專利名稱：一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法
技術領域：
本發明涉及消化酶活力的測定，具體涉及一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法。
背景技術：
橈足類動物是一類小型低等甲殼動物，是海洋浮游動物的重要組成部分。它既是浮游植物的攝食者，又是魚類的餌料基礎，在海洋食物鏈、次級生產力和能量流動中占有關鍵性位置。橈足類動物的研究中經常涉及到橈足類動物攝食消化能力、對周圍環境食物濃度適應能力和營養狀況等的分析，消化酶活力是反映橈足類動物對餌料等營養物質利用能 力的重要指標，由于橈足類動物體形微小，對環境因子影響較為敏感，所以消化酶活力也可以作為指示環境質量的指標之一；這就需要通過測定橈足類動物的消化酶活力來加以判斷。傳統分析消化酶活力的方法，由于需要樣品量較大，操作復雜，測試周期較長，所以誤差較大，這對于個體小，室內難以大量長期培養的橈足類動物來說，造成測試困難，所以建立獨立的橈足類動物的消化酶活力的測定方法尤其重要。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法，該方法操作簡便，樣品量少，測試時間短，測試效率高。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法，其步驟如下
a、將5-15只橈足類動物置于研缽中，加入濃度為ImM的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液(Tris_HCl)500 μ 1，冰浴研磨成勻衆液，在15000 rpm、0_4°C下,冷凍離心機離心IOmin,取上清液待用；
b、將Img纖維二糖加入到I毫升濃度為IOOmM的醋酸溶液中，加熱溶解得到纖維二糖醋酸液，取上述上清液80 μ I與420 μ I纖維二糖醋酸液混勻，在20°C水浴溫育2h，然后在95°C水浴2min，終止反應得到水浴產物；
C、取上述水浴產物40 μ 1，與Iml濃度為50mM的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液，O. 5ml濃度為ImM的MgCl2液，O. 5ml濃度為O. 5mM的二硫蘇糖醇液，Iml濃度為I μ g /ml的己糖激酶液，Iml濃度為30 μ M的氧化型輔酶II液(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，NADP+)，Iml濃度為300 μ M的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)液，Iml濃度為O. 02U/ml的6-磷酸葡萄糖脫氫酶液混合，攪拌均勻，酶促反應lOmin，得到含還原型輔酶II (NADPH)的酶促產物；
d、用移液器吸取上述酶促產物置于熒光分光光度計中，在激發波長為340nm，發射波長為450nm下測量還原型輔酶II的吸光值，根據公式O. 2737 X吸光值-O. 4518計算得到還原型輔酶II的總濃度(Ug πιΓ1)；
e、根據下述公式計算樣品中每只浮游動物的纖維二糖酶活力，纖維二糖酶活力(ygglucose · incf1 · IT1) = AX6 + 833. 35X 180X 500 + 80X 500 + 40 + 2 + B，公式中 A 為還原型輔酶II的總濃度，B為橈足類動物的只數。式中833. 35為NADPH的分子量，180為葡萄糖的分子量，6為酶促反應試劑的體積，500 + 80為500 μ I勻漿液取80 μ I上清液，500 + 40為500 μ I水浴反應中取40 μ I水浴產物，2為20°C溫育時間。與現有技術相比，本發明的優點在于一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法，對5-15只橈足類動物在緩沖液下研磨、離心，再與底物纖維二糖水浴反應得到水浴產物，然后水浴產物與Tris-HCl、MgCl2、二硫蘇糖醇、己糖激酶、NADP+、ATP、6-磷酸葡萄糖脫氫酶混合進行酶促反應，再以酶促產物中還原型輔酶II的吸光值和浮游動物只數為參數，根據公式計算得到每只橈足類動物中纖維二糖酶的活力；本發明的方法只要幾只到十幾只橈足類動物就可完成消化酶活力的測定，解決了由于橈足類個體小，室內難以大量長期培養，很難獲得用于酶活力測定樣品量的這一問題，只是對橈足類動物中纖維二糖酶進行水浴和酶促二步反應就可以得出還原型輔酶II的吸光值，操作簡便，反應時間短，誤差也較少，因此本發明具有操作簡便，樣品量少，測試時間短，測試效率高的優點。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例I
挑出培養的中華哲水蚤5只個體于研缽中，加入500 μ I ImM Tris-HCl緩沖液，冰浴研磨成勻衆液，在15000 rpm、0-4°C下,冷凍離心機離心IOmin,取上清液待用。將Img纖維二糖加入I毫升濃度為IOOmM的醋酸溶液中，加熱溶解得到纖維二糖醋酸液，取上述上清液80 μ I與420 μ I纖維二糖醋酸液混勻，在20°C水浴溫育2h，然后在95°C水浴2min，得到水浴產物。在40 μ I水浴產物中，加入50mM的Tris-HCl緩沖液lml，ImM的MgCl2液O. 5ml，O. 5mM 的二硫蘇糖醇液(C4H10O2S2) O. 5ml, Iyg ml-1 的己糖激酶液 lml, 30 μ M 的 NADP+ 液lml, 300 μ M的ATP液lml, O. 02 U ι Γ1的6-磷酸葡萄糖脫氫酶液lml,酶促反應lOmin,得到酶促產物。用移液器吸取酶促產物，置于HITACHI 4500熒光分光光度計中，在激發波長340nm，發射波長450nm下測量還原型輔酶II的吸光值，得到吸光值為3. 633，代入公式NADPH濃度=O. 2737 X吸光值-O. 4518，計算得到NADPH總濃度A為O. 5425521 ( μ gι Γ1) ο 再根據公式纖維二糖酶活力=ΑΧ6 + 833. 35Χ180Χ500 + 80Χ500 + 40 + 2 + Β，計算得到每只中華哲水蚤中纖維二糖酶活力為5. 493 (μ g glucose · incf1 · IT1)。實施例2
與實施例I基本相同，所不同的只是中華哲水蚤由墨氏胸刺水蚤替代，其只數B為10只，該墨氏胸刺水蚤的酶促產物還原型輔酶II的吸光值為2. 862，總濃度A為O. 3315294(U g πιΓ1),每只墨氏胸刺水蚤中纖維二糖酶活力為1.678(yg glucose · incf1 · IT1)。
實施例3
與實施例I基本相同，所不同的只是中華哲水蚤由太平洋紡錘水蚤替代，其只數B為15只，該太平洋紡錘水蚤的酶促產物還原型輔酶II的吸光值為2. 294，總濃度A為O. 1760678(yg πιΓ1)，每只太平洋紡錘水蚤中纖維二糖酶活力為O. 594 ( μ gglucose · ind · h )。
權利要求
1.一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法，其特征在于步驟如下a、將5-15只橈足類動物置于研缽中，加入濃度為ImM的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液500 μ 1，冰浴研磨成勻漿液，在15000 rpm、0-4°C下，冷凍離心機離心lOmin，取上清液待用；b、將Img纖維二糖加入到I毫升濃度為IOOmM的醋酸溶液中，加熱溶解得到纖維二糖醋酸液，取上述上清液80 μ I與420 μ I所述纖維二糖醋酸液混勻，在20°C水浴溫育2h，然后在95°C水浴2min，終止反應得到水浴產物；C、取上述水浴產物40 μ 1，與Iml濃度為50mM的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液，O.5ml濃度為ImM的MgCl2液，O. 5ml濃度為O. 5mM的二硫蘇糖醇液，Iml濃度為Iyg /ml的己糖激酶液，Iml濃度為30 μ M的氧化型輔酶II液，Iml濃度為300 μ M的腺嘌呤核苷三磷酸液，Iml濃度為O. 02U/ml的6-磷酸葡萄糖脫氫酶液混合，攪拌均勻，酶促反應lOmin，得到含還原型輔酶II的酶促產物；d、用移液器吸取上述酶促產物置于熒光分光光度計中，在激發波長為340nm，發射波長為450nm下測量還原型輔酶II的吸光值，根據公式O. 2737 X吸光值-O. 4518計算得到還原型輔酶II的總濃度；e、根據下述公式計算樣品中每只浮游動物的纖維二糖酶活力，纖維二糖酶活力=AX6+ 833. 35X180X500 + 80X500 + 40 + 2 + B，公式中A為還原型輔酶II的總濃度，B為橈足類動物的只數。
全文摘要
本發明公開了一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法，對5-15只橈足類動物在緩沖液下研磨、離心，再與底物纖維二糖水浴反應得到水浴產物，然后水浴產物與Tris-HCl、MgCl2、二硫蘇糖醇、己糖激酶、NADP+、ATP、6-磷酸葡萄糖脫氫酶混合進行酶促反應，再以酶促產物中還原型輔酶Ⅱ的吸光值和浮游動物只數為參數，根據公式計算得到每只橈足類動物中纖維二糖酶的活力；本發明的方法只要幾只到十幾只橈足類動物就可完成消化酶活力的測定，只是對橈足類動物中纖維二糖酶進行水浴和酶促二步反應就可以得出還原型輔酶Ⅱ的吸光值，操作簡便，反應時間短，誤差也較少，因此本發明具有操作簡便，樣品量少，測試時間短，測試效率高的優點。
文檔編號C12Q1/32GK102634566SQ20121011691
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月20日 優先權日2012年4月20日
發明者俞泓伶, 屠燕萍, 謝志浩 申請人:寧波大學