專利名稱：腎上腺素alpha1受體亞型的熒光探針組合及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于核酸檢測技術領域，涉及一種核酸探針組合及其應用。
背景技術：
神經膠質細胞約占中樞神經系統細胞總數的90%，其在神經系統中的重要性日益受到重視，逐漸成為神經科學研究的熱點之一。早先有神經生物學研究者在中樞神經系統中發現了一種具有典型雙極突起、胞體小而不規則的細胞，其形態很難歸入已知的神經膠質細胞范疇，而類似不成熟的膠質細胞。根據其能夠增殖并可分化為少突膠質細胞的特性，研究者將這種細胞命名為少突膠質前體細胞(oligodendrocyte precursor cell,0PC)。硫酸軟骨素蛋白多糖(NG2)是OPC的特異性免疫標記物和鑒定標準。早先的研究認為OPC是哺乳動物胚胎發育早期的少突膠質前體細胞，其在出生后分化成熟，成為成髓鞘的少突膠質細胞。但最近研究顯示，成熟的腦內也表達大量的NG2免疫陽性反應細胞,這些細胞在形態上與星狀膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞等均有所區別，胞體稍大，突起短而且豐富，有較多分枝，從形態學特征來看傾向認為是腦內一類成熟的膠質細胞，而這些細胞在灰質、白質及海馬區域的廣泛分布也預示其可能不嚴格屬于少突膠質細胞系的前體細胞，而是在中樞神經系統中與少突膠質細胞、星狀膠質細胞不同的一種新的膠質細胞類型。由于近年研究顯示OPC與神經退行性疾病、毒性物質作用、營養代謝障礙和缺氧缺血所致的白質損害等均密切相關，從而成為新近神經科學研究的熱點。哺乳動物腦內白質與灰質OPC形態有不同。OPC是否與星狀膠質細胞類似，在不同腦區也具有異質性，對于闡明其在體功能具有重要意義。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于針對OPC的異質性研究，設計和構建一種熒光探針。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案
I、腎上腺素alphal受體(alphal_AR)亞型的突光探針組合，由腎上腺素alphalA受 體(alphalA-AR)熒光探針和腎上腺素alphalB受體(alphalB_AR)熒光探針組成，所述alphalA-AR熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，alphalB_AR熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述alphalA-AR熒光探針和alphalB_AR熒光探針分別用熒光光譜互不重疊的熒光分子進行標記。優選的，所述alphalA-AR熒光探針和alphalB_AR熒光探針中的任意一種用熒光分子Cy5進行標記,另一種用突光分子Alexa Fluor488進行標記。2、alphal-AR亞型的熒光探針組合作為區分不同腦區OPC的試劑的應用。本發明的有益效果在于本發明設計并構建了一種alphal-AR亞型的熒光探針組合，包括alphalA-AR熒光探針和alphalB-AR熒光探針，應用該熒光探針組合和熒光原位雜交技術，在熒光標記OPC轉基因小鼠腦內，發現不同腦區OPC表達alphal-AR類型不一致，alphalA-AR和alphalB-AR可以作為區分不同腦區OPC的標志物，該熒光探針組合可以作為區分不同腦區OPC的試劑，用于OPC的異質性研究。由于現有技術中針對alphalA-AR和alphalB-AR的抗體尚不具有特異性區分alphalA-AR和alphalB-AR的能力，而熒光標記技術具有檢測簡單、靈敏度高(相對于常規標記技術)、特異性強(相對于受體檢測技術)等優點，本發明的熒光探針組合具有良好的應用前景。
圖I顯示了 AlphalAAR-I寡核苷酸的質譜檢測結果，單吸收峰在16382Da。圖2顯示了 AlphalBAR-I寡核苷酸的質譜檢測結果，單吸收峰在14491Da。圖3顯示了海馬CAl區OPC表達alphalA-AR (箭頭所示)但不表達alphalB-AR。圖4顯示了海馬CA2區OPC表達alphalA-AR (箭頭所示)但不表達alphalB-AR。
圖5顯示了大腦皮層灰質OPC既不表達alphalA-AR也不表達alphalB-AR。圖6顯示了大腦皮層白質OPC既表達alphalA-AR(箭頭所示)也表達alphalB-AR。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、alphalA-AR熒光探針和alphalB-AR熒光探針的制備
根據GenBank中登錄的alphalA-AR的mRNA全長序列(登錄號NM_013461. 3)和alphaIB-AR的mRNA全長序列(登錄號NM_007416. 3)設計alphalA-AR和alphalB-AR的特異性寡核苷酸探針序列如下
alphalA-AR 的寡核昔酸探針 AlphalAAR-I :5’-gcatcacgaggaagaacggcagccagcagaggaeg- aagcatcccaccacaa-3’ (SEQ ID No. I)；
alphalB-AR 的寡核昔酸探針 AlphalBAR-I :5，-aaggcgcacagctccacgggtggctgcgttccacga- cccaggtat-3’ (SEQ ID No. 2)。AlphalAAR-I探針序列與alphalA-AR mRNA全長序列的BLAST比對結果見表I。AlphalBAR-I探針序列與alpha IB-AR mRNA全長序列的BLAST比對結果見表2。表I AlphalAAR-I 與 alphalA-AR mRNA 全長序列的 BLAST 結果—....IH— 願 SI FelwlrTliwin序遲屢
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表 2 AlphalBAR-I 與 alphalB-AR mRNA 全長序列的 BLAST 結果
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探針的熒光標記釆用末端標記法，在每條寡核苷酸探針的5’端和3’端都標記上同一種焚光分子。本實施例中用Cy5標記AlphalAAR-I探針，用Alexa Fluor488標記AlphalBAR-I探針。Cy5的激發波長為649nm，發射波長為670nm ；Alexa Fluor488的激發波長為490nm，發射波長為520nm ;二者熒光光譜互不重疊，從而避免了后續熒光檢測中的互相干擾。當然，本發明也可以用Alexa Fluor488標記AlphalAAR-I探針，用Cy5標記AlphalBAR-I探針；也可以采用熒光光譜互不重疊的其它熒光分子分別標記AlphalAAR-I探針和AlphalBAR-I探針。AlphalAAR-I探針的合成序列經DNA質譜分析(圖I )，單吸收峰出現在16382Da，與預測分子量16382Da —致。AlphalBAR-I探針 的合成序列經DNA質譜分析(圖2)，單吸收峰出現在14491Da，與預測分子量14491Da —致。二、熒光轉基因小鼠腦組織切片的制備
以紅色熒光DsRed標記OPC轉基因小鼠(購自美國Jaxson實驗室，品種名稱為STOCKTg(Cspg4-DsRed. Tl) lAkik/J，編號為008241)為實驗小鼠，該小鼠在硫酸軟骨素蛋白聚糖
4(Cspg4)啟動子調控下啟動DsRed. Tl基因的表達，Cspg4翻譯后特異性表達NG2，從而使所有OPC細胞表達紅色熒光蛋白DsRed. Tl，DsRed. Tl的激發波長為554nm，發射波長為586nm,與Cy5和Alexa Fluor488的熒光光譜互不重疊。將小鼠自左心室主動脈沿體循環灌注，先用20mL無菌生理鹽水，再用20-30mL 4%多聚甲醛溶液；然后剝離全腦，置4%多聚甲醛溶液中固定24小時，用30%無菌蔗糖溶液脫水至完全沉底，冰凍切片(40 μ m)，漂于無RNA 水解酶的 O. OlM PBS (ρΗ7· 4)中。三、原位雜交實驗研究OPC的異質性
將Cy5標記的AlphalAAR-I探針、Alexa Fluor488標記的AlphalBAR-I探針與紅色熒光DsRed標記OPC轉基因小鼠腦組織切片中的核酸進行雜交，原位檢測腦組織切片中alphalA-AR和alphalB-AR的mRNA。由于本發明構建的熒光探針為熒光速標記，故采用直接法原位雜交，探針與組織細胞內靶核酸所形成的雜交體不經免疫組織化學實驗，直接用熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。具體實驗方法為腦組織切片先用O. OlM PBS(ρΗ7· 4)洗3次，每次5分鐘，再用O. 3% Triton X-100于37°C浸泡4小時，再用2 X SSC洗10分鐘，加入濃度為Sng/yL的探針工作液，42°C雜交16小時，再依次應用2XSSC、1XSSC、O. 5XSSC、0. 2 X SSC各洗3次，每次10分鐘，最后置O. OlM PBS (ρΗ7· 4)中漂洗并貼片，用I μ g/mL DAPI溶液復染細胞核，甘油封片觀察，以未雜交的腦組織切片(CSpg4(NG2)DSRed)為對照。結果如圖3飛所示，可見小鼠不同腦區OPC表達alphal-AR的類型不一致，海馬區域的OPC僅僅表達alphalA-AR而不表達alphalB-AR，大腦皮層灰質區域OPC既不表達alphalA-AR也不表達alphalB-AR,而大腦皮層白質區域OPC既表達alphalA-AR也表達alphalB-AR，說明alphalA-AR和alphalB-AR可以作為區分不同腦區OPC的標志物，Cy5標記的AlphalAAR-I探針和Alexa Fluor488標記的AlphalBAR-I探針組合,可以作為區分不同腦區OPC的試劑，用于OPC的異質性研究。alphal-AR是一種G蛋白偶聯受體，激活后通過Gq蛋白發揮生物學作用。其中，Gq蛋白的α亞單位通過水解磷脂酰肌醇，產生如三磷酸肌醇(ΙΡ3)和二酰基甘油(DAG)等第二信使，激活蛋白酶C (PKC)調控細胞功能，產生效應；Gq蛋白的β Y亞單位可以直接調控細胞膜的Kca通道，影響細胞內K+平衡，介導細胞增殖或凋亡。文獻報道，表達于海馬的alphalA-AR在調節新生小鼠神經干細胞的分化和調控成年小鼠膠質細胞增殖中均有重要作用，也參與了注意和記憶過程，在后腦的發育中與突觸可塑性和抑郁、情緒障礙等的發生均有一定關系。此外，在圍生期缺氧缺血性腦損傷(HIBD)實驗模型中發現，損傷腦組織內以去甲腎上腺素為典型的兒茶酚胺神經遞質釋放有顯著增加，從而激活突觸后膜的alphal-AR。在起始期、臨床癥狀出現之前，可能產生不可逆的損傷特征，尤其是對突觸后神經膠質細胞的病理性損傷。OPC在HIBD引起的腦癱中是最敏感的易損性細胞，是腦室周圍白質軟化等病理過程的關鍵靶細胞。這與其特異表達的alphal-AR功能可能具有一定關系。其作用可能在于HIBD病理過程早期由于應激釋放的去甲腎上腺素，激活突觸后OPC的alphal-AR，通過調控OPC的KCa通透性，影響細胞內K+水平，改變細胞膜電位和細胞興奮性，從而加速了 OPC在缺氧缺血性腦損傷早期的易損性。而OPC在不同腦區所表達的alphal-AR亞型不一致，形成了 OPC在不同腦區的異質性，也給出了圍生期腦癱中以白質病 變和少突膠質細胞系損傷為主的病理依據。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
權利要求
1.腎上腺素alphal受體亞型的熒光探針組合，其特征在于，由腎上腺素alphalA受體熒光探針和腎上腺素alphalB受體熒光探針組成,所述腎上腺素alphalA受體熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，腎上腺素alphalB受體熒光探針的核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示；所述腎上腺素alphalA受體熒光探針和腎上腺素alphalB受體熒光探針分別用熒光光譜互不重疊的熒光分子進行標記。
2.根據權利要求I所述的腎上腺素alphal受體亞型的熒光探針組合，其特征在于，所述腎上腺素alphalA受體熒光探針和腎上腺素alphalB受體熒光探針中的任意一種用熒光分子Cy5進行標記,另一種用突光分子Alexa Fluor488進行標記。
3.權利要求I所述的腎上腺素alphal受體亞型的熒光探針組合作為區分不同腦區的少突膠質前體細胞的試劑的應用。
全文摘要
本發明公開了一種腎上腺素alpha1受體亞型的熒光探針組合，由腎上腺素alpha1A受體(alpha1A-AR)熒光探針和腎上腺素alpha1B受體(alpha1B-AR)熒光探針組成，alpha1A-AR熒光探針和alpha1B-AR熒光探針的核苷酸序列分別如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；應用上述熒光探針組合和熒光原位雜交技術，在熒光標記少突膠質前體細胞(OPC)轉基因小鼠腦內，發現不同腦區OPC表達alpha1-AR類型不一致，說明alpha1A-AR和alpha1B-AR可以作為OPC異質性的標記，本發明的熒光探針組合可以作為區分不同腦區OPC的試劑，用于OPC的異質性研究。
文檔編號C12Q1/04GK102719428SQ20121009820
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月6日 優先權日2012年4月6日
發明者阮懷珍, 陳鵬慧 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學