專利名稱：臍帶血間充質(zhì)干細胞分離液及分離流程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進的臍帶血間充質(zhì)干細胞分離液及優(yōu)化分離流程。
背景技術(shù)：
國內(nèi)、外分離臍帶血干細胞方法常采用磁珠/流式細胞分選法、臍血庫儀器/羥乙基淀粉沉淀法和密度梯度離心法。由于目的不同，各類方法有其自身特點。磁珠法或流式細胞分選法應用相應單克隆抗體分離得到較純的細胞群體，但細胞收獲率較低，適宜做分析及科研應用。臍血庫分離干細胞常用羥乙基淀粉沉淀和儀器離心分離法，分離的細胞量大、 成分較多但混有大量紅細胞，適用于大量分離、儲存干細胞。密度梯度離心法采用Ficoll 分離液分離細胞，得到單個核細胞(Mononuclear cells, MNC)群。目前可查到I個美國專利(專利I)[1]和2個中國專利(專利2、專利3) [μ用密度梯度離心法分離MNC。專利I、 2所用分離液密度均為I. 077g/L，專利3所用分離液密度為I. 075g/L。這兩個密度的分離液分離得到的實際上是一組包括淋巴細胞、單核細胞、間充質(zhì)干細胞、造血干細胞及少量分葉核細胞在內(nèi)的MNC群。因此，選擇簡單、實用、成本低廉的密度梯度離心法從臍帶血中分離得到最大比例間充質(zhì)干細胞，直接作臨床應用或繼續(xù)培養(yǎng)、擴增細胞是需要解決的主要技術(shù)問題。干細胞分離過程中的各種實驗條件，如離心力、離心時間、分離液與稀釋臍帶血比例、溫度、試劑準備等環(huán)節(jié)各家報道差別很大，更無客觀和科學的標準。建立一套優(yōu)化的最佳分離流程即標準操作流程是臍帶血干細胞臨床應用中亟待解決的方法學問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于尋找一種密度梯度離心法分離臍帶血干細胞的最佳分離液密度并建立一套分離流程。該密度分離液能分離出比例最高的間充質(zhì)干細胞；對實驗過程中的各種條件進行優(yōu)選，建立相應配套流程；實驗所用各種材料、試劑均為無菌無熱源醫(yī)用級產(chǎn)品，能夠滿足臨床治療級制備干細胞的需要。為解決上述問題本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種新的人臍帶血間充質(zhì)干細胞分離液，其密度是I. 073±0. 001g/L。該分離液由 9%聚蔗糖與33. 9%泛影葡胺按26. 88份與10份配伍而成。其配法如下藥用級聚鹿糖(polysucrose solution)干粉,分子量400 000,先用滅菌無熱源蒸餾水配置成40 ± I % (w/v)水溶液，備用。應用時，用蒸餾水配置9%溶液。60%泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),結(jié)構(gòu)式為3, 5-二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸I-去氧-甲氨基山梨醇(醫(yī)用造影劑)。應用時取60%泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15. 38ml即為 33. 9%泛影葡胺。在室溫(18 20°C)下，取9%聚蔗糖26. 88份、33. 9%泛影葡胺10份充分混勻，用波美比重計測混合液比重或適當調(diào)整兩者體積，即得1.073±0. 001g/L臍帶血間充質(zhì)干細胞分離液。分裝成IOOml/瓶，過濾除菌，室溫避光保存。可用下列公式計算分離液密度或兩者體積分離液比密=[9%聚蔗糖的比密X其體積+33. 9%泛影葡胺的比密X其體積]/二者的體積之和。一種優(yōu)選的人臍帶血間充質(zhì)干細胞分離流程[4]:采用兩步法分離臍帶血間充質(zhì)干細胞第一步，6%羥乙基淀粉沉淀紅細胞；第二步，密度1.073g/L分離液分離間充質(zhì)干細胞。第一步輕乙基淀粉沉淀紅細胞。取枸櫞酸鈉抗凝臍血80 100ml,無菌操作加入500ml圓形沉降瓶中，加臍帶血量2倍體積的PBS，充分混勻。加臍帶血量2倍體積的醫(yī)用6%中分子羥乙基淀粉130/0. 4氯化鈉注射液，充分混勻，蓋蓋(不要蓋緊)，20°C，靜置 60mino第二步應用密度I. 073g/L分離液密度梯度離心法分離間充質(zhì)干細胞。吸取羥乙基淀粉沉淀紅細胞后的上清液，緩慢加至分離液液面上(上清液分離液為I : I)。置水平離心機上，4°C，離心力700g，離心30min。離心后用移液管伸到單個核細胞(云霧層混濁帶)層，輕輕吸出，加入到PBS液中，4°C，洗滌細胞3遍。即得到臍帶血間充質(zhì)干細胞。取少量樣品做細胞計數(shù)、檢測細胞活性，完成質(zhì)檢和質(zhì)控。本發(fā)明的分離液和分離流程可分離得到臍帶血中最大比例的間充質(zhì)干細胞，淋巴細胞和單核細胞比例很小，獲得的細胞狀態(tài)好、活力高。可直接應用于臨床治療或進一步培養(yǎng)、擴增。還可用于外周血、骨髓間充質(zhì)干細胞細胞的分離提取。是目前密度梯度離心法中分離提取間充質(zhì)干細胞的最優(yōu)方法。本分離液所用材料、試劑均為醫(yī)用級產(chǎn)品，便于儲存， 無毒無熱源，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；所用方法為優(yōu)化的流程，簡單、易行，穩(wěn)定性好，重復性好，可廣泛推廣應用。優(yōu)于其它同類產(chǎn)品和方法。本發(fā)明分離液與其它密度分離液分離效果比較，及實驗流程對比分析優(yōu)化結(jié)果如下第一部分本發(fā)明分離液與其它密度分離液分離效果比較。I材料與方法I. I臍帶血來源本院健康產(chǎn)婦臍血。產(chǎn)婦年齡24 35歲。檢查無肝炎、梅毒、艾滋病及其他妊娠并發(fā)癥。實驗共使用臍血30份，每份80 120ml，無菌采集后3小時內(nèi)處理。I. 2主要試劑和儀器設備PBS 緩沖液，6 % 羥乙基淀粉，CD34-PE, CD45-FITC, CD14-APC，CD90-FITC, CD3-PerCP，CD29-APC，CD73-PE，CD105-PE購自美國BD公司。9%聚蔗糖液購自上海試劑二廠，33. 9%泛影葡胺購自上海信誼制藥廠。光學顯微鏡、生物安全柜、電子秤、pH計、離心機、 大容量移液槍、超純水制造系統(tǒng)、流式細胞儀(BD公司)。I. 3三種密度的分離液配制方法同上。可得到密度為I. 073±0· 001 (本品)、1· 075±0. 001、I. 077±0. OOlg/ L 3種密度的分離液。I. 4羥乙基淀粉沉淀紅細胞方法同上。I. 5密度梯度離心法分離單個核細胞分別用三種密度的分離液分離臍帶血MNC，其它方法同上。MNC質(zhì)量鑒定采用胎盼藍拒染法檢測細胞活性；計數(shù)盤法計數(shù)MNC總數(shù)。
I. 6流式細胞儀檢測單個核細胞純度取100 μ I單個核細胞懸液(細胞密度約I X IO6)，加100 μ I FITC或PE標記的特異性熒光直標單抗，包括 CD34-PE，CD45-FITC，CD14-APC，CD3_PerCP，CD90-FITC，CD29-APC， ⑶73-PE，⑶105-PE。另一份加入熒光標記的無關(guān)單抗，作為同型對照樣品，室溫下避光反應 15 30min。加入500 μ I PBS重懸成單細胞懸液，流式細胞儀檢測。2 結(jié)果2. I三種密度的分離液分離臍帶血MNC總數(shù)及細胞活力比較三種分離液分離臍帶血MNC的總數(shù)和細胞活力，如表I。表I.三種密度分離液分離臍血MNC總數(shù)及細胞存活率(η = 30)
權(quán)利要求
1.一種人臍帶血間充質(zhì)干細胞分離液，其特征在于所述的分離液是由9%聚蔗糖液 26. 88份和33. 9%泛影葡胺10份混合制成，密度為I. 073±0. 001的應用液。其中分離液的密度有別于其它同類產(chǎn)品。
2.兩步法分離臍帶血間充質(zhì)干細胞流程第一步，6%羥乙基淀粉沉淀紅細胞；第二步，根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離液分離間充質(zhì)干細胞。其特征在于第一步羥乙基淀粉沉淀紅細胞。取枸櫞酸鈉抗凝臍血80 100ml,無菌操作加入500ml圓形沉降瓶中，加臍帶血量2倍體積的PBS，充分混勻。加臍帶血量2倍體積的醫(yī)用6%中分子羥乙基淀粉130/0. 4 氯化鈉注射液，充分混勻，蓋蓋(不要蓋緊)，20°C，靜置60min。第二步應用密度I. 073g/ L分離液密度梯度離心法分離間充質(zhì)干細胞。吸取羥乙基淀粉沉淀紅細胞后的上清液，緩慢加至分離液液面上(上清液分離液為I : I)。置水平離心機上，4°C，離心力700g，離心 30min。離心后用移液管伸到單個核細胞(云霧層混濁帶)層，輕輕吸出，加入到PBS液中， 4°C，洗滌細胞3遍。即得到臍帶血間充質(zhì)干細胞。其中分離流程中的如下操作要點有別于其它同類產(chǎn)品所述方法第一步臍帶血量PBS = I : 2 ;稀釋臍帶血6%中分子羥乙基淀粉130/0. 4氯化鈉注射液=I 2 ;蓋蓋(不要蓋緊)；20°C，靜置60min。第二步羥乙基淀粉沉淀紅細胞后的上清液權(quán)利要求I所述的分離液=I I ;置水平離心機上，4°C， 離心力700g,離心30min。
全文摘要
一種人臍帶血間充質(zhì)干細胞分離液及其分離流程。分離液由9％聚蔗糖與33.9％泛影葡胺按26.88∶10配伍而成，密度1.073±0.001g/L。兩步法分離臍帶血間充質(zhì)干細胞流程第一步羥乙基淀粉沉淀紅細胞。第二步密度1.073g/L分離液分離間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明分離液和分離流程可得到臍帶血中最大比例的間充質(zhì)干細胞，淋巴細胞和單核細胞比例很小，獲得的細胞狀態(tài)好、活力高。所用材料、試劑為醫(yī)用級產(chǎn)品，無毒無熱源，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，便于儲存。所用方法為優(yōu)化的流程，穩(wěn)定性、重復性好。還可用于人骨髓、外周血間充質(zhì)干細胞的分離。是目前密度梯度離心法中分離提取間充質(zhì)干細胞的最優(yōu)方法，優(yōu)于其它同類產(chǎn)品和方法。
文檔編號C12N5/0789GK102604890SQ20121007920
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者劉愛兵, 張姍姍, 張蕊, 戴成祥, 沈丹, 沈炳謙, 王東平, 王黎明, 郭繼強 申請人:劉愛兵, 沈炳謙