專利名稱：瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測用引物及方法
技術領域：
本發明“瓜類果斑病菌交叉弓I物恒溫擴增檢測用弓I物及方法”，專用于檢測瓜類果斑病菌,屬于植物檢疫技術領域,涉及生物檢測技術。
背景技術：
瓜類果斑病自1989年在美國的西瓜種植區被發現后，已經在世界范圍內廣泛發生，給農業生產造成了嚴重經濟損失。瓜類果斑病病原為Acidovorax citrulli,是我國進境植物檢疫性有害生物，可通過種子進行遠距離傳播。其主要寄主包括西瓜、甜瓜、哈密瓜、西葫蘆等葫蘆科作物，染菌種子是疫情爆發的主要原因?？刂撇『Πl生的最佳途徑是種植健康的種子。該病菌的檢測方法主要有種植觀察、分離培養、酶聯免疫吸附法、實時熒光PCR等。但以上檢測手段存在著操作過程耗時長、儀器配置昂貴等不利于在基層單位推廣的制 約因素。根據瓜類果斑病菌16S rDNA序列設計了 5條引物，建立了瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測技術，反應結束后利用封閉式的膠體金標記DNA檢測裝置進行結果判定。

發明內容
技術問題本發明的目的在于提供用于瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測用引物序列及方法，以達到快速、準確檢測瓜類果斑病菌的目的。本發明是這樣實現的本發明通過分析已報道的瓜類果斑病菌16S rDNA序列(GenBankAY702093. I)分別設計了 5條引物。經過一步恒溫擴增后,擴增產物通過商品化一次性全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置進行結果判讀，即可判斷檢測樣品中是否含有瓜類果斑病菌。技術方案本發明涉的瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴增檢測方法包括如下步驟I)用于檢測瓜類果斑病菌的樣品制備利用商業化植物DNA提取試劑盒提取樣品總DNA或通過分離得到細菌菌液為模板。2)用于檢測瓜類果斑病菌的一套交叉擴增引物本發明通過分析已報道瓜類果斑病菌16S rDNA序列，分別設計了 5條引物，其核苷酸序列如下ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5， -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP :5’ -CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 5，-CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3，
其中引物ACDF5bI的5端生物素標記，引物ACDF5f2的5端FITC標記。3)恒溫擴增的反應體系20 u I的反應體系中包含0. 8iimol/L交叉引物ACLBIP ；0. lymol/L正向檢測弓I物ACDF5bl (5端生物素標記),0. 3 u mol/L反向檢測弓I物ACDF5f2 (5端FITC標記)，各
0.liimol/L 的兩條置換引物 ACLF3 和 ACLB3，0.4mmol/L dNTP,2u I IOX 反應緩沖液；8 個單位的Bst DNA聚合酶，2mmol/L MgSO4,以及4 yl的目標DNA。4)恒溫擴增程序擴增反應為63 °C，60min。5)擴增產物結果判讀擴增產物通過商品化一次性全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置進行結果判讀。通過觀察試紙條的檢測條帶和質控條帶的顯色與否進行結果判讀。


圖I運用交叉引物恒溫擴增檢測瓜類果斑病菌靈敏度的測試實驗結果。(I :3. 7X105cfu/ml,2 :3. 7X 104cfu/ml, 3 :3. 7X 103cfu/ml,4 :空白對照)。圖2運用交叉引物恒溫擴增技術對西瓜種子中瓜類果斑病菌檢測的代表性實驗結果(1-6為帶菌西瓜種子檢測結果，7為空白對照)。
具體實施例方式下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例I引物的設計和合成根據瓜類果斑病病菌16S rDNA序列設計了 5條引物，引物序列為ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5’ -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP :5，-CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3，ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 :5， -CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3，其中ACLF3和ACLB3為置換引物，ACLBIP為交叉引物，ACDF5bl為正向檢測引物，5端生物素標記，A⑶F5f2為反向檢測引物，5端FITC標記。實施例2交叉引物擴增方法的建立以商業化植物DNA提取試劑盒提取的樣品總DNA或分離得到細菌菌液為模板，20iil的反應體系中包含0. 8 ii mol/L交叉引物ACLBIP ；0. I U mol/L正向檢測引物ACDF5bl，0. 3iimol/L反向檢測引物ACDF5f2，各0. I u mol/L的兩條置換引物ACLF3和ACLB3,0. 4mmol/L dNTP,2u I 10 X 反應緩沖液；8 個單位的 Bst DNA 聚合酶，2mmol/LMgSO4,以及4iil的目標DNA。擴增反應為63V，60min,隨后對擴增產物進行檢測。擴增產物通過商品化一次性全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置進行結果判讀。通過觀察試紙條的檢測條帶和質控條帶的顯色與否進行結果判讀。如果檢測條帶和質控條帶均顯色，結果為陽性；只有質控條帶沒有檢測條帶，結果為陰性。當質控條帶沒有顯色時，判斷檢測過程有誤。
實施例3交叉引物擴增方法靈敏度確定經平板培養計數定量的瓜類果斑病菌菌懸液進行十倍梯度稀釋，取2 Ul各梯度的細菌純培養物作為反應模板，對該方法的檢測靈敏度進行測試，經測試，所測試的3. 7X 102cfu/ml濃度以上菌液可以觀察到檢測條帶及質控條帶,而3. 7X 102cfu/ml濃度以下只有質控條，故判定該方法的靈敏度為3. 7 X 102CfU/ml，因每個反應中加入2 yl，經換算最低靈敏度為7. 4個細菌。 實施例4特異性檢測對18株瓜類果斑病菌進行檢測，所有菌株均為陽性結果，以下列10株其他種屬的植物病原菌為對照菌，測試該方法的特異性。包括魔芋細菌性葉斑病菌(Acidovoraxkonjaci)、番石槽歐文氏菌(Erwinia psidii)、亞洲梨火疫病菌(Erwinia pyrifoliae)、楊樹枯萎病菌(Bnterobacter cancerogenus)、洋蔥腐爛病菌(Burkholderia gladiolipv. alliicola)、核果樹細菌性潰瘍病菌(Pseudomonas syringae pv. morsprunorum)、辣 椒斑點病菌(Xanthomonas vesicatoria)、放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、玉米細菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp. stewartii)、番爺潰瘍病菌(Clavibactermichiganense subsp. michiganense),所有上述對照細菌檢測結果均為陰性。說明該方法對瓜類果斑病菌具有較好的特異性。實施例5西瓜種子帶菌檢測利用該方法對西瓜種子進行檢測,取西瓜種子經無菌水浸泡30mim, 12000g離心，取沉淀。以商業化植物DNA提取試劑盒提取的樣品總DNA為模板進行恒溫擴增檢測。對12份陽性及5份健康種子檢測，結果表明陽性樣品均為陽性，健康樣品均為陰性。
權利要求
1.一組用于交叉引物恒溫擴增檢測瓜類果斑病菌的引物，其核苷酸序列為ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5’ -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ ACLBIP :5’ -CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 :5’ -CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3’ 其中引物A⑶F5bl5端生物素標記，引物A⑶F5f25端FITC標記。
2.一種用于檢測瓜類果斑病菌的交叉引物恒溫擴增方法，該方法以樣品總DNA或菌液為模板，利用權利要求I所述的引物進行恒溫擴增。
3.根據權利要求2所述的方法，其中的恒溫擴增條件為63°C恒溫擴增60min。
全文摘要
本發明提供了一種運用交叉引物恒溫擴增檢測瓜類果斑病菌的引物及其檢測方法，其核苷酸序列為ACLF35’-GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB35’-ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP5’-CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5b15’-GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f25’-CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3’其中引物ACDF5b15端生物素標記，引物ACDF5f2的5端FITC標記。本發明還進一步提供了檢測瓜類果斑病菌的交叉引物恒溫擴增技術，以樣品總DNA或菌液為模板，利用上述引物進行恒溫擴增，反應結束后利用封閉式的膠體金標記DNA檢測裝置即可直接進行結果判定。本發明特異性好，準確性高，靈敏度高，操作簡便快速，為進出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/04GK102758005SQ201210109529
公開日2012年10月31日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者商明清, 尤其敏, 張靚, 朱水芳, 田茜, 趙文軍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院, 杭州優思達生物技術有限公司