(JRH BI0SCIENCE公司，貨號14621C)所含的營養物濃度。在一些實施方式中，可以在高細胞密度條件下篩選高耐受細胞株。比如，細胞密度高于IO7細胞/mL、2X IO7細胞/mL或5X IO7細胞/mL。在一些實施方式中，細胞起始培養密度可以是0. 5 10 X IO5細胞/mL，或I 10 X IO5細胞/mL，或2 10 X IO5細胞/mL，或3 10X IO5 細胞/mL，或 4 10 X IO5 細胞/mL，或 5 10 X IO5 細胞/mL，或 9 IOXlO5
細胞/mL等。在一些實施方式中，預定的細胞生長代謝參數是指細胞活性，預定的極限值是指細胞活性低于大約60%、50%、40%或30%等。在一些實施方式中，預定的細胞生長代謝參數是指細胞倍增時間，預定的極限值是指細胞倍增期無法保持穩定，例如群體細胞倍增時間縮短或延長40%以上、50%以上、或 者60%以上。在一些實施方式中，預定的細胞生長代謝參數是指細胞的產物表達量，預定的極限值是指細胞產物表達量低于常規培養條件下的表達量的90 %、80 %、70 %或60 %等。在一些實施方式中，用無血清克隆化方法進一步對改變培養條件后獲得的細胞進行篩選，獲得生長代謝穩定的高耐受細胞株。在一些實施方式中，在改變一種或多種細胞培養條件后，進行無血清培養和篩選，然后再進一步改變細胞培養條件，再次進行無血清培養和篩選，這樣交替進行改變培養條件的培養和篩選。有關無血清克隆化的典型方法可以參見米力和屈穎等人的中國專利第CN200810150056. X號，其
公開日為2008年12月31日，該專利公開的全部內容通過引用方式并入到本申請中。
在一些實施方式中，所述細胞株是動物細胞株。在一些實施方式中，所述細胞株是哺乳動物細胞株，例如中圍倉鼠卵巢細胞(CHO)。在一些實施方式中，所述細胞株帶有可表達的重組外源基因。在一些實施方式中，所述重組外源基因編碼外源蛋白例如抗體蛋白。在一些實施方式中，高耐受細胞株可表達重組蛋白。在一些實施方式中，高耐受細胞株表達的重組蛋白的質量與未進過篩選的細胞株表達的一致。在一些實施方式中，高耐受細胞株表達的重組蛋白的純度與未進過篩選的細胞株表達的一致或相差不超過5%、10%或20%。在一些實施方式中，所述篩選方法所采用的起始細胞株是生長狀態良好的細胞株。在一些實施方式中，所述篩選方法所采用的起始細胞株是處于對數生長期的細胞。在一些實施方式中，所述篩選方法所采用的起始細胞可以是正常的未經高耐受篩選的細胞，也可以是經過一次或多次高耐受篩選的細胞株。 在一些實施方式中，篩選的周期可以是10 40天，20 40天，30 40天等。


圖I示出了實施例I篩選獲得的高耐受細胞株跟原始細胞株在相同培養條件下培養基中L-谷氨酰胺濃度隨著時間的變化情況。圖2示出了實施例I篩選獲得的高耐受細胞株跟原始細胞株在相同培養條件下培養基中葡萄糖濃度隨著時間的變化情況。圖3示出了實施例I篩選獲得的高耐受細胞株跟原始細胞株在相同培養條件下細胞密度隨著時間的變化情況。圖4示出了實施例I篩選獲得的高耐受細胞株跟原始細胞株在相同培養條件下細胞活性隨著時間的變化情況。
具體實施例方式以下結合附圖對本申請作進一步的詳細說明。以下描述的實施方式僅為說明目的而并非旨在限定。在不偏離本申請的主題的精神或范圍的情況下，可以采用其他實施方式，并且可以做出其他變化，所有這些都在本申請范圍之內，并構成本申請內容的一部分。實施例I :通過調整滲透壓、攪拌速度、pH、高細胞密度和營養物濃度等篩選高耐受細胞株的方法I)細胞株和培養基起始細胞株是帶有重組目標基因的中國倉鼠卵巢細胞，該細胞株命名為CERC_10(中國人民解放軍第四軍醫大學細胞工程中心構建)。本實施例中所用的新鮮的EX- CELL 302無血清培養基購自JRH BI0SCIENCE公司(貨號24326C)。本實施例中所用的條件培養基為新鮮的EX- CELL 302無血清培養基與細胞培養后離心所得培養基上清液以一定比例混合獲得。例如，條件培養基可通過以下步驟獲得將待培養細胞接種到新鮮的EX-CELL 302無血清培養基中，在5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養至預期的時間或細胞密度，然后以1200rpm離心5分鐘除去細胞獲得培養上清液；將培養上清液按照一定比例跟新鮮的EX- CELL 302無血清培養基混合形成條件培養基。
本實施例中無血清克隆化步驟所用的無血清低密度培養基通過以下步驟制得準備EX- CELL 302無血清培養基作為基礎培養基；添加胰島素至15mg/L、添加轉鐵蛋白至5mg/L、添加胰島素樣生長因子-I至100ug/L、添加乙醇胺至10mol/L以及添加亞硒酸鈉至60nmol/L從而制備得到無血清低密度培養基(所述濃度都是這些添加物最終在培養基中的濃度)。2)檢測方法和儀器細胞密度和細胞活性采用臺盼藍拒染法進行檢測，其中，在不同時段從培養基中取出細胞，將等量的細胞懸液與臺盼藍染液均勻混合，I分鐘后，將已染色的細胞懸液加入血球計數板中，在光學顯微鏡下對活細胞和死細胞分別進行計數。細胞活性=活細胞數/(活細胞數+死細胞數)。采用夾心酶標記免疫吸附測定法(ELISA)檢測上清液中的表達產物，其中，采用Fab雙段(購自Corning公司，貨號XH329)包被96孔板，濃度為100 y g/mL ;二抗采用辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗人二抗(購自PIERCE公司，貨號HC002)，濃度為I :8000。顯色液顯色后采用酶標儀進行讀值。 葡萄糖濃度和L-谷氨酰胺濃度采用生化分析儀(YSI公司，YSI 2700型號)進行檢測。生物反應器采用德圍貝朗公司(B. Braun Biotech)的B5L生物攪拌通氣式生物反應器。生物反應器中的表達產物采用AKTA蛋白純化系統(GE Healthcare Life Sciences,AKTAexplorer型號)通過Protein A親和層析柱進行回收純化。表達產物的純度使用高效液相色譜儀HPLC(Waters 600)進行檢測，回收到的表達產物純度為約95%。3)采用如下步驟建立高耐受細胞株I.將20毫升CERC-10細胞接種于80毫升新鮮的EX- CELL 302無血清培養基，細胞起始密度為5 X IO5細胞/毫升左右，用氯化鈉溶液將滲透壓調整至400m Q，調節pH至7. 0，置于5% CO2、飽和濕度培養箱中進行培養，并將轉速設置為80rpm/min。2. 3天后，將上一步所得細胞離心，并收集細胞稀釋于條件培養基中(新鮮的EX- CELL 302無血清培養基上一步所得的培養上清液=I I混合而得)，使得細胞密度調整至約2 X IO6細胞/毫升，采用氯化鈉將滲透壓調整到450m Q，采用5mM氫氧化鈉將pH調節為7. 5，置于5% CO2、飽和濕度培養箱中進行培養，并將轉速設置為90rpm/min。3. 6天后，將上一步所得細胞離心，并收集細胞稀釋于條件培養基中(新鮮的EX- CELL 302無血清培養基上一步所得的培養上清液=I 3混合而得)，使得細胞密度調整至約5 X IO6細胞/毫升，采用氯化鈉將滲透壓調整到500m Q，置于5% CO2、飽和濕度培養箱中進行培養，并將轉速設置為100rpm/min。4. 9天后，將上一步所得細胞離心，并收集細胞稀釋于條件培養基中(新鮮的EX- CELL 302無血清培養基上一步所得的培養上清液=I 5混合)，使得細胞密度調整至約10X IO6細胞/毫升，采用氯化鈉將滲透壓調整到550mQ，置于5% CO2、飽和濕度培養箱中進行培養，并將轉速設置為110rpm/min。5. 12天后，將上一步所得細胞離心，并收集細胞稀釋于條件培養基中(新鮮的 EX- CELL 302無血清培養基上一步所得的培養上清液=I 9混合)，使得細胞密度調整至約20X IO6細胞/毫升，采用氯化鈉將滲透壓調整到500mQ，用5mM鹽酸將pH調整為6. 8，置于5% CO2、飽和濕度培養箱 中進行培養，并將轉速設置為120rpm/min。6. 18天后，采用有限稀釋法進行無血清克隆化，培養7-14天。該方法包括以下步驟使用無菌純水配制100mg/L的D-多聚賴氨酸,室溫包被96孔板2h,使用無菌水沖洗包被孔3次；將步驟5的細胞懸液與無血清低密度培養基按照I : 100的比例連續稀釋直至細胞密度為50細胞/毫升，以100 u L/孔的比例接種24個孔；繼續稀釋細胞懸液至細胞密度為20細胞/毫升，以100 u L/孔的比例接種24個孔；繼續稀釋細胞懸液至細胞密度為10細胞/毫升，以100 u L/孔的比例接種48個孔；最后經過7-14天培養后，篩選出生長和產物表達均理想的克隆株。生長和產物表達均理想的克隆株應滿足生長代謝穩定，表達的目標產物質量優良的標準，并且與原始細胞株的生長代謝基本一致。7.在顯微鏡下觀察單克隆生長情況，同時用夾心ELISA方法檢測上清液中目標產物的表達情況，綜合考慮生長和表達兩方面的結果，篩選生長和表達都較理想的耐受克隆株。8.準備5L生物反應器和新鮮的EX- CELL 302無血清培養基，將3L新鮮的培養基加入到反應器中。9.以約5 X IO5細胞/毫升的初始細胞密度將步驟7篩選得到的耐受細胞接種于上述5L生物反應器中，起步轉速為80rpm，pH為7. 5。10.將轉速按照80、90、100、110、120、130、140、150rpm的梯度不斷升高，以不同的
細胞密度來控制攪拌的速度。初始細胞密度在5 X IO5細胞/毫升至I X IO6細胞/毫升，攪拌以80rpm開始；細胞密度達到5 X IO6細胞/毫升時，攪拌可以調整至120rpm ;細胞密度達到I X IO7細胞/毫升以上時，攪拌速度可以調整至150rpm。在此范圍間的攪拌速度可以根據細胞的粘附情況(細胞與細胞之間的粘附，以及細胞跟生物反應器內壁之間的粘附)來進行調整，例如當細胞粘附加劇(比如出現了結團、聚集或者粘附到生物反應器內壁)時，可以考慮調高攪拌速度。11.在細胞密度達到5X IO6細胞/毫升之后，每天逐步提高乳酸和氨的濃度，乳酸的濃度梯度為5，10，20，40，80mM，氨的濃度梯度為2，4，6，8，10mM。乳酸濃度可以通過200mM乳酸進行調整，氨的濃度可以通過200mM氯化銨進行調整。12.繼續培養使細胞密度不斷升高，直至細胞密度達到約2 X IO7細胞/毫升。13.不斷檢測5L生物反應器中的細胞活性，當細胞活性下降到50%左右時，無菌取樣。14.按照跟步驟6相同的方式采用有限稀釋法進行無血清克隆化篩選，從中篩選出生長和產物表達均理想的克隆株。4)結果采用無血清克隆化的方法進行高耐受細胞株亞克隆的篩選，其克隆率為33. 7%,且陽性率100%。由附圖I和附圖2可以看出，本實施例篩選獲得的高耐受亞克隆細胞株(簡稱“高耐受細胞株”)與原始細胞株在相同培養條件下在L-谷氨酰胺和葡萄糖的代謝速度和趨勢上基本一致。在整個生長過程中，底物L-谷氨酰胺和葡萄糖基本維持在設定區間范圍內，谷氨酰胺濃度維持在約l_4mM，葡萄糖維持在約2-6g/L。流加L-谷氨酰胺和葡萄糖24小時內濃度均滿足設定的極限值，其中谷氨酰胺設置低限為ImM，葡萄糖設置低限為 lg/Lo
由附圖3可以看出，高耐受細胞株和原始細胞株的最高細胞密度分別為約9. 3 X IO6細胞/毫升和約8. 5 X IO6細胞/毫升(均在培養第5天左右達到最高細胞密度)，兩者無顯著差異。從附圖3還可以看出，在對數生長期(第1-4天左右)，高耐受細胞株和原始細胞株在細胞密度方面無顯著差異；高耐受細胞株的平臺期(第4-6天左右)比原始細胞株(第4-5天左右)延長了一天。由附圖4可以看出，在衰亡期(第5天或第6天起)，高耐受細胞株的細胞活性下降速度要比原始細胞株的細胞活性下降速度慢。另外，高耐受細胞株的培養周期要比原始細胞株的培養周期延長兩天，從8天延長至10天。根據ELISA檢測結果，高耐受細胞株在第10天表達產物濃度達到最高值，為約280.2mg/L。
權利要求
1.一種高耐受細胞株的篩選方法，包括選取可生長細胞株，將其進行體外培養，改變細胞培養條件從而迫使細胞在不良生長環境中生長代謝，進而篩選獲得適應于所述不良生長環境的高耐受細胞株，其特征在于，所述改變的細胞培養條件包括細胞培養液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、PH值、溶氧濃度或攪拌速度，或者所述細胞培養條件的兩種或兩種以上的任意組合。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，改變兩種或兩種以上所述的細胞培養條件。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的改變的細胞培養條件中至少有兩種分別進行改變。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，改變細胞培養條件是逐步提高滲透壓使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，改變細胞培養條件是逐步提高乳酸濃度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，改變細胞培養條件是逐步提高氨濃度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，改變細胞培養條件是同時逐步提高乳酸濃度和氨濃度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，改變細胞培養條件是逐步提高PH值使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于，改變細胞培養條件是逐步提高攪拌速度使得預定的細胞生長參數達到預定的極限值。
10.如權利要求I所述的方法，其特征在于，把所述的細胞培養條件直接調整到預定的值。
11.如權利要求4至9的任意一個所述的方法，其特征在于，所述預定的細胞生長參數為細胞活性，預定的極限值是指細胞活性低于50%。
12.如權利要求4至9的任意一個所述的方法，其特征在于，所述預定的細胞生長參數為細胞倍增期，預定的極限值是指細胞倍增期無法保持穩定。
13.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述細胞株是哺乳動物細胞株。
14.如權利要求I所述的方法，其特征在于，進一步用無血清克隆化方法對獲得的細胞進行篩選，獲得生長代謝穩定的高耐受細胞株。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述高耐受細胞株所表達的產物質量合格。
16.如權利要求I所述的方法，其特征在于，在低營養物濃度的條件下對所述細胞株進行篩選。
17.如權利要求I所述的方法，其特征在于，在高細胞密度的條件下對所述細胞株進行篩選。
全文摘要
本申請涉及生物工程技術，尤其涉及篩選高耐受細胞株的方法。在本申請的一個方面，本申請提供了一種高耐受細胞株的篩選方法，該方法包括選取可生長細胞株，將其進行體外培養，改變細胞培養條件從而迫使細胞在不良生長環境中生長代謝，進而篩選獲得適應于所述不良生長環境的高耐受細胞株，所述改變的細胞培養條件包括細胞培養液的滲透壓、乳酸濃度、氨濃度、pH值、溶氧濃度或攪拌速度，或者所述細胞培養條件的兩種或兩種以上的任意組合。通過本申請篩選得到的高耐受細胞株特別適用于生物反應器的大規模培養。
文檔編號C12N5/00GK102634476SQ201210051119
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者屈穎, 陳小春 申請人:江蘇太平洋美諾克生物藥業有限公司