專利名稱：一種新型阿魏酸酯酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種利用宏基因組文庫篩選的方法從海底泥樣品中獲得的一種新型阿魏酸酯酶，以及所述阿魏酸酯酶的應用。
背景技術：
木質纖維素(如秸桿、麩皮等)是地球上最豐富的可再生資源，其生成量每年高達5X IOltl噸，并且可以通過光合作用年復一年再生，從而越來越受到重視。組成木質纖維的成分主要有纖維素、半纖維素和木質素，木質纖維素的酶解主要通過纖維素酶、木聚糖酶和木質素酶的共同作用。然而植物細胞壁中富含的酚酸類物質(如阿魏酸、對香豆酸)以酯鍵的方式在木質素之間、半纖維素之間及半纖維素與木質素之間形成交聯，從而構成了一個堅硬的骨架結構，阻礙了木質纖維素的降解利用。可見，打斷酯鍵結構可以有效的降解致密的網狀交聯結構，在木質纖維素的降解和利用中起著重要的作用。
阿魏酸酯酶(E. C. 3. I. I. 73, Ferulic acid esterase)是一種可以水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯及多聚糖阿魏酸酯中的酯鍵，并將阿魏酸釋放出來的羧酸酯水解酶。該酶具有廣泛的應用前景，從而引起了越來越多的關注①水解產物阿魏酸是一種天然抗氧化劑，在食品、化妝品及藥品行業中具有潛在的應用價值；②阿魏酸酯酶的作用促進植物原料的脫木質化，減少了紙漿漂白過程中氯的使用，從而減少了環境污染，并且提高紙漿的亮度；③阿魏酸酯酶與其它酶的協同作用可以提高飼料的吸收利用率；④阿魏酸酯酶的作用能夠促進植物細胞壁中還原性單糖(如葡萄糖和木糖等)的釋放，從而為生產生物燃料提供原料；⑤阿魏酸酯酶可以催化糖類和酚酸合成酯類，通過添加酚類衍生物將糖類聚合物轉化為生物活性物質的潛力。因此，深入開展阿魏酸酯酶的研究具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。上述各種工業應用要求阿魏酸酯酶在不同的pH值和溫度下與不同的底物作用，如制漿需要阿魏酸酯酶在高鹽堿和高溫的環境下作用，然而目前所研究的阿魏酸酯酶的酶學性質在應用方面仍然存在缺陷，限制了阿魏酸酯酶的廣泛應用。因此，如何從環境中獲得具有優良特性的阿魏酸酯酶，并研究其結構與功能之間的關系，是當前在阿魏酸酯酶研究中面臨的一項重要任務。宏基因組學(Metagenomics)是近年來隨著微生物學和現代生命科學的迅猛發展興起的一門新興學科。該方法是一種以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的的新型微生物學研究方法。宏基因組學技術在挖掘和利用未培養微生物自愿和篩選新穎生物活性物質方面表現出巨大的潛力，已成為當前國際上微生物學研究的前沿領域和熱點。至今國內外學者已經通過該技術克隆島如淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、酯酶等新基因，這些酶具有新穎的酶學特性及工業應用潛力。因此，該方法為發現阿魏酸酯酶新基因提供了新思路。

發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種新型阿魏酸酯酶，同時提供一種所述新型阿魏酸酯酶的DNA。本發明的第二個目的在于提供一種所述新型阿魏酸酯酶的宏基因組學克隆方法。本發明的第三個目的在于提供一種含有上述新型阿魏酸酯酶的DNA的表達載體。本發明的第四個目的在于提供一種利用上述表達載體制備重組阿魏酸酯酶的方法，同時提供一種采用此方法所得到的重組阿魏酸酯酶。本發明的第五個目的在于提供一種上述重組阿魏酸酯酶在降解植物細胞壁中的應用。
為實現本發明的第一個目的，采取的技術方案為一種新型阿魏酸酯酶，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。一種如上所述新型阿魏酸酯酶的DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所
/Jn o為實現本發明的第二個目的，采取的技術方案為一種如上所述新型阿魏酸酯酶的宏基因組學克隆方法，包括以下步驟提取南海海底泥樣品的總DNA并純化，將純化后的總DNA經Sau3AI酶切，連接pUC118載體，電擊轉化大腸桿菌DH5 a高效感受態建立宏基因組文庫，通過點平板和滴加底物顯色法快速篩選得到陽性克隆子，經測序和BLAST比較并設計引物，從而克隆到目的片段。為實現本發明的第三個目的，采取的技術方案為一種含有如上所述新型阿魏酸酯酶的DNA的表達載體。為實現本發明的第四個目的，采取的技術方案為一種重組阿魏酸酯酶的制備方法，包括以下步驟用上述所述表達載體轉化寄主細胞，培養轉化體，從培養物中獲得重組阿魏酸酯酶。優選地，上述所述的寄主細胞為大腸桿菌。優選地，上述所述重組阿魏酸酯酶的制備方法具體包括以下步驟用上述所述的表達載體的目的片段經BamHI、HindIII雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉化至大腸桿菌BL21，經IPTG誘導，得到高效可溶性表達。優選地，上述所述的IPTG終濃度為0. 05 0. 6mM,誘導溫度為18 37°C。一種采用上述所述方法得到的重組阿魏酸酯酶。為實現本發明的第五個目的，采取的技術方案為一種如上所述的重組阿魏酸酯酶在降解植物細胞壁中的應用。所述重組阿魏酸酯酶在降解植物細胞壁中的應用中，采用去淀粉麥麩(DSWB)為底物。本發明的有益效果為(I)從海底泥樣品構建好的宏基因組文庫中得到一個新的阿魏酸酯酶的DNA序列，通過基因工程技術對其功能研究，發現該序列在大腸桿菌中高效可溶表達，經蛋白純化及SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，初步確定分子量為35kDa。(2)本發明將SEQ ID NO. I所示的DNA序列克隆島原核表達載體上，轉化入大腸桿菌感受態細胞，通過對陽性克隆子的誘導表達得到重組蛋白，研究其酶學性質，結果如下①在大腸桿菌表達體系中，所得重組蛋白具有高效可溶性表達；
②用對硝基苯酚阿魏酸酯為底物，測得重組蛋白的最適反應溫度為40°C，在溫度低于50°C，該重組阿魏酸酯酶非常穩定；該重組蛋白的最適反應pH為6. 8，且在pH10. 0反應時，酶的相對活力保持在70%以上，說明其在中性及堿性條件下活性較高；該酶在pH5. 0-10. 0下保溫24h，仍具有80%以上的酶活力，說明其具有較寬的pH酶解范圍；測定高鹽濃度對酶活力影響時發現，重組阿魏酸酯酶在3M KCl和5M NaCl的溶液中分別保育96h和120h，酶活力維持在50%以上，說明其具有明顯的鹽耐受性。對重組阿魏酸酯酶的酶活力有明顯提高作用Mg2+和Fe3+對該重組阿魏酸酯酶的酶活力均有不同程度的提高作用，然而Cu2+則對該酶的酶活性具有明顯的抑制作用；該重組阿魏酸酯酶對對硝基苯酚阿魏酸酯的比酶活為21. 7±1. 7U/mg，對阿魏酸甲酯、對香豆酸甲酯和芥子酸甲酯的比酶活分別為7. 3 + 1. lU/mg、2. 5±0. 4U/mg、10. 2±2. lU/mg，然而對咖啡酸甲酯無作用，推測該重組蛋白屬于A型阿魏酸酯酶。 (3)在對所述重組阿魏酸酯酶對植物細胞壁(DSWB)的降解的研究中發現，重組阿魏酸酯酶需要在木聚糖酶的協同作用下，在40°C下對去淀粉麥麩作用10h，可以釋放其中約16%的阿魏酸，在降解和利用木質纖維素中具有應用空間。


圖I是本發明實施例I中的SDS-PAGE的電泳圖。圖2為對硝基苯酚標準曲線。圖3為重組蛋白降解底物對硝基苯酚阿魏酸酯的最適溫度和熱穩定性結果折線圖。圖4為重組蛋白降解底物對硝基苯酚阿魏酸酯的最適pH和pH穩定性結構折線圖。圖5為重組蛋白降解底物耐鹽性的結構折線圖。圖6為重組蛋白從DSWB中釋放阿魏酸酯酶的HPLC分析結果。其中，圖I中，M為標準蛋白分子量maker，I為重組蛋白粗提物，2為純化的重組蛋白；圖3中，圖a為最適溫度折線圖，圖b為熱穩定性折線圖；圖4中，I為最適pH折線圖，2為pH穩定性折線圖；圖5中，I為5M NaCl對重組蛋白影響折線圖，2為3M KCl對重組蛋白影響折線圖；圖6中，圖a為標準阿魏酸分析圖譜，圖b為單獨使用重組阿魏酸酯酶Est27時反應液分析圖譜，圖c為重組阿魏酸酯酶Est27與木聚糖酶的協同作用下的反應液分析圖譜。
具體實施例方式為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明。實施例I宏基因組文庫的建立和陽性克隆子的獲得、基因克隆與表達I、總DNA的提取稱取6g 樣品，加入 13.5ml DNA 提取緩沖液(0. IM Tris,0. IM EDTA-Na,0. IMNa3PO4,1. 5M NaCl, I % CTAB, pH 值 8. 0)，劇烈振蕩 3_5min，加入 200 u L 溶菌酶(IOOmg/ml)，反復顛倒5-6次，37°C水浴30min，加入I. 5ml20% SDS，65°C水浴Ih (期間每隔15min上下顛倒幾次),8000r/min離心5min,取上清液,用等體積氯仿抽提2次，16000r/min離心IOmin,取上清,加入0. 6倍體積的異丙醇,室溫放置2h, 20000r/min離心20min,棄上清,沉淀加5mL預冷的70%乙醇,20000r/min離心IOmin,收集DNA沉淀,風干,用適量TE緩沖液溶解。2、試劑盒法純化DNA :按照膠回試劑盒說明書進行。3、宏基因組電泳檢測用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的純度和質量。4、酶切總DNA :用限制性內切酶Sau3AI部分酶切總DNA，回收2_10kb的酶切片段，方法同試劑盒法純化DNA。5、酶切片段的電泳檢測方法同宏基因組電泳檢測。 6、酶切片段的鏈接將回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI (BAP)載體連接過夜，向連接產物中加入0. 6倍體積的異丙醇,室溫沉淀I. 5h, 14000r/min離心20min,棄上清并向沉淀中加入70%無水乙醇洗滌2次，風干并加入適量ddH20重溶。7、連接產物的轉化吸取5 U I的連接產物加入到100 U I的大腸桿菌DH5 a高效感受態中，2500V/cm(Eppdorf 2510電擊儀)電擊I次，46°C熱激6min，37°C，180rpm搖床培養45-60min，吸取30 40 涂布于LB瓊脂平板，37°C培養過夜。根據平板上菌落數目將剩余的轉化產物涂布含氨芐青霉素(100 u g/ml)、IPTG(ImM)和X_gal (24 u g/ml)的LB平板。由此構建了一個庫容量約50000個轉化子、多樣性好的宏基因組文庫。8、文庫篩選和陽性克隆子的鑒定將文庫中所有的白板單菌落點種至兩個含氨芐青霉素(IOOii g/ml)、IPTG(ImM)的LB固體培養基中，37°C培養48h，選擇其中一塊平板倒入0. 4%含阿魏酸甲酯(I. 92mg/ml)和酚紅(0.456mM)的上層培養基，37°C放置30min后觀察平板。能夠產生明顯的黃色透明圈的即為陽性克隆。通過篩選得到I株陽性克隆子。從相應的平板中將陽性克隆子挑出并接種至IOmL含氨芐青霉素(100 U g/ml)的LB液體培養基中，37°C、220r/min搖床培養過夜，取2mL菌體進行質粒提取，對插入片段測序，將測定的序列經過NCBI的BLASTn軟件分析比較，發現該DNA由843個堿基組成，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示，該DNA編碼的多肽，含281個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 3所示,將其命名為Est27。其中SEQ ID NO. 2為SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 3的對照圖。9、基因片段的克隆根據測序結果設計一對引物est27-F和est27_R，引物兩端引入能插入pET-28a(+)載體的HindIII和BamHI酶切位點，引物序列如下est27-F :3’ CGCGGATCCATGACCCCCGAATTGCGCGCCAAG5’ (下劃線為引入的 BamHI 酶切位點)est27-R 3，CCCAAGCTTCTACCGCGTCACCCTGCGCACAAAC5，(下劃線為引入的 HindIII酶切位點)以質粒pUC118_est27為模板，進行PCR反應，體系如下
權利要求
1.一種新型阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所 示。
2.如權利要求I所述新型阿魏酸酯酶的DNA，其特征在于，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
3.—種如權利要求I所述新型阿魏酸酯酶的宏基因組學克隆方法，其特征在于，包括以下步驟提取海底泥樣品的總DNA并純化，將純化后的總DNA經Sau3AI酶切，連接pUCl 18載體，電擊轉化大腸桿菌DH5 a高效感受態建立宏基因組文庫，通過點平板和滴加底物顯色法快速篩選得到陽性克隆子，經測序和BLAST比較并設計引物，從而克隆到目的片段。
4.一種含有如權利要求2所述新型阿魏酸酯酶的DNA的表達載體。
5.一種重組阿魏酸酯酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟用權利要求4所述的表達載體轉化寄主細胞，培養轉化體，從培養物中獲得重組阿魏酸酯酶。
6.如權利要求5所述的重組阿魏酸酯酶的制備方法，其特征在于，所述的寄主細胞為大腸桿菌。
7.如權利要求6所述的重組阿魏酸酯酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟用權利要求4所述的表達載體的目的片段經BamHI、HindIII雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉化至大腸桿菌BL21，經IPTG誘導，得到高效可溶性表達。
8.如權利要求7所述的重組阿魏酸酯酶的制備方法，其特征在于，所述的IPTG終濃度為0. 05 0. 6mM,誘導溫度為18 37°C。
9.一種采用如權利要求5所述方法得到的重組阿魏酸酯酶。
10.如權利要求9所述重組阿魏酸酯酶在降解植物細胞壁中的應用。
全文摘要
本發明公開一種新型阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；本發明還公開了所述新型阿魏酸酯酶的DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明還公開了含有上述新型阿魏酸酯酶DNA的表達載體、重組阿魏酸酯酶及其制備方法，以及所述重組阿魏酸酯酶在降解植物細胞壁中的應用。本發明所述新型阿魏酸酯酶與重組阿魏酸酯酶在大腸桿菌表達體系中高效可溶性表達，所述重組阿魏酸酯酶能夠從20mg去淀粉麥麩中釋放16.3±0.9μg阿魏酸，占其中所述阿魏酸總量的16％。
文檔編號C12N15/10GK102719414SQ20121013235
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者劉玉煥, 桑姝麗, 范新炯 申請人:中山大學