專(zhuān)利名稱(chēng)：一種腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志基因及其用于抗癌的新藥物開(kāi)發(fā)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
尋找控制腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子及其致病機(jī)理，以阻止癌癥轉(zhuǎn)移至身體其他部位，一直是治療惡性腫瘤的重要切入點(diǎn)，也是目前開(kāi)發(fā)新的抗癌藥物的主要方式。Sival最早是由⑶27的細(xì)胞質(zhì)段氨基酸作為誘餌蛋白經(jīng)酵母雙雜交鑒定出來(lái)的CD27結(jié)合蛋白，能夠介導(dǎo)CD27引起的細(xì)胞凋亡，并參與許多其他的細(xì)胞凋亡通路。Sival作為一個(gè)多功能的蛋白，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的功能。首先作為P53和E2F1的共同靶基因，可以在線粒體上抑制Bcl-XL的抑凋亡功能而促進(jìn)凋亡，在神經(jīng)細(xì)胞中參與P53引起的細(xì)胞凋亡，以及參與其他多種細(xì)胞凋亡通路。同時(shí)，Sival可以抑制NF-kappaB的活性。 Stathmin又稱(chēng)0pl8，是一個(gè)19KDa，包含149個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)定位的蛋白質(zhì)。Stathmin作為一個(gè)促進(jìn)微管解聚的蛋白，主要含有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，包括N端含有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域和C端與α / β -tubulin異二聚體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。在Stathmin的N端，包含絲氨酸16、25、38和63位4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而只有其中16位的絲氨酸在Stathmin蛋白家族中是保守的。Stathmin在一系列腫瘤中高表達(dá)，包括急性白血病、Wilms腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤和肺癌等等。我們通過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠影響腫瘤轉(zhuǎn)移的基因Sival，它的高表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞從表皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。我們將它作為一個(gè)新的靶位，如果能夠有效的促進(jìn)Sival的表達(dá)和功能，并通過(guò)特異的載體準(zhǔn)確的導(dǎo)向發(fā)生部位，就能有效阻止惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌轉(zhuǎn)移程度越高的病例中，Sival以及受其調(diào)控的pS16_Stathmin均低表達(dá)，因此我們可以將Sival和pS16_Stathmin設(shè)計(jì)成為確定乳腺癌惡性程度的標(biāo)記分子。發(fā)明目的確定Sival (SEQ ID NO 1)作為一個(gè)新的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)，通過(guò)重組腺病毒技術(shù)將Sival過(guò)表達(dá)，抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到治療癌癥的目的。同時(shí),確定Sival和pS16_Stathmin作為乳腺癌惡性程度的標(biāo)記分子,應(yīng)用于臨床對(duì)于乳腺癌的診斷中。

發(fā)明內(nèi)容
我們通過(guò)酵母雙雜交的方法,找到了一對(duì)新的相互作用蛋白-Sival和Stathmin,Sival通過(guò)抑制Stathmin解聚微管的活性,從而抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和腫瘤轉(zhuǎn)移。我們通過(guò)基因干擾的方法，觀察到當(dāng)在腫瘤細(xì)胞中抑制Sival的表達(dá)時(shí)，腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性明顯提高，并且在動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。同時(shí)，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)移程度不同的乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織樣本，發(fā)現(xiàn)Sival和pS16-Stathmin在轉(zhuǎn)移能力越高的細(xì)胞系和病例組織中表達(dá)越低。因此Sival可以作為一個(gè)新的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)，應(yīng)用于研發(fā)抗腫瘤藥物；并且Sival和pS16-Stathmin可以作為乳腺癌惡性程度的標(biāo)記分子,應(yīng)用于臨床對(duì)于乳腺癌的診斷中。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供Sival基因(SEQ ID NO 3)和Stathmin基因(SEQID NO :4)作為靶基因篩選抗癌藥物的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥為急性白血病、Wilms腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤或肺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥為黑素瘤。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供Sival基因(SEQ ID NO :3)，Sival蛋白(SEQ ID NO 1),Stathmin基因(SEQ ID NO 4)和Stathmin蛋白(SEQ ID NO 2)用于制備治療癌癥的治療劑的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢病毒(Lentivirus)作為基因藥物載體攜帶有Sival的cDNA，將其帶到靶位，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。攜帶Sival的cDNA的慢病毒進(jìn)入細(xì)胞后，可使腫瘤中的Sival表達(dá)水平升高，從而抑制腫瘤發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移的能力，達(dá)到治療腫瘤的效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥為急性白血病、Wilms腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤或肺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥為黑素瘤。 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供Sival基因(SEQ ID NO :3)，Sival蛋白(SEQ ID NO I), Stathmin基因(SEQ ID NO 4)和Stathmin蛋白(SEQ ID NO 2)用于制備診斷癌癥的診斷劑的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥為乳腺癌。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供Sival抗體或Stathmin抗體在制備診斷癌癥的診斷劑的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷癌癥為診斷癌癥的轉(zhuǎn)移程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥為乳腺癌。


圖I是描述慢病毒(Lentivirus)作為基因藥物載體攜帶有Sival的cDNA，將其帶到靶位，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移的圖。攜帶Sival的cDNA的慢病毒進(jìn)入細(xì)胞后，可使腫瘤中的Sival表達(dá)水平升高，從而抑制腫瘤發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移的能力，達(dá)到治療腫瘤的效果。圖2是描述Sival和Stathmin兩個(gè)蛋白之間的相互作用。圖3利用微管體外聚集試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Sival可以抑制Stathmin的微管解聚活性。圖4說(shuō)明Sival通過(guò)促進(jìn)Stathmin_Serl6磷酸化來(lái)抑制Stathmin活性。圖5說(shuō)明Sival通過(guò)促進(jìn)CaMK II與Stathmin之間的蛋白相互作用來(lái)促進(jìn)Stathmin-Serl6 憐酸化。圖6說(shuō)明Sival可以抑制EMT以及細(xì)胞遷移。圖7通過(guò)比較轉(zhuǎn)移程度不同的乳腺癌病人的組織樣本，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移程度越高的樣本中Sival和pS16_Stathmin蛋白含量越低。圖8通過(guò)老鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)利用sh-RNA抑制Sival的表達(dá)可以明顯促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，同樣的，過(guò)表達(dá)Sival可以有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。圖9pEGF0_Cl載體中MCS區(qū)域經(jīng)EcoR I+Sal I酶切后插入目的基因Sival片段，Sival序列如SEQ ID NO 3所示。圖10p3*flag-CMV_myc 載體中所示 EcoR I+Sal I 酶切位點(diǎn)處經(jīng) EcoRI+Sal I 酶切后插入目的基因Sival片段，Sival序列如SEQ ID NO 3所示。圖11經(jīng)上海生工合成圖中上方所示的核苷酸，其中sense序列為Sival干擾RNA序列5' -cagtgacatgtacgagaaa-3' , anti-sense 序列為 Sival 干擾 RNA序列的反向互補(bǔ)序列，然后將該序列插入圖中所示載體。具體步驟見(jiàn)Clontech公司protocol。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述，實(shí)施例并不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，其僅是對(duì)本發(fā)明的舉例說(shuō)明。本發(fā)明所用的細(xì)胞除 非另有說(shuō)明，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。實(shí)施例實(shí)施例I酵母雙雜交方法發(fā)現(xiàn)一對(duì)新的相互作用蛋白-Sival和Stathmin的蛋白相互作用我們通過(guò)酵母雙雜交(具體方法見(jiàn)Matchmaker12 Gold Yeast Two-Hybrid SystemUser Manual (clontech))的方法，找到了一對(duì)新的相互作用蛋白-Sival和Stathmin。其中Sival 的氨基酸序列mpkrscpfai vaplqlkvrv sqrelsrgvc aerysqevfektkrllfIga qayldhvwde gcavvhlpes pkpgptgapr aargqmligp dgrlirslgq aseadpsgvasiacsscvra vdgkavcgqc eralcgqcvr tcwgcgsvac tlcglvdcsd myekvlctsc amfet(SEQ IDNO 1)NP_006418. 2)；Stathmin的氨基酸序列 massdiqvke lekrasgqaf elilsprskesvpefplsppkkkdlsIeei qkkleaaeer rksheaevlk qlaekrehek evlqkaieen nnfskmaeeklthkmeanke nreaqmaakl erlrekdkhi eevrknkesk dpadetead(SEQ ID NO :2)CAA3739L I)Sival 的核酸序列atgtcaaacg tgcgagtgtc taacgggagc cctagcctggagcggatgga cgccaggcag gcggagcacc ccaagccctc ggcctgcagg aacctcttcg gcccggtggaccacgaagag ttaacccggg acttggagaa gcactgcaga gacatggaag aggcgagcca gcgcaagtggaatttcgatt ttcagaatca caaaccccta gagggcaagt acgagtggca agaggtggag aagggcagcttgcccgagtt ctactacaga cccccgcggc cccccaaagg tgcctgcaag gtgccggcgc aggagagccaggatgtcagc gggagccgcc cggcggcgcc tttaattggggctccggcta actctgagga cacgcatttggtggacccaa agactgatcc gtcggacagc cagacggggt tagcggagca atgcgcagga ataaggaagcgacctgcaac cgacgattct tctactcaaa acaaaagagc caacagaaca gaagaaaatg tttcagacggttccccaaat gccggttctg tggagcagac gcccaagaag cctggcctca gaagacgtca aacgtaa (SEQID NO :3) NM—006427. 3 ；Stathmin 的核酸序列atggcttctt ctgatatcca ggtgaaagaa ctggagaagcgtgcctcagg ccaggctttt gagetgattc tcagccctcg gtcaaaagaa tctgttccag aattccccctttcccctcca aagaagaagg atctttccct ggaggaaatt cagaagaaat tagaagctgc agaagaaagacgcaagtccc atgaagctga ggtcttgaag cagctggctg agaaacgaga gcacgagaaa gaagtgcttcagaaggcaat agaagagaac aacaacttca gtaaaatggc agaagagaaa ctgacccaca aaatggaagctaataaagag aaccgagagg cacaaatggc tgccaaactg gaacgtttgc gagagaagga taagcacattgaagaagtgc ggaagaacaa agaatccaaa gaccctgctg acgagactga agctgactaa (SEQ ID NO :4)X53305. Io并且我們通過(guò)蛋白質(zhì)免疫共沉淀的方法證明了在細(xì)胞內(nèi)Sival和Stathmin的蛋
白相互作用。
蛋白質(zhì)免疫共沉淀(IP)步驟和所需材料(一)、抗體的偶聯(lián)I.在EP管(江蘇海門(mén)百得福實(shí)驗(yàn)器材公司)中，加入500ul PBS，lug的抗體(Sival (購(gòu)自 SantaCruz)或 Stathmin 抗體(CST 公司))和 Protein A/G Beads (Perice),再加BSA至終濃度至O. 1%。2.將EP管置于4°C, rotation (約50rpm) 4h以上，最高速離心5sec,小心棄去上清。3.在上述偶聯(lián)了 Beads和抗體的EP管中加入Iml相應(yīng)的細(xì)胞U20S細(xì)胞裂解液 (RIPA裂解液，具體配方見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)，顛倒混勻，4°C最高速離心5sec，小心棄去上清O4.重復(fù)步驟3,用細(xì)胞裂解液清洗所述beads 3_4次,最后棄去上清,將beads放4°C備用。(二)、免疫共沉淀I.收集U20S細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。2.加4倍細(xì)胞沉淀體積的RIPA裂解液，并在4 rotation (約50rpm) lh。3. 14000rpm，4°C 離心 15min。4.小心吸取上清,加入到已偶聯(lián)上抗體的beads, 4°C rotation過(guò)夜。5. 4°C最高速(14000rpm)離心5sec,小心吸棄上清。6.加入裂解液重懸beads,最高速離心5sec后，小心吸棄上清。7.重復(fù)步驟6,用裂解液清洗beads 3-4次。8.加入適量的 SDS loading buffer (2 X SDS loading buffer 具體配方見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)，100°c加熱5min后SDS-PAGE分析。圖2A中顯示用Stathmin抗體進(jìn)行免疫共沉淀，能將Sival共沉淀下來(lái)，圖2B中顯示用Sival抗體進(jìn)行免疫共沉淀,能將Stathmin共沉淀下來(lái),說(shuō)明這兩個(gè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用(圖2)實(shí)施例2 Sival抑制Stathmin的微管解聚活性因?yàn)镾tathmin具有解聚微管的功能,利用體外微管聚集試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Sival可以抑制Stathmin的微管解聚活性(圖3A)。體外微管聚集實(shí)驗(yàn)的步驟和所需材料(一)、微管體外聚合實(shí)驗(yàn)I. HEK293T細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))通過(guò)轉(zhuǎn)染(pcDNA_3*Flag-Sival或 pcDNA-3*Flag*_Stathmin 質(zhì)粒(酶切位點(diǎn)EcoR I+Sal I),真核表達(dá) Flag-tag 融合蛋白。pcDNA_3*Flag_Sival 或 pcDNA_3*Flag*-Stathmin 質(zhì)粒的構(gòu)建將 pcDNA_3*Flag質(zhì)粒(購(gòu)自 Clonetech 公司)與 Sival (SEQ ID NO 3)或 Stathmin SEQ ID NO 4 的cDNA序列通過(guò)EcoR I+Sal I進(jìn)行酶切后，連接(具體《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)，得到pcDNA_3*Flag_Sival 或 pcDNA_3*Flag*-Stathmin 質(zhì)粒。2.收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(RIPA裂解液)冰上裂解細(xì)胞。3.將裂解好的細(xì)胞裂解液加入到EZview Red Anti-Flag M2 AffinityGel (Sigma)中，4°C孵育過(guò)夜。4. PBS 重懸清洗 Flag M2 Gel 數(shù)次。5.偶聯(lián)了 Flag-tag 融合蛋白的 Flag M2Gel 中加入適量 3xFlag peptide,4°C孵育Iho6.離心，取上清，所得上清即為純化的Flag-tag融合蛋白。7.將純化的Flag-tag融合蛋白(20ug)以及從豬腦中提純得到的游離態(tài)微管(20ug) (Sigma)加入到微管聚合 buffer (80mM Pipes, pH 6. 8,0. 5mMEGTA,2mM MgCl2, ImMGTP, ImM ATP，和 10% glycerol)中，37。。孵育 lh。8. 15000g 離心 30min,棄上清。 9.用微管聚合buffer重懸沉淀，15000g離心30min,棄上清,所得沉淀即為聚集態(tài)微管。10.加入適量的 SDS loading buffer (見(jiàn)前)，100°C加熱 5min 后 SDS-PAGE 分析，檢測(cè)到不同條件下微管的聚集程度。(二)、微管體外聚合速率實(shí)驗(yàn)將如上純化的Flag-Sival或Flag-Stathmin融合蛋白以及從豬腦中提純得到的游離態(tài)微管(Sigma)加入到微管聚合buffer (80mM Pipes, pH 6. 8,0. 5mM EGTA, 2mM MgCl2,ImM GTP, ImM ATP，和 10% glycerol)中，37°C孵育。取不同組分及不同孵育時(shí)間的樣品，在分光光度計(jì)中測(cè)340nm的吸光值，用來(lái)確定不同樣品的微管聚合程度。由于聚集態(tài)微管是沉淀方式存在，因此聚集態(tài)微管越多，在分光光度計(jì)中測(cè)340nm的吸光值就越低。具體原因見(jiàn)下段。我們發(fā)現(xiàn)Sival可以抑制Stathmin的微管解聚活性(圖3A)。在圖3A中我們發(fā)現(xiàn)，如同預(yù)想的那樣，微管重聚體系中加入Stathmin時(shí)，可以非常明顯的抑制聚集態(tài)微管的生成，而當(dāng)Sival和Stathmin共同加入微管聚合體系中時(shí)，Sival的存在可以顯著抵消Stathmin的微管解聚能力，而不與Stathmin結(jié)合的Sival突變體Flag-Sival Δ C(Sivall_113氨基酸，即缺失114_175aa)卻不能影響Stathmin的活性。而在沒(méi)有Stathmin存在的情況下，Sival并不能單獨(dú)影響微管的聚合。同時(shí)，通過(guò)體外微管聚集速率實(shí)驗(yàn)，更深入證實(shí)了 Sival可以抑制Stathmin的微管解聚活性(圖3B)。同時(shí)，我們利用微管體外重聚速率實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)微管聚合體系中不同時(shí)間段的吸光值，了解不同實(shí)驗(yàn)組中的微管聚合速率(圖3B)。同樣的，Stathmin可以非常明顯地降低微管聚合速率，而Sival的可以顯著抑制這個(gè)過(guò)程,而Sival突變體Flag-Sival Δ C卻沒(méi)有此種功能，充分說(shuō)明了 Sival可以抑制Stathmin的微管解聚活性。實(shí)施{列3Sival倉(cāng)κ夠促進(jìn)Stathmin絲If 16 4立白勺石舞If化由于Stathmin的微管解聚活性受其自身蛋白磷酸化水平影響，其磷酸化水平越高，則活性越小。通過(guò)RNA干擾實(shí)驗(yàn)，我們篩選了穩(wěn)定敲低Sival的U20S細(xì)胞株，如圖4所示的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)敲低Sival能夠引起Stathmin絲氨酸16位磷酸化水平的降低,證明了Sival能夠促進(jìn)Stathmin絲氨酸16位的磷酸化。RNA干擾實(shí)驗(yàn)步驟和所需材料I.轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞(U20S細(xì)胞)傳代(使用DMEM培養(yǎng)液(GIBCO))，使第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率50% -80%左右。2.轉(zhuǎn)染干擾RNA (具體的干擾RNA序列Sival干擾RNA序列5' -cagtgacatgtacgagaaa-3' 0 StathminzPift RNA 5; -aggcaatagaagagaacaa-3'時(shí)制備下列溶液(以24孔為例)Solution A :在 50 μ I OPTI-MEM 培養(yǎng)液(GIBCO)中加入 10 μ M 小分子干擾 RNA。Solution B :在 50 μ I OPTI-MEM 培養(yǎng)液中加入 2 μ I 脂質(zhì)體 Oligofectamin03.將上述兩種溶液混勻，室溫放置20min，使之形成RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。4.將上述混合液中加入O. 8ml不含血清的OPTI-MEM培養(yǎng)液，混勻并加入到細(xì)胞中，37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后換新鮮培養(yǎng)液。
5.將細(xì)胞培養(yǎng)48h后進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。在圖4中可以看到，轉(zhuǎn)染了 Sival干擾RNA序列的細(xì)胞中Sival的蛋白水平明顯降低，而且Stathmin-Serl6磷酸化水平也明顯降低。敲減Sival的蛋白水平,我們發(fā)現(xiàn)Sival通過(guò)促進(jìn)Stathmin_Serl6磷酸化來(lái)抑制Stathmin 活性(圖 4)。實(shí)施例 4SivaI 通過(guò) CaMK II 而不是.CaMK IV 促.講 Stathmin_Serl6 碟酸化已有文獻(xiàn)報(bào)道Stathmin_Serl6磷酸化受CaMK蛋白激酶家族的調(diào)控(MarklundU, et al. (1994)Serine 16 of oncoprotein 18 is a major cytosolic target for theCa2+/calmodulin-dependent kinase-Gr. Eur J Biochem225 :53-60)。通過(guò)實(shí)施例3中的RNA干擾實(shí)驗(yàn)(具體的實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)前)，我們首先確定Sival通過(guò) CaMK II 而不是 CaMK IV 促進(jìn) Stathmin-Ser 16 磷酸化(圖 5A)。我們用小分子干擾RNA(siRNA CaMK II 或 siRNA CaMK IV)(購(gòu)自 santacruzBiotechnology公司)分別敲減了 CaMK II和CaMK IV的表達(dá)水平。如圖5A所示,敲低Sival可以降低Stathmin的磷酸化水平，而當(dāng)細(xì)胞在敲低CaMK II和CaMK IV時(shí),敲低Sival無(wú)法影響Stathmin的磷酸化,但是在敲低CaMK IV的細(xì)胞中，敲減Sival仍然可以影響Stathmin的磷酸化,這就說(shuō)明了 Sival影響Stathmin的磷酸化是通過(guò)CaMK II而非CaMK IV進(jìn)行的。隨后通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)方法(Du ff, et al. (2009) Suppression of p53activity by Sival. Cell Death Differ 16 :1493-1504),我們發(fā)現(xiàn) Sival 通過(guò)促進(jìn) CaMKII與Stathmin之間的蛋白相互作用來(lái)促進(jìn)Stathmin_Serl6磷酸化(圖5B)。如圖5B所示，Stathmin可以同時(shí)與Sival及CaMK II結(jié)合,并且在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Sival可以促進(jìn)內(nèi)源Stathmin與CaMK II的相互作用。實(shí)施例5過(guò)表汰Sival能夠抑制細(xì)胞遷移細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟和所需材料實(shí)驗(yàn)I :I.篩選穩(wěn)定表達(dá)不同GFP (pEGFP質(zhì)粒，購(gòu)自Clonetech公司)或GFP-Sival質(zhì)粒(pEGFP質(zhì)粒與SEQ ID NO :3序列連接)的U20S細(xì)胞，其經(jīng)G418抗性篩選。篩選穩(wěn)定表達(dá)(使用 pLentiLox 3. 7 lentiviral system(Clontech 公司))不同shRNA(Sival 干擾 RNA 序列5 ' -cagtgacatgtacgagaaa-3 1。Stathmin 干擾 RNA 序列5' -aggcaatagaagagaacaa-3')的 MCF-7 細(xì)胞,其經(jīng) Puromycin 抗性篩選(sigma 公司)。GFP-Sival 質(zhì)粒的構(gòu)建
一、DNA片段的連接反應(yīng)按以下比例配制連接反應(yīng)體系外源插入片段(Sival基因，序列如SEQ ID NO 3所示)，濃度100ng/ul6 μ I載體片段(pEGFP載體)，濃度 100ng/ul 2 μ I10 X Ligase Buffer I μ IΤ4 DNA 連接酶(購(gòu)自 TaKaRa 公司，濃度 350U/ μ I I μ I)室溫連接反應(yīng)Ih。構(gòu)建得到的GFP-Sival質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖9 (酶切位點(diǎn)EcoR I+Sal I)。二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化I.取出-80°C凍存的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上復(fù)蘇5-10min。2.加入適量上述構(gòu)建的質(zhì)粒，混勻，冰浴30min。3. 42°C水浴中熱休克90秒，立即放入冰上冰浴2min。4.加入200 μ I無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C，IOOrpm振蕩培養(yǎng)45min。取適量轉(zhuǎn)化的菌體，涂布欲含抗生素的LB平板上，培養(yǎng)過(guò)夜。2.消化上述U20S細(xì)胞或MCF-7細(xì)胞(O. 05% Trypsin(GIBCO公司))，用細(xì)胞計(jì)數(shù) 板(求精牌細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海醫(yī)療器械廠)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù))。3.用移液器重懸約5 X IO5個(gè)細(xì)胞(上述U20S細(xì)胞或MCF-7細(xì)胞)于六孔板中，放入37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)箱)培養(yǎng)。4.待細(xì)胞貼壁后，換無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液(GIBCO) )，37 °C，5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。5.吸去培養(yǎng)基，用200 μ I規(guī)格tips在鋪滿了細(xì)胞的六孔板(Cell Star公司)中平直劃線。6.用PBS清洗，洗去六孔板中因劃痕而脫落的細(xì)胞。7.加入含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)基，37°C，5% 0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。8.分不同時(shí)間段在顯微鏡(Olympus X61)下拍照，觀察比較不同孔中劃痕的愈合情況。結(jié)果見(jiàn)圖6B。實(shí)驗(yàn)2:1.U20S細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染I.轉(zhuǎn)染前一天將U20S細(xì)胞傳代，使第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率50% -80%左右。2.轉(zhuǎn)染時(shí)制備下列溶液(以24孔為例)Solution A :在 50 μ I 不含血清的培養(yǎng)液中加入 0. 5-1 μ gDNA (GFP-Sival)。Solution B :在50 μ I不含血清的培養(yǎng)液(opti-MEM培養(yǎng)液,購(gòu)自promega公司)中加入2 μ I脂質(zhì)體Lipofectamin2000試劑(購(gòu)自Invitrogen公司)。3.將上述兩種溶液混勻，室溫放置20min，使之形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。4.將混合液中加入0. 8ml不含血清的培養(yǎng)液，混勻并加入到細(xì)胞中，37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后換新鮮培養(yǎng)液5.將細(xì)胞培養(yǎng)24h后進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
(pcDNA_3*Flag_Sival 或pcDNA_3*Flag*_Sival AC質(zhì)粒(pcDNA_3*Flag_Sival 或pcDNA-3*Flag*-Sival Δ C質(zhì)粒,構(gòu)建方法同前面GFP融合質(zhì)粒的構(gòu)建。Sival氨基酸序列見(jiàn)前，Sival Δ C的氨基酸序列見(jiàn)Sival的序列(1_114氨基酸)，pcDNA質(zhì)粒購(gòu)自sigma公司，構(gòu)建后的質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖10。(酶切位點(diǎn)EcoR I+Sal I)，真核表達(dá)Flag-tag融合蛋白。2.收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(RIPA裂解液)冰上裂解上述細(xì)胞。3.加入適量的 SDS loading buffer (2 X SDS loading buffer 具體配方見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)，100°c加熱5min后SDS-PAGE分析.4. SDS-PAGE電泳結(jié)束后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。電流恒定為350mA電轉(zhuǎn)移I. 5小時(shí)，將凝膠上蛋白樣品(轉(zhuǎn)染了 pcDNA_3*Flag_Sival 或 pcDNA_3*Flag*_Sival Δ C 質(zhì)粒的 U20S細(xì)胞經(jīng)蛋白變性的樣品)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)(Amersham公司)。5.用麗春紅溶液(配方見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)將NC膜染色，觀察轉(zhuǎn)移情況 6.用封閉液(封閉液5%脫脂奶粉inTBSTTBST =Tris-HCL(PH7. 5) 20mMNaCl150mMTween-200. 5%)封閉Ih。7.倒出封閉液,TBST洗一次,加入一抗(Flag抗體,購(gòu)自Sigma公司，E-cadherin,a -catenin 和 fibronectin 抗體均購(gòu)自 BS 公司，vimentin 抗體購(gòu)自 Thermo 公司，GAPDH抗體購(gòu)自abeam公司)，室溫?fù)u床上慢速孵育I. 5h。8.吸取上述一抗，用TBST洗膜，每次5min，洗3次。9.加入相應(yīng)的二抗(AP-mouse和AP_rabbit均購(gòu)自Pierce公司),室溫?fù)u床上慢速孵育45min。10.吸取二抗，用TBST洗膜，每次5min，洗3次。11.加入適量的底物(Alkaline Phosphatase (AP) detection system 購(gòu)自 pierce公司)，反應(yīng)直至觀察到清晰的目的條帶，即Flag-Sival/Flag-Sival AC, E-cadherin,a -catenin 和 fibronectin, vimentin, GAPDH 等六個(gè)目的條帶。結(jié)果見(jiàn)圖6A。如圖6A所示(實(shí)驗(yàn)2),通過(guò)過(guò)量表達(dá)野生型的Sival以及不與Stathmin結(jié)合的Sival突變體Sival Δ C,經(jīng)western blot檢測(cè)上皮細(xì)胞的標(biāo)記蛋白E-cadherina -catenin,以及間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白vimentin和fibronectin的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)，在U20S細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Sival,能夠上調(diào)上皮細(xì)胞的標(biāo)記蛋白E-cadherin和a -catenin的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白vimentin和fibronectin的表達(dá),而Sival Δ C的表達(dá)則不會(huì)引起此種現(xiàn)象，說(shuō)明Sival能夠抑制EMT (表皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化)。因?yàn)镋MT可以直接(參考文獻(xiàn)Thiery JP, Acloque H, Huang RY, Nieto MA (2009)Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Celll39 871-890)影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力，因此，Sival的過(guò)表達(dá)可以影響腫瘤細(xì)胞的遷移。如圖6B所顯示(實(shí)驗(yàn)I)，我們利用篩選的穩(wěn)定表達(dá)GFP/GFP-Sival細(xì)胞株通過(guò)細(xì)胞劃線實(shí)驗(yàn)，證明Sival可以抑制細(xì)胞遷移(圖6B)。我們篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP和GFP-Sival的U20S細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞鋪板和同步化后，在細(xì)胞培養(yǎng)板中劃下同樣寬度的劃痕，發(fā)現(xiàn)在24h后，穩(wěn)定表達(dá)GFP-Sival的U20S細(xì)胞在劃痕兩側(cè)的愈合速度明顯慢于表達(dá)GFP的細(xì)胞，說(shuō)明過(guò)表達(dá)Sival能夠抑制細(xì)胞遷移。腫瘤細(xì)胞的顯著特征之一就是具有很強(qiáng)的細(xì)胞遷移能力，抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移能力，就能夠明顯的抑制腫瘤的器官轉(zhuǎn)移。Sival能夠抑制細(xì)胞遷移，則表示Sival能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移,如圖6B所示。實(shí)施例6Sival對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用由于Sival可以通過(guò)影響Stathmin_Serl6磷酸化水平來(lái)影響細(xì)胞遷移，我們收集不同乳腺癌患者的病理樣本(正常組織/原位乳腺癌組織/已轉(zhuǎn)移乳腺癌組織)，通過(guò)western blot方法,檢測(cè)了不同乳腺癌病人組織樣本中Sival和Stathmin_Serl6的蛋白水平。Western Blot (一)、材料I.轉(zhuǎn)移 buffer :Tris5. 8gGlycine 2. 9gSDS0. 37gMethnol 200mlddH20 定容至 1L。2. TBST =Tris-HCL(PH7. 5) 20mMNaCl150mMTween-200. 5%3.封閉液5%脫脂奶粉in TBST4.ProtoBlot II AP System with Stabilized Substrate(Promega, USA)5. Lumi-Phos WB (Pierce, USA)(二)、方法I. SDS-PAGE電泳結(jié)束后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。電流恒定為350mA電轉(zhuǎn)移I. 5小時(shí)，將凝膠上蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)(Amersham公司)。2.麗春紅溶液(配方見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)將NC膜染色，觀察轉(zhuǎn)移情況3.用封閉液封閉Ih。4.倒出封閉液，TBST洗一次，加入一抗(針對(duì)的具體的Sival蛋白)購(gòu)自santacruz 公司，pS16_Stathmin 購(gòu)自 CST 公司，Stathmin 抗體購(gòu)自 CST 公司，actin 抗體購(gòu)自abeam公司)，室溫?fù)u床上慢速孵育I. 5h。5.吸取一抗，用TBST洗膜，每次5min，洗3次。6.加入相應(yīng)的二抗(AP-mouse和AP_rabbit均購(gòu)自Pierce公司),室溫?fù)u床上慢速孵育45min。7.吸取二抗，用TBST洗膜，每次5min，洗3次。8.加入適量的底物(Alkaline Phosphatase (AP) detection system 購(gòu)自 pierce公司)，反應(yīng)直至觀察到清晰的目的條帶，即Sival, pS16-Stathmin, Stathmin, actin四個(gè)目的條帶。從臨床醫(yī)院安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中取乳腺癌病理組織樣本，包括正常的乳腺癌癌旁組織(Normal tissues, N),原位的乳腺癌組織(Primary breast tumors, T)以及轉(zhuǎn)移至其他部位的乳腺癌組織(metastatic breast tumors, Μ)。樣品經(jīng)醫(yī)院采集患者病患組織時(shí)收集，Sival和pS16-Stathmin蛋白含量經(jīng)western blot方法檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移程度越高的樣本中Sival和pS16-Stathmin蛋白含量越低,從而在病理水平證明了 Sival對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用(圖7)。在這些病例組織中檢測(cè)Sival和pS16-Stathmin的表達(dá)水平。結(jié)果如圖7所示,隨著惡性程度的升高，Sival和pS16-Stathmin的表達(dá)水平明顯降低。實(shí)施例7敲減Sival可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移利用篩選得到的穩(wěn)定敲減Sival的細(xì)胞株，通過(guò)小鼠尾靜脈注射的小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)敲減Sival可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移(圖8A)。體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)I.購(gòu)買(mǎi)約6周齡Balb/C nude mice (購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，置于SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)一周。 2.取 shRNA-vector、shRNA_Sival (pSUPER shRNA system 購(gòu)自 Clontech 公司)和穩(wěn)定表達(dá)pGL3-Basic vector質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞，(其中具體的干擾序列同Sival干擾RNA序列和Stathmin干擾RNA序列，具體方法見(jiàn)pSUPER shRNA system clontech公司，細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，或GFP、GFP-mSival (表達(dá)GFP/GFP-mSival質(zhì)粒的細(xì)胞系用B16-F10細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染GFP/GFP-mSival質(zhì)粒，再用G418抗性篩選(sigma公司)，計(jì)數(shù)I X IO6個(gè)細(xì)胞)穩(wěn)定表達(dá)的B16-F10細(xì)胞(Stathmin)。上述構(gòu)建后的質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖11。3.將上述計(jì)數(shù)所得細(xì)胞，通過(guò)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，小鼠培養(yǎng)3周。4.向小鼠腹腔注射約 150μ I 含 3mg D-Iuciferin(GOLDBIO)的 PBS, 15min 后，將小鼠放入小動(dòng)物成像系統(tǒng)IVIS200 (Caliper LS)中進(jìn)行熒光素酶成像拍照。5.將小鼠處死，取小鼠的肝臟和肺，浸泡在D-Iuciferin/PBS溶液中15min，然后在小動(dòng)物成像系統(tǒng)IVIS200中拍照。6.使用LivingImage version 2. 6software計(jì)算不同小鼠的突光素酶發(fā)光強(qiáng)度。我們發(fā)現(xiàn)敲減Sival可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移(圖8A)。首先，在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞中篩選帶有熒光素酶標(biāo)記的shRNA-vector或shRNA-Sival的穩(wěn)定細(xì)胞株，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將等量細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，21天后，從小鼠腹腔注射熒光素酶底物，在小鼠活體成像系統(tǒng)中觀察不同實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果如圖8A所示，注射細(xì)胞前經(jīng)Western blot檢測(cè),shRNA-Sival質(zhì)粒的引入導(dǎo)致Sival敲減效果是明顯的。注入細(xì)胞2天后，兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組的小鼠尾部附近聚集基本等量的帶有熒光素酶的細(xì)胞，說(shuō)明兩組老鼠中注入的細(xì)胞確實(shí)是等量的。而小鼠經(jīng)飼養(yǎng)21天后熒光素酶成像的結(jié)果表明，相對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)shRNA-vector的MCF-7細(xì)胞，表達(dá)shRNA-Sival的MCF-7細(xì)胞具有明顯增強(qiáng)的腫瘤轉(zhuǎn)移能力。另外，我們將兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的14只小鼠處死，取各自的肝臟和肺，經(jīng)熒光素酶底物浸泡，在成像系統(tǒng)下拍照，得到了同樣的結(jié)果，都說(shuō)明了敲減Sival能夠促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移。同時(shí)，通過(guò)注射穩(wěn)定表達(dá)GFP-Sival的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株，證明過(guò)量表達(dá)(注射前經(jīng)western blot方法檢測(cè)GFP-Sival的表達(dá))Sival可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移(圖8B)。我們使用了轉(zhuǎn)移能力很高的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10，篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP和GFP-mSival質(zhì)粒的細(xì)胞株，使用同樣的方法將等量的兩組細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入裸鼠中。約18天后，將小鼠處死，取各自的肝臟，如圖SB所示，注入B16-GFP細(xì)胞的小鼠肝部有非常明顯的黑色素瘤克隆形成，相反的是，注入B16-GFP-mSival細(xì)胞的小鼠，肝部的黑色素瘤克隆的形成能力大大降低，說(shuō)明在黑色素瘤中，過(guò)表達(dá) Sival可以明顯抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
權(quán)利要求
1.Sival基因(SEQ ID NO :3)和Stathmin基因(SEQ ID NO :4)作為靶基因篩選抗癌藥物的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述癌癥為急性白血病、Wilms腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤或肺癌。
3.Sival 基因(SEQ ID NO :3)，Sival 蛋白(SEQ ID NO : I)，Stathmin 基因(SEQ ID NO:4)和Stathmin蛋白(SEQ ID NO 2)用于制備治療癌癥的治療劑的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中將慢病毒(Lentivirus)作為基因藥物載體攜帶有Sival的cDNA,將其帶到祀位,抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述癌癥為急性白血病、Wilms腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤或肺癌。
6.Sival 基因(SEQ ID NO :3)，Sival 蛋白(SEQ ID NO : I)，Stathmin 基因(SEQ ID NO:4)和Stathmin蛋白(SEQ ID NO 2)用于制備診斷癌癥的診斷劑的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述癌癥為乳腺癌。
8.Svial抗體或Stathmin抗體在制備診斷癌癥的診斷劑的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述癌癥為乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志基因(Siva1基因)及其用于抗癌的新藥物開(kāi)發(fā)的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述Siva1基因在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用以及在制備診斷癌癥的診斷劑中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102876770SQ20121007485
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者吳緬, 李楠 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)