專利名稱：一種檢測狂犬病毒屬病毒的codehop rt-pcr試劑及方法
技術領域：
本發明涉及狂犬病毒的檢測技術，具體涉及ー種檢測狂犬病毒屬病毒的C0DEH0PRT-PCR試劑及方法。
背景技術：
狂犬病毒屬分為7個基因型狂犬病病毒(classical rabies virus),拉各斯蝙幅病毒(Lagos bat virus),莫科拉病毒(Mokola virus),杜文海格病毒(Duvenhagevirus),歐洲蝙蝠狂犬病毒I型(European bat lyssavirus types I),歐洲蝙蝠狂犬病毒 2 型(European bat lyssavirus types 2 ),澳大利亞蝙幅狂犬病毒(Australian batlyssavirus).國內流行的野毒株為基因I型，近十年來中國狂犬病的發病率及死亡率一直 維持在毎年超過2000人的高位?；?型飛型僅在非洲和歐洲發現，5型和6型在歐洲蝙蝠中比較普遍，雖感染人的病例不多，但幾乎每型病毒都曾致死人?？紤]到歐亞大陸的連續性和國際貿易的頻繁往來，無法排除其余基因型狂犬病毒的傳入。目前，狂犬病毒的檢測方法主要有病毒分離、實驗動物攻毒、血清學檢測方法和基因檢測方法。基因檢測方法主要是反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，如授權公告號為CN 101153344，名稱為狂犬病毒套式RT-PCR檢測方法及檢測試劑盒的發明專利，就公開了以外套PCR預混體系和內套PCR預混體系的RT-PCR技術，可以完成全部7個基因型的檢測，外套引物擴增產物大小是845bp，內套引物擴增產物大小是371bp，內套引物是以不同基因型RV特點設計的簡并引物。該發明專利雖然可檢測所有狂犬病毒屬的基因型，但需要外套PCR預混體系和內套PCR預混體系ニ種檢測試劑共同檢測，檢測方法復雜，檢測時間也較長，且不能有效確認具體基因型，更無法鑒定狂犬病毒屬內的未知病毒或可能出現其他基因型的病毒。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測狂犬病毒屬病毒的C0DEH0P RT-PCR試劑及方法，該C0DEH0P RT-PCR試劑只用一組引物下，特異性更；用該C0DEH0P RT-PCR試劑檢測狂犬病毒屬時間較短，方法簡便，靈敏性高，且可以確認具體基因型，以及鑒定狂犬病毒屬內的未知病毒或可能出現其他基因型的病毒。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種檢測狂犬病毒屬的C0DEH0P RT-PCR試劑，包括引物溶液，所述引物溶液中含有核苷酸序列為5’ -TTTGTTTTCTGACAAGAATG ACAAATatha ayathaa -3’ 的上游引物 KQZ1，和核苷酸序列為 5’ -TTTTGCTGCATGTCTAACTT Cttgrtcnac cca -3’的下游引物KQZ2，上述序列中其中h含義為a或c或t/u, y含義為c或tAi，r含義為g或a, η含義為g或a或c或tAl或其它。檢測狂犬病毒屬病毒的方法，其步驟如下
a、RNA提取用RNA提取試劑盒(購自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說明書進行；
b、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒(購于Promega公司)對上述RNA進行RNA逆轉錄，得到PCR模板,具體逆轉錄方法依說明書進行在0.2mL eppendorf管中加入oligo d (T)15primers (50mM) I μ L，上述RNA 10μ L,72°C 10. min，再加入反應試劑，20 μ L反應體系中AMV反轉錄酶終濃度為O. 5U/ μ L，RNA酶抑制劑終濃度為O. 5U/ μ L，dNTP終濃度為O. 5mM,4μ L RT-buffer 5 X，反應條件為42°C 60min，72°C IOmin ;反應產物即為后續的PCR模板；
c、PCR反應在 O. 2mL 印pendorf 管中加入 10 XPCR 緩沖液(PCR buffer)2· 5 μ L、濃度為25mM的MgCl2溶液I. 5 μ L、濃度為IOmM的dNTP液0. 5 μ L、濃度為5U/ μ L的Taq酶液
0.5 μ L、含濃度都為25 μ M的上游引物KQZl和下游引物KQZ2的引物溶液I μ L、上述PCR模板2yL，滅菌去離子水16yL，組成PCR反應體系；反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火 30s，72°C 延伸 lmin，35 個循環，72°C延伸 7min，4°C保存 PCR 產物；
d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產物用重量百分濃度為1-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶，電泳條件電壓IOOv, 30min,將電泳結果用凝膠成像系統分析,若結果出現548bp大小片段的條帶，則為狂犬病毒屬病毒，對548bp大小片段的條帶測序，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :3所示則為阿拉萬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示則為澳大利亞蝙蝠狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQID NO :5所示則為杜文海格病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :6所示則為歐洲蝙蝠狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :7所示則為伊爾庫特病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :8所示則為苦盞病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:9所示則為拉各斯蝙蝠病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 10所示則為奧澤爾狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :11所示則為莫科拉病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO12所示則為經典狂犬病病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:13所示則為希莫尼蝙蝠病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : 14所示則為高加索蝙幅病毒。以上PCR buffer、MgCl2、dNTP液、Taq酶液等反應試劑均購自大連寶生生物，引物由上海生工合成。根據Genbank上已有已分類具有L片段全片段基因7個基因型病毒株，選取12株代表性病毒株計引物對。從genbank中下載狂犬病毒屬各種病毒的L基因組片段的蛋白質序列。將蛋白序列以FASTA格式保存，將下載的FASTA格式的氨基酸序列信息輸入進行Block比對，得到高度保守的連續氨基酸區域。使用CodeHop引物捜索，篩選合適上下游引物。要求簡并度低，上下游引物位置間距在500bp左右。利用primer和oligo軟件進行引物分析，得到C0DEH0P引物I對KQZl和KQZ2。與現有技術相比，本發明的優點在于ー種檢測狂犬病毒屬病毒的C0DEH0P RT-PCR試劑及方法，引物溶液中含有核苷酸序列為TTTGTTTTCT GACAAGAATG ACAAATatha ayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列為TTTTGCTGCA TGTCTAACTT Cttgrtcnac cca的下游引物KQZ2，其中5'端非兼并共有序列夾和很短的3 '端根據保守氨基酸設計的核心簡并區組成，5'端非兼并共有序列在不增加引物簡并度的情況下其穩定3 '兼并核心區與模板結合作用，允許在較高退火溫度下進行，提高了兼并PCR反應的特異性，通過RNA提取、RNA逆轉錄、PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物序列長度為548bp ;對特異性擴增序列進行測序，可以確認阿拉萬病毒、澳大利亞蝙蝠病毒、杜文海格病毒、歐洲蝙蝠狂犬病毒、伊爾庫特病毒、苦盞病毒、拉各斯蝙 蝠病毒、奧澤爾狂犬病毒、莫科拉病毒、經典狂犬病病毒、希莫尼蝙蝠病毒和西高加索蝙蝠病毒等，同時能對狂犬病毒屬內基因同源的未知病毒進行檢測，所獲得的生物信息學數據可以用于狂犬病毒的分子流行病學調查研究。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進ー步詳細描述。實施例I :RT_PCR方法檢測狂犬病毒細胞培養物
1、RNA提取用RNA提取試劑盒(購自Qiagen公司)提取狂犬病毒疫苗株Vero細胞(寧波榮安生物藥業有限公司饋贈)的RNA，得到RNA，具體提取方法依說明書進行，同時用正常VeiO細胞提取RNA作為陰性對照。用微量分光光度計測量RNA濃度和純度，0D260/280 ^ 1.9,表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質污染；
2、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒對上述RNA進行RNA逆轉錄，得到PCR模板在O. 2mL eppendorf 管中加入 oligo d (T) 15 primers IyL (50 μ M) , RNA 10 μ L, 72°C 10.min，加入 4yL RT buffer 5X、lyL dNTP (10mM)、AMV 反轉錄酶 I μ L (IOU/μ L)、RNaseInhibitor 0· 5 μ L、Rnase-free Water I. 5μ L,42°C lh,72°C IOmin0 反應產物作為后續的PCR模板；
3、PCR反應在 0. 2mL 印 pendorf 管中加入 10 XPCR buffer2. 5 μ L, MgCl2L 5μ L(25mM)、dNTP (IOmM) 0· 5 μ L、Taq (5U/μ L) O. 5 μ L、引物溶液(上、下游引物都為 25 μ M)14し？0 模板2レし,DDff 16 μし94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸Imin，35個循環，72 °C延伸7min，4°C保存PCR產物；
4、瓊脂糖凝膠電泳將RT-PCR產物用1-1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帯，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結果用凝膠成像系統分析。結果狂犬病毒疫苗株Vero細胞培養物出現548bp大小片段，而正常Vero細胞培養物無特異性目的條帶，測序其序列如序列表SEQ ID NO : 12所示，為經典狂犬病病毒。RT-PCR方法靈敏性按照上述步驟1-4的方法進行檢測，用分光光度計檢測提取狂
犬病毒疫苗株感染的VeiO細胞，步驟I提取的RNA濃度為SOng/yL，將RNA用Rnase-free Water 10倍梯度稀釋。結果顯示本檢測方法可以檢測出的最高稀釋度為1θΛ相當于濃度50pg核酸的病毒RNA都可以檢測。RT-PCR方法特異性按照上述步驟1-4的方法，用狂犬病毒疫苗株RNA、漢坦病毒 RNA、甲型HlNl流感病毒RNA、柯薩奇病毒RNA、流行性こ型腦炎RNA，正常Vero細胞
RNA，作為檢測對象，用KQZl/ KQZ2引物對擴增，結果只有狂犬病毒疫苗株核酸擴增產物出現一條548bp特異性條帶外，漢坦病毒、甲型HlNl流感病毒、柯薩奇病毒、流行性こ型腦炎病毒及正常Vero細胞RNA擴增產物均未見特異性核酸條帶。實施例2、利用PCR方法檢測杜文海格病毒陽性質粒將人工合成的杜文海格病毒核酸(SEQ ID勵:5)片段(寶生物合成)，連接至？1 18づ載體，轉化至DH5a大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養，使用質粒提取試劑盒(購自上海生エ)提取質粒作為陽性模板和陰性對照模板；再按實施例I步驟3的方法進行PCR反應，步驟4的方法進行瓊脂糖凝膠電泳，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例3、利用PCR方法檢測拉各斯蝙蝠病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的拉各斯蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:9)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例4、利用PCR方法檢測莫科拉病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的莫科拉病毒核酸(SEQ ID NO: 11)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例5、利用PCR方法檢測澳大利亞蝙蝠狂犬病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的澳大利亞蝙蝠狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:4)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例6、利用PCR方法檢測阿拉萬病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的阿拉萬病毒核酸(SEQ ID N0:3)片段(寶生物合成)，結果也得 到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例7、利用PCR方法檢測歐洲蝙蝠狂犬病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的歐洲蝙蝠狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:6)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例8、利用PCR方法檢測伊爾庫特病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的伊爾庫特病毒核酸(SEQ ID N0:7)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例9、利用PCR方法檢測苦盞病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的苦盞病毒核酸(SEQ ID N0:8)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例10、利用PCR方法檢測奧澤爾狂犬病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的奧澤爾狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:10)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例11、利用PCR方法檢測希莫尼蝙蝠病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的希莫尼蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:13)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。實施例12、利用PCR方法檢測高加索蝙蝠病毒陽性質粒其方法與實施例2基本相同，所不同的只是為人工合成的高加索蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:14)片段(寶生物合成)，結果也得到548bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。
權利要求
1.一種檢測狂犬病毒屬病毒的CODEHOP RT-PCR試劑，包括引物溶液，其特征在于所述引物溶液中含有核苷酸序列為TTTGTTTTCT GACAAGAATG ACAAATatha ayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列為TTTTGCTGCA TGTCTAACTT Cttgrtcnac cca的下游引物KQZ2，上述序列中其中h含義為a或c或tAi，y含義為c或tAi，r含義為g或a,η含義為g或a或c或t/u或其它。
2.利用權利要求I所述的ー種檢測狂犬病毒屬病毒的C0DEH0PRT-PCR試劑檢測狂犬病毒屬病毒的方法，其特征在于步驟如下 a、RNA提取用RNA提取試劑盒提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說明書進行； b、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒對上述RNA進行RNA逆轉錄，得到PCR模板，具體 逆轉錄方法依說明書進行； c、PCR反應在O.2mL eppendorf管中加入10XPCR緩沖液2. 5 μ L、濃度為25mM的MgCl2溶液I. 5 μ L、濃度為IOmM的dNTP液O. 5 μ L、濃度為5U/ μ L的Taq酶液O. 5 μ L、含濃度都為25 μ M的上游引物KQZl和下游引物KQZ2的引物溶液I μ L、上述PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L，反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸Imin，35個循環，72 °C延伸7min，4°C保存PCR產物； d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產物用重量百分濃度為1-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶，電泳條件電壓IOOv, 30min,將電泳結果用凝膠成像系統分析,若結果出現548bp大小片段的條帶，則為狂犬病毒屬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO3所示則為阿拉萬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示則為澳大利亞蝙蝠狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :5所示則為杜文海格病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :6所示則為歐洲蝙蝠狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :7所示則為伊爾庫特病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :8所示則為苦盞病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :9所示則為拉各斯蝙蝠病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO10所示則為奧澤爾狂犬病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :11所示則為莫科拉病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : 12所示則為經典狂犬病病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :13所示則為希莫尼蝙蝠病毒，若548bp條帶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :14所示則為西高加索蝙蝠病毒。
全文摘要
本發明公開了一種檢測狂犬病毒屬病毒的CODEHOPRT-PCR試劑及方法，引物溶液中含有核苷酸序列為TTTGTTTTCTGACAAGAATGACAAATathaayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列為TTTTGCTGCATGTCTAACTTCttgrtcnaccca的下游引物KQZ2，其中5＇端非兼并共有序列夾和很短的3＇端根據保守氨基酸設計的核心簡并區組成，5＇端非兼并共有序列在不增加引物簡并度的情況下其穩定3＇兼并核心區與模板結合作用，允許在較高退火溫度下進行，提高了兼并PCR反應的特異性，通過RNA提取、RNA逆轉錄、PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物序列長度為548bp；對特異性擴增序列進行測序，可以確認已知病毒，同時能對狂犬病毒屬內基因同源的未知病毒進行檢測，所獲得的生物信息學數據可以用于狂犬病毒的分子流行病學調查研究。
文檔編號C12R1/93GK102643929SQ201210097098
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者倪紅霞, 胡群, 謝東華, 郭利平, 馬思杰 申請人:中華人民共和國大榭出入境檢驗檢疫局