專利名稱：一種人工合成的信號(hào)肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
外源基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析、蛋白質(zhì)或多肽類藥物研究開發(fā)的先決條件。用于表達(dá)重組蛋白的表達(dá)體系有微生物、植物、酵母、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)具有天然活性蛋白的最佳宿主，其優(yōu)勢(shì)在于能正確有效地識(shí)別真核蛋白的合成、加工和分泌信號(hào)，識(shí)別和去除基因中的內(nèi)含子，再經(jīng)剪切加工成為成熟的mRNA，能準(zhǔn)確地完成糖基化、磷酸化，形成鏈內(nèi)和鏈間ニ硫鍵及蛋白水解等翻譯后加工過程，因而產(chǎn)生的完整抗體和天然抗體一祥，具有生物學(xué)活性，既可識(shí)別抗原又可激活補(bǔ)體系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞易被重組的DNA轉(zhuǎn)染，經(jīng)過篩選可得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性，表達(dá)的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中易于純化。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白產(chǎn)物已廣泛應(yīng)用于生物制品エ業(yè)，如病毒疫苗、抗體、干擾素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、和生長(zhǎng)因子等的大量制備。但動(dòng)物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率低，且成本高，因此提高動(dòng)物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率，降低生產(chǎn)成本是當(dāng)前工作中的重中之重。影響外源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的因素很多，如信號(hào)肽、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制因子、RNA加工(RNA Processing)、基因拷貝的數(shù)目、mRNA的穩(wěn)定性、外源基因在染色體上的整合位點(diǎn)、重組蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性和宿主細(xì)胞的基因組偏好性(genetic properties)等。在表達(dá)載體已經(jīng)確定的情況下，信號(hào)肽的選擇就顯得至關(guān)重要了。分泌蛋白的N-端通常由可被剪切的15_30Aa的前導(dǎo)順序組成，此順序稱為信號(hào)肽(signal sequence),在N-端或靠近N端處有2_3個(gè)極性Aa,而在信號(hào)肽的中部都是ー個(gè)唯一的疏水核心或者由很多的疏水Aa構(gòu)成。信號(hào)肽中沒有其它保守順序也沒有酸性基團(tuán)。和導(dǎo)肽相似，信號(hào)肽也是可足以將任何附加的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)靶膜。例如將信號(hào)肽加在珠蛋白的N-端，就可使它不再留在胞液中，而是穿過膜而分泌到胞外。信號(hào)肽可使正在翻譯的核糖體附著到RER膜上。核糖體是通過信號(hào)肽的功能而附著并合成分泌蛋白的。因此游離的核糖體和膜結(jié)合核糖體之間本身并無(wú)差異。信號(hào)肽是作為ー種附著到ER膜上的信號(hào)識(shí)別，此可能通過開始合成出的N-端頭幾個(gè)氨基酸的疏水功能。然后蛋白鏈插進(jìn)膜中，信號(hào)肽埋在膜中的ー種蛋白酶所剪切這時(shí)核糖體已完成翻譯，蛋白已延著導(dǎo)肽途經(jīng)穿過膜。信號(hào)肽分泌外源蛋白的作用如下I)信號(hào)肽能夠引導(dǎo)分泌蛋白或膜蛋白出胞。
2)信號(hào)肽的疏水核心決定蛋白質(zhì)的分泌效率。3)信號(hào)肽能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域或不同細(xì)胞器進(jìn)行正確的定位。4)信號(hào)肽能夠分泌增強(qiáng)子增強(qiáng)外源蛋白的分泌。5)短的信號(hào)欣有利于減少表達(dá)載體的分子置，提高整合到宿主染色體上外源基因表達(dá)盒的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。對(duì)于分泌蛋白，選擇合適的信號(hào)肽可以將其表達(dá)量成倍提高，無(wú)論對(duì)于エ業(yè)生產(chǎn)還是科學(xué)研究，其意義都是非常深遠(yuǎn)的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供ー種可以弓丨導(dǎo)外源哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白高效表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用，以降低哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的生產(chǎn)成本。首先，本發(fā)明提供了ー種人工合成的用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽的氨基酸序列為SEQ ID NO :1-5中的任一。其中，SEQID NO :1-5的信號(hào)肽具有較高的同源性。SEQ ID NO IMDVLAFLLGLLLLffLPGVRCSEQ ID NO 2MDVPAEFLGLLLLWLSGVRCSEQ ID NO 3MRVLPEFLGLLLLWISGVRCSEQ ID NO 4MDVPLQLLGLLLLWLSGVRCSEQ ID NO 5MDVPAELLGLLLLWISGVRC所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是CHO、BHK、SP2/0、C127等。本發(fā)明的信號(hào)肽可用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的分泌表達(dá)。本發(fā)明還提供了ー種多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽。進(jìn)ー步的，所述多核甘酸的序列選自SEQ ID NO :6_10中的任一ATGGATGTTCTTGCTTTTCTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGC(SEQ ID NO 6)ATGGATGTTCCTGCCGAATTTCTTGGATTGTTGTTGTTGTGGCTCTCCGGAGTGCGTTGC(SEQ ID NO 7)ATGAGGGTTCTGCCTGAATTCCTGGGACTTTTGTTGTTGTGGATTTCCGGCGTGCGATGT(SEQ ID NO 8)ATGGATGTACCACTTCAGCTTCTTGGCTTGTTGTTGCTTTGGCTTTCTGGCGTGAGATGT(SEQ ID NO 9)ATGGATGTGCCTGCTGAACTTTTGGGCCTTCTTTTGTTGTGGATATCAGGAGTACGATGC(SEQ ID NO :10)本發(fā)明的多核苷酸可通過常規(guī)的合成方法制備。本發(fā)明的多核苷酸可添加于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的分泌表達(dá)。利用本發(fā)明的信號(hào)肽在動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的方法為將編碼本發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸與編碼表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源蛋白的多核苷酸連接后克隆入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，而后將該重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后表達(dá)目的蛋白。本發(fā)明還提供了ー種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有前述編碼本發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸及編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
所述表達(dá)載體中，編碼本發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸緊接在所述編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的多核苷酸前端。進(jìn)ー步的，所述表達(dá)載體中，所述編碼本發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸的前端添加有Kozak序列ο所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子可以是EF-Ia啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、SV40晩期啟動(dòng)子或SV40早期啟動(dòng)子等。如本發(fā)明實(shí)施例列舉的，所述表達(dá)載體為改造的pIRESneo3，所述改造的pIRESneo3中，人EF-I a啟動(dòng)子序列或人EFl-HTLV啟動(dòng)子序列替換了 pIRESneo3質(zhì)粒中的hCMV主要立即早期啟動(dòng)子序列。本發(fā)明還提供了ー種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為前述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染。所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可選自CHO、BHK、SP2/0、C127等。本發(fā)明還進(jìn)ー步提供了ー種哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，為在適合表達(dá)所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)前述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，而后從培養(yǎng)物中采用常規(guī)方法分離出所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)。所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)可以為任意分子量的蛋白質(zhì)，如各種藥物蛋白促紅細(xì)胞生成素，各種具有促紅細(xì)胞生成素活性的改構(gòu)促紅細(xì)胞生成素，以及抗體等。本發(fā)明將本發(fā)明信號(hào)肽與蛋白質(zhì)自身信號(hào)肽進(jìn)行比較，外源蛋白表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果表明，本發(fā)明的信號(hào)肽特別適用于CHO細(xì)胞，與現(xiàn)有信號(hào)肽相比，在動(dòng)物細(xì)胞中的外源蛋白表達(dá)量獲得大幅提升，表達(dá)水平提高了約2 36倍，其應(yīng)用有利于篩選到高表達(dá)單克隆細(xì)胞株，具有降低生產(chǎn)成本、便于后續(xù)純化等優(yōu)勢(shì)。


圖I顯示發(fā)明信號(hào)肽與EPO自身信號(hào)肽的比較(pEF載體)圖2顯示發(fā)明信號(hào)肽與EPO自身信號(hào)肽的比較(pEV載體)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不對(duì)其發(fā)明范圍進(jìn)行限制本發(fā)明實(shí)施例所列舉的表達(dá)載體，是由質(zhì)粒pIRESneo3改造獲得。其中，人EF_1 a啟動(dòng)子序列、人EFl-HTLV啟動(dòng)子序列分別替換了原質(zhì)粒中的hCMV主要立即早期啟動(dòng)子(Human cytomegalovirus major immediate early promoterノ ノ卞歹[U實(shí)施例I信號(hào)肽的合成因信號(hào)肽較短，將信號(hào)肽按引物合成。5，端添加NheI酶切位點(diǎn)及Kozak序列，3，端添加目的基因序列部分，以便于在目的基因上添加該信號(hào)肽。信號(hào)肽I TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTTCTTGCTTTTCTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGCGCCCCACCACG(SEQ ID NO :11)信號(hào)肽 2 TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTTCCTGCCGAATTTCTTGGATTGTTGTTGTTGTGGCTCTCCGGAGTGCGTTGCGCCCCACCACG(SEQ ID NO :12) 信號(hào)肽 3 TCGGAGCTAGCCACCATGAGGGTTCTGCCTGAATTCCTGGGACTTTTGTTGTTGTGGATTTCCGGCGTGCGATGTGCCCCACCACG(SEQ ID NO :13)
信號(hào)肽4 TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTACCACTTCAGCTTCTTGGCTTGTTGTTGCTTTGGCTTTCTGGCGTGAGATGTGCCCCACCACG(SEQ ID NO :14)信號(hào)肽5 TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTGCCTGCTGAACTTTTGGGCCTTCTTTTGTTGTGGATATCAGGAGTACGATGCGCCCCACCACG(SEQ ID NO :15)實(shí)施例2人EF-I α啟動(dòng)子的擴(kuò)增以質(zhì)粒pEF6/V5_HisA(購(gòu)自Invitrogen公司)為模版，人EF-1 α啟動(dòng)子序列為參考，設(shè)計(jì)引物F01/R01,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),擴(kuò)增出人EF-I α啟動(dòng)子序列，反應(yīng)條件如表I。FOl CATACTAGTGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAG(SEQ ID NO :16)ROl ACGGCTAGCTCCGAGCTCGGTACCAAGCTTACCTAGCCA(SEQ ID NO :17)表IPCR反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種人工合成的用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
2.如權(quán)利要求I所述信號(hào)肽用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的分泌表達(dá)。
3.—種多核苷酸,所述多核苷酸編碼權(quán)利要求I所述信號(hào)肽。
4.如權(quán)利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述多核甘酸的序列為SEQID N0:7。
5.—種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求3或4所述多核苷酸及編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于，權(quán)利要求3或4所述多核苷酸緊接在所述編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的多核苷酸前端。
7.如權(quán)利要求5所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,其特征在于,進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體中，權(quán)利要求3或4所述多核苷酸的前端添加有Kozak序列。
8.如權(quán)利要求5所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子選自EF-I a啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子或SV40早期啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求5所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)選自促紅細(xì)胞生成素，各種具有促紅細(xì)胞生成素活性的改構(gòu)促紅細(xì)胞生成素，以及抗體。
10.一種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為權(quán)利要求5-9任一所述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染。
11.如權(quán)利要求10所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞為CH0、BHK、SP2/0 或 C127。
12.—種哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，為在適合表達(dá)哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求10或11所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，而后從培養(yǎng)物中分離出所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)選自促紅細(xì)胞生成素，各種具有促紅細(xì)胞生成素活性的改構(gòu)促紅細(xì)胞生成素，以及抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工合成的信號(hào)肽及其應(yīng)用。本發(fā)明的信號(hào)肽的氨基酸序列為SEQIDNO:2。本發(fā)明的信號(hào)肽可添加于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白分泌表達(dá)，可將其在動(dòng)物細(xì)胞中的外源蛋白表達(dá)量提高。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102659928SQ20121011867
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者厲穎, 周永春, 張玉晶 申請(qǐng)人:上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司