專利名稱：酶法制備富含藻油n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯的方法
技術領域：
本發明屬于多不飽和脂肪酸甘油酯的生物合成及酶催化技術領域，涉及一種酶法制備富含藻油n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯的方法，具體的說，涉及一種利用全生物酶法催化合成高n-3多不飽和脂肪酸含量甘油酯的方法。
背景技術：
n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)對人類健康有著舉足輕重的作用，近年來已愈來愈受到人們的重視。其特征脂肪酸 DHA(cis-4, 7,10,13,16,19-Docosahexaenoic Acid,二十二碳六稀酸)和 EPA(cis_5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic Acid, 二十碳五稀酸)因具有多種獨特的生理功能而備受人們青睞。其中，EPA具有改善血液循環、調節血脂、降血壓、軟化血管以及抗炎等作用，可用于治療血栓、心肌梗塞等，被譽為“血管清道夫”;DHA具有營養大腦、促進大腦發育、保護視力、調節免疫以及抗癌等作用，因其容易通過血腦屏障進入大腦，作用于神經系統，因而被譽為“腦黃金”。鑒于DHA對人體健康的重要功能，1991年加拿大政府率先將其列入“營養素推薦量”名單之中。1992年英國提出了 “對健康成人膳食不飽和脂肪酸攝入量”的建議。聯合國糧農組織和世界衛生組織也都在膳食指南中明確規定，嬰兒配方奶粉中必須含有DHA。人類和多種其他動物自身不能合成n-3PUFA，因而必須通過飲食獲取。傳統的n-3PUFA的來源主要是深海魚油，但是大量捕撈導致魚資源緊缺，食物鏈的富集作用導致提取的魚油中含有重金屬離子和高膽固醇，并且不同魚種的油含量以及油中多不飽和脂肪酸的含量差異較大，基于上述弊端，利用微藻發酵生產多不飽和脂肪酸的方法應運而生。與魚油相比，藻油是從培養的藻類中直接提取，不經食物鏈的富集，不含任何色素和重金屬離子，安全無污染，且為可再生資源，更重要的是其脂肪酸組成較為簡單，多不飽和脂肪酸含量一般是魚油的3-10倍。因此以藻油為多不飽和脂肪酸的來源是安全清潔可靠的。DHA和EPA的天然存在形式為甘油酯型，而對其人為富集的主要形式包括甲乙酯型、游離脂肪酸型和甘油酯型。由于DHA和EPA大多應用于醫藥和保健品領域，所以人們對甲乙酯型和游離脂肪酸型提出了安全性方面的質疑。甲酯型在制備中使用了有毒的甲醇，因此可能存在甲醇毒性，食用不安全；乙酯型產品不易被胰酯酶水解而難以被人體消化利用，且分解后產生乙醇，一些對乙醇耐受性差的人會引起過敏等不良反應；游離脂肪酸型雖然易于被人體消化和吸收，但其游離形式不穩定，易被氧化分解，給保存和運輸帶來很大困難，而且其口感不佳，很難作為日常藥品和保健品為人們所接受。相比較而言，甘油酯型為其天然存在形式，符合人體消化和吸收機制，安全有效且性狀穩定、口感較佳，因此以甘油酯型富集的DHA和EPA是最有效安全的產品形式。目前，有多種方法可將DHA和EPA以不同形式進行富集，主要包括低溫結晶法、分子蒸餾法、金屬鹽沉淀法、銀離子絡合法、尿素包合法、高效液相色譜法、超臨界萃取法和脂肪酶法等。其中，脂肪酶法與其他物理化學法相比具有催化效率高、反應條件溫和、能耗低和環境友好等優點而得到廣泛重視。尤其，對于多不飽和脂肪酸的富集來說，由于多不飽和脂肪酸所含雙鍵較多，極易在高溫高壓下氧化分解，產生有害產物，若攝入體內極易導致各種生理異常，所以脂肪酶富集法的優勢尤為突出。本發明的全部過程均采用脂肪酶進行催化，最大程度的保護了多不飽和脂肪酸。目前已 公開發表的文章或專利中，酶法富集的工藝主要包括酶促選擇性水解、酶促選擇性酸解、酶促選擇性醇解和酶促酯化合成等。酶促選擇性水解工藝較為簡單，富集效率不高，n-3PUFA在甘油酯中含量僅能達到50%左右；酶促選擇性酸解、酶促選擇性醇解法對酶的選擇性要求較高，且酶促選擇性醇解產物為混合甘油酯；酶促酯化合成反應底物脂肪酸和甘油分散在兩相體系中，不利于反應傳質；且大多數報道都是富集魚油多不飽和脂肪酸，如中國專利CN101161819A和CN101348807A都公開了利用魚油n_3PUFA濃縮物和甘油通過酯化反應富集DHA和EPA。但是，上述兩個專利均以魚油為原料，在整個工藝中都是通過化學法水解制備n-3PUFA濃縮物，化學法反應溫度較高，且使用大量的堿作為催化劑，不僅對易氧化的n-3PUFA會有一定的破環，而且產生大量的堿廢水等污染物；合成反應都是以甘油和化學法制備得到的n-3PUFA濃縮物為底物進行酯化反應，由于二者是互不相溶的兩種底物，所以反應傳質方面會受到影響，導致反應時間較長。因此，目前需要研究開發一種原料來源清潔安全，整個工藝全部采用生物酶法，產品中DHA和EPA含量高，反應過程高效靈活，可操作性強的經濟高效的酶法制備富含n-3PUFA的甘油酯的制備技術。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供了一種酶法制備富含藻油n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯的方法。該方法以微生物藻油為原料，利用脂肪酶的催化特異性，將酶法部分水解和全部水解相結合，分別制得部分水解的甘油酯和游離脂肪酸，后者又通過尿素包合制得n-3多不飽和脂肪酸濃縮物，再以部分水解的甘油酯和n-3多不飽和脂肪酸濃縮物為底物，合成富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯，所制得產物中DHA和EPA的含量顯著提高。該方法以微生物藻油作為n-3多不飽和脂肪酸的來源，原料安全清潔、成本低廉，反應過程高效靈活，可操作性強。為實現上述目的，本發明提供了一種酶法制備富含藻油n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯的方法，包括步驟A，酶法部分水解藻油，獲得的主產物為初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯，副產物為游離脂肪酸；步驟B，酶法全部水解藻油，制得游離脂肪酸；步驟C，采用尿素包合法分離游離脂肪酸中的n-3多不飽和脂肪酸，制得n-3多不飽和脂肪酸濃縮物；步驟D，固定化脂肪酶催化合成富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯；其中，步驟D以初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯和n_3多不飽和脂肪酸濃縮物為底物，以有機溶劑為反應介質，在惰性氣體保護及固定化脂肪酶的催化下，進行振蕩反應，所獲得的反應液經中和、萃取、水洗、過濾、干燥及減壓蒸餾制得富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯。根據本發明方法，步驟D中所述初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯和n-3多不飽和脂肪酸濃縮物的摩爾比為I : I 10。所述有機溶劑為Log P(P為有機溶劑在辛醇和水兩相體系中的分配系數)不小于3的有機溶劑，其用量為10 15ml/g酸。所述有機溶劑選自正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、正壬烷、正癸烷中的一種或多種。所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化載體上制得，其添加量為2500 4000U/g酸。所述固定化載體選自軟質聚氨酯海綿、綿綢、微球、纖維、尼龍及大孔樹脂等中的一種或多種，優選所述固定化載體為軟質聚氨酯海綿。本發明所用單位“U/g酸”中的“酸”是指n-3多不飽和脂肪酸濃縮物。
所述脂肪酶為對多不飽和脂肪酸與部分水解的甘油酯的反應具有催化作用的脂肪酶，例如，Candida sp. 99-125脂肪酶，該脂肪酶依照中國發明專利CN1948470A公開的方法制備，使用批次在10批左右。所述多不飽和脂肪酸與部分水解的甘油酯的反應為酯化和/或轉酯化反應。所述固定化脂肪酶，例如，可選自Novozym435脂肪酶、Rhizomucormiehei脂肪酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及Candida sp. 99-125脂肪酶中的一種或多種,優選所述固定化脂肪酶為Candida sp. 99-125固定化脂肪酶，該酶由Candida sp. 99-125脂肪酶固定于軟質聚氨酯海綿載體上制成。在步驟D的反應過程中，所述反應的溫度為40 50°C，反應的時間為24 96h。進行振蕩反應的振蕩器轉速為200rpm。反應結束后,反應液用堿進行中和，用萃取劑進行萃取，用去離子水洗至中性，并通過無水Na2SO4進行干燥。其中，所述萃取劑為正己烷等，所述堿為Na0H、K0H等。在本發明的一個具體實施例中，在上述反應過程中，初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯與n-3多不飽和脂肪酸濃縮物摩爾比為I : I 10，有機溶劑的用量為10 15ml/g酸，固定化脂肪酶添加量為2500 4000U/g酸；充入氮氣作為惰性氣體進行密封保護，在40 50°C條件下，以200rpm的轉速振蕩反應24 96h ;反應結束后，反應液用KOH中和，加入正己烷萃取富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯，水洗至中性，過無水他2304進行干燥，減壓蒸餾除去溶劑后得到富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯產品；經氣相色譜檢測，所制得的產品中DHA含量為60 % 68 %，EPA含量為21 % 27 %，n_3多不飽和脂肪酸總含量不低于80%。根據本發明方法，步驟A將藻油與緩沖液及水解酶混合后，在惰性氣體保護條件下進行部分水解反應，反應結束濾除水解酶后，濾液經中和，萃取，所分離出的萃取液經水洗，干燥及減壓蒸餾，制得作為主產物的初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯，水化層則經酸化，萃取，水洗，干燥及減壓蒸餾，獲得作為副產物的游離脂肪酸，其中，水解反應的水解率控制在40% 60%。根據本發明方法，在步驟A中，所述藻油與緩沖液的質量比為I : O. 6 I。所述水解酶為脂肪酶酶粉或者固定化脂肪酶，其添加量為600 1500U/g藻油，所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化載體上制得，所述脂肪酶為對藻油的水解反應有催化作用的脂肪酶，例如，Candida sp. 99-125脂肪酶，該脂肪酶依照中國發明專利CN1948470A公開的方法制備，使用批次在10批左右。所述固定化載體選自軟質聚氨酯海綿、綿綢、微球、纖維、尼龍及大孔樹脂等中的一種或多種，優選所述固定化載體為軟質聚氨酯海綿。所述酶粉，例如，優選為Candida sp. 99-125脂肪酶酶粉。所述固定化脂肪酶，可選自 Novozym435 脂肪酶、Rhizomucormiehei 脂肪酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及 Candidasp. 99-125脂肪酶中的一種或多種,優選所述固定化脂肪酶為Candida sp. 99-125固定化
脂肪酶。在步驟A的水解反應過程中,所述水解反應的溫度為35 50°C。反應結束濾除水解酶后，濾液用堿進行中和，用萃取劑進行萃取，所分離出的萃取液用去離子水洗至中性，并過無水Na2SO4進行干燥，其中，所述萃取劑為正己烷等，所述堿為NaOH、KOH等。而水化層則用鹽酸酸化，然后用萃取劑進行萃取，用去離子水洗至中性，并過無水Na2SO4進行干燥，其中，所述萃取劑為正己烷等，所述堿為NaOH、KOH等。在根據本發明方法的一個優選實施例中，步驟A將藻油與緩沖液、脂肪酶酶粉及環糊精混合后，在惰性氣體保護條件下進行部分水解反應，其中，所述環糊精的加入量為脂肪酶酶粉質量的O. 5 2倍。部分水解反應結束后，濾除脂肪酶酶粉，濾液經中和，萃取，所分離出的萃取液經水洗，干燥及減壓蒸餾，制得作為主產物的初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯，水化層則經酸化，萃取，水洗，干燥及減壓蒸餾，獲得作為副產物的游離脂肪酸。在本發明的一個具體實施例中，在上述反應過程中，藻油與緩沖液的質量比為I O. 6 1，脂肪酶酶粉添加量為600 1500U/g藻油，加入脂肪酶酶粉質量O. 5 2倍的環糊精；充入氮氣作為惰性氣體進行密封保護，在35 50°C條件下進行水解反應，控制水解率在40% 60%，此時部分水解的甘油酯中n-3多不飽和脂肪酸含量最高；反應結束后，抽濾除去脂肪酶酶粉，濾液用KOH中和，加入萃取劑進行萃取，并所分離出的萃取液用去離子水洗至中性，過無水Na2SO4進行干燥，減壓蒸餾除去溶劑制得作為主產物的初步富集了n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯。水化層則經鹽酸酸化，加入萃取劑萃取游離脂肪酸，去離子水洗至中性，過無水Na2SO4進行干燥，減壓蒸餾除去溶劑，獲得作為副產物的游離脂肪酸。經氣相色譜檢測，所獲得主產物部分水解的甘油酯中n-3多不飽和脂肪酸含量為DHA 45% 50%，EPA 15 20%，主產物部分水解的甘油酯的得率為86% 92%。根據本發明方法，步驟B將藻油與緩沖液、鹽及水解酶混合后，在惰性氣體保護條件下進行全部水解反應，水解過程中補加脂肪酸中和劑，反應結束濾除水解酶后，濾液經中和，萃取，所分離出的萃取液經水洗、干燥、減壓蒸餾，獲得未被水解的藻油甘油酯重新作為原料使用；水化層則經酸化，萃取，水洗，干燥及減壓蒸餾，獲得游離脂肪酸。經過全部水解反應后，上述水解反應過程中所分離出的萃取液中所含未被水解的藻油甘油酯僅為少量，其得率低于IOwt%。根據本發明方法，在步驟B中，所述藻油與緩沖液的質量比為I : O. 6 I。所述水解酶為脂肪酶酶粉或者固定化脂肪酶，其添加量為600 1500U/g藻油，所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化載體上制得，所述脂肪酶為對藻油的水解反應有催化作用的脂肪酶，例如，Candida sp. 99-125脂肪酶，該脂肪酶依照中國發明專利CN1948470A公開的方法制備，使用批次在10批左右。所述固定化載體選自軟質聚氨酯海綿、綿綢、微球、纖維、尼龍及大孔樹脂等中的一種或多種，優選所述固定化載體為軟質聚氨酯海綿。所述酶粉，例如，優選為Candida sp. 99-125脂肪酶酶粉。所述固定化脂肪酶，可選自 Novozym435 脂肪酶、Rhizomucormiehei 脂肪酶、Alcaligenes sp.脂肪酶以及 Candidasp. 99-125脂肪酶中的一種或多種,優選所述固定化脂肪酶為Candida sp. 99-125固定化脂肪酶。在步驟B的水解反應過程中，所述水解反應的溫度為35 50°C，水解反應的時間為48 96h。所述鹽為對酶活有促進作用的金屬鹽，其包括CaCl2和/或MgCl2，其加入量為5 10mM。優選所述金屬鹽為CaCl2。所述水解過程中補加脂肪酸中和劑，是在水解率達到20% 30%后，補加一次脂肪酸中和劑，其加入量為藻油量的O. 5wt% I. Owt%。所述脂肪酸中和劑是固體堿，其選自KOH、NaOH及Ca (OH)2中的一種或幾種。優選所述固體堿為 Ca(0H)2。反應結束濾除水解酶后，濾液用堿進行中和，用萃取劑進行萃取，用去離子水洗至中性，并過無水Na2SO4進行干燥，其中，所述萃取劑為正己烷，所述堿為NaOH、KOH等。所分離出的萃取液用去離子水洗至中性，并過無水Na2SO4進行干燥，其中，所述萃取劑為正己烷等，所述堿為NaOH、KOH等。水化層用鹽酸酸化，用萃取劑進行萃取，用去離子水洗至中性，過無水Na2SO4進行干燥，其中，所述萃取劑為正己烷等，所述堿為NaOH、KOH等。 在根據本發明方法的一個優選實施例中，步驟B將藻油與緩沖液、脂肪酶酶粉及環糊精混合后，在惰性氣體保護條件下進行全部水解反應，其中，所述環糊精的加入量為脂肪酶酶粉質量的O. 5 2倍。水解過程中補加脂肪酸中和劑，反應結束后，濾除脂肪酶酶粉，濾液經中和，萃取，所分離出的萃取液經水洗、干燥、減壓蒸餾，獲得未被水解的藻油甘油酯重新作為原料使用；水化層則經酸化，萃取，水洗，干燥及減壓蒸餾，獲得游離脂肪酸。在本發明的一個具體實施例中，在上述反應過程中，藻油與緩沖液的質量比為I O. 6 1，緩沖液中加入5 IOmM CaCl2，脂肪酶酶粉添加量為600 1500U/g藻油，環糊精添加量為脂肪酶酶粉的O. 5 2倍；充入氮氣作為惰性氣體進行密封保護，在35 50°C條件下進行水解反應，在水解率達到20% 30%后，補加藻油量O. 5wt% I. 0被％的Ca(OH)2以促進反應平衡向產物方向移動，水解反應總時間為48 96h。反應結束后，抽濾除去脂肪酶酶粉，濾液用KOH中和，加入正己烷萃取，所分離出的萃取液用去離子水洗至中性，過無水Na2SO4進行干燥，經減壓蒸餾，所獲得未被水解的藻油甘油酯可重新作為水解原料使用；而水化層用2mol/L HCl酸化,然后用正己燒萃取游離脂肪酸，水洗至中性，并過無水Na2SO4進行干燥，減壓蒸餾除去溶劑后得到游離脂肪酸。上述水解反應過程的水解率為80% 85%,游離脂肪酸得率為85% 90% ；上述反應過程中，在緩沖液中加入5 IOmM金屬鹽以及在水解率達到20 30%后加入藻油量O. 5wt% I. Owt%的固體堿，可以將水解率提高5% 10%。本發明步驟A及步驟B中，所用原料為含有n-3多不飽和脂肪酸的微生物藻油，該原料清潔安全，且n-3多不飽和脂肪酸含量較高，其n-3多不飽和脂肪酸含量在20% 60%之間。在本發明步驟A及步驟B中，所述脂肪酶在催化甘油酯水解過程中對甘油酯上的脂肪?；哂幸欢ǖ倪x擇性，通過有效控制水解率，可對含有n-3多不飽和脂肪酸的藻油進行部分水解和全部水解，部分水解后的甘油酯中n-3多不飽和脂肪酸的含量得到一定程度的提聞。本發明中，步驟A中催化藻油部分水解所采用的脂肪酶及步驟B中催化藻油全部水解所采用的脂肪酶，與步驟D中催化多不飽和脂肪酸與部分水解的甘油酯進行酯化和/或轉酯化反應的脂肪酶可以是不同種脂肪酶，也可以是同種脂肪酶，優選為同種脂肪酶，以簡化操作，便于控制。根據本發明方法，步驟C在惰性氣體保護條件下，將游離脂肪酸與尿素和醇類溶劑共混后，進行靜置包合，包合結束后濾除尿素包合物，濾液經酸化、萃取、水洗、干燥及減壓蒸餾，制得n-3多不飽和脂肪酸濃縮物。根據本發明，在步驟C中，所述游離脂肪酸與尿素和醇類溶劑共混，是在尿素與醇類溶劑混合形成澄清透明溶液后，再加入60°C下預熱的游離脂肪酸進行共混。所述脂肪酸尿素醇類溶劑為I : 2 4 : 5 10 (w/w/v)。所述醇類溶劑為甲醇和/或乙醇，優選所述醇類溶劑為乙醇。所述共混的溫度為60 80°C，共混的時間為60 90min。所述包合的溫度為O 4°C,包合的時間為16 20h。包合結束后，濾除尿素包合物,濾液用鹽酸酸化，然后用萃取劑進行萃取，用去離子水洗至中性，并過無水Na2SO4進行干燥。在本發明的一個具體的實施例中，在上述反應過程中，按照脂肪酸尿素乙醇為I : 2 4 : 5 10(w/w/V)的比例將步驟A及步驟B中藻油水解后得到的游離脂肪酸與尿素和乙醇共混；先在尿素與乙醇混合形成澄清透明溶液后，充入氮氣作為惰性氣體進行保護，并加入60°C下預熱的游離脂肪酸進行共混，然后在60 80°C條件下共混60 90min,然后在O 4°C條件下靜置包合16 20h ;包合結束后，抽濾除去尿素包合物,將富含脂肪酸乙酯的濾液用2mol/L的HCl酸化，然后用正己烷萃取，水洗至中性，并過無水Na2SO4進行干燥，減壓蒸餾后制得n-3多不飽和脂肪酸濃縮物。其中，DHA含量為68% 73%，EPA含量為20% 25%，n-3多不飽和脂肪酸濃縮物收率為85% 90%。本發明中，將所制得富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯產品，以及反應過程中所獲得的產物，包括初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯、游離脂肪酸以及n-3多不飽和脂肪酸濃縮物，分別進行甲酯化后，并采用氣相色譜儀(GC2010，日本島津)檢測其DHA和EPA的含量。水解反應過程中，水解率采用堿滴定法進行測定，并按照下列公式進行計算
權利要求
1.一種酶法制備富含藻油n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯的方法，包括 步驟A，酶法部分水解藻油，獲得的主產物為初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯，副產物為游離脂肪酸； 步驟B，酶法全部水解藻油，制得游離脂肪酸； 步驟C，采用尿素包合法分離游離脂肪酸中的n-3多不飽和脂肪酸，制得n-3多不飽和脂肪酸濃縮物； 步驟D，固定化脂肪酶催化合成富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯； 其中，步驟D以初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯和n-3多不飽和脂肪酸濃縮物為底物，以有機溶劑為反應介質，在惰性氣體保護及固定化脂肪酶的催化下，進行振蕩反應，所獲得的反應液經中和、萃取、水洗、過濾、干燥及減壓蒸餾制得富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于 步驟D中所述初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯和n-3多不飽和脂肪酸濃縮物的摩爾比為I : I 10; 所述有機溶劑為Log P值不小于3的有機溶劑，其用量為10 15ml/g酸； 所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化載體上制得，其添加量為2500 4000U/g酸；所述脂肪酶為對多不飽和脂肪酸與部分水解的甘油酯的反應具有催化作用的脂肪酶；所述反應的溫度為40 50°C，反應的時間為24 96h。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟A將藻油與緩沖液及水解酶混合后，在惰性氣體保護條件下進行部分水解反應，反應結束濾除水解酶后，濾液經中和，萃取，所分離出的萃取液經水洗，干燥及減壓蒸餾，制得作為主產物的初步富集了 n-3多不飽和脂肪酸的部分水解的甘油酯，水化層則經酸化，萃取，水洗，干燥及減壓蒸餾，獲得作為副產物的游離脂肪酸，其中，水解反應的水解率控制在40% 60%。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于 所述藻油與緩沖液的質量比為I : O. 6 I ; 所述水解酶為脂肪酶酶粉或者固定化脂肪酶，其添加量為600 1500U/g藻油，所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化載體上制得，所述脂肪酶為對藻油的水解反應有催化作用的脂肪酶； 所述水解反應的溫度為35 50°C。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于 步驟A將藻油與緩沖液、脂肪酶酶粉及環糊精混合后，在惰性氣體保護條件下進行部分水解反應，其中，所述環糊精的加入量為脂肪酶酶粉質量的O. 5 2倍。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟B將藻油與緩沖液、鹽及水解酶混合后，在惰性氣體保護條件下進行全部水解反應，水解過程中補加脂肪酸中和劑，反應結束濾除水解酶后，濾液經中和，萃取，所分離出的萃取液經水洗、干燥、減壓蒸餾，獲得未被水解的藻油甘油酯重新作為原料使用；水化層則經酸化，萃取，水洗，干燥及減壓蒸餾，獲得游離脂肪酸。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于 所述藻油與緩沖液的質量比為I : O. 6 I ;所述水解酶為脂肪酶酶粉或者固定化脂肪酶，其添加量為600 1500U/g藻油，所述固定化脂肪酶由脂肪酶固定在固定化載體上制得，所述脂肪酶為對藻油的水解反應有催化作用的脂肪酶； 所述鹽為對酶活有促進作用的金屬鹽，其包括CaCl2和/或MgCl2，其加入量為5 IOmM ； 所述水解過程中補加脂肪酸中和劑，是在水解率達到20% 30%后，補加一次脂肪酸中和劑，其加入量為藻油量的O. 5wt % I. Owt %，所述脂肪酸中和劑是固體堿，其選自KOH、NaOH及Ca (OH) 2中的一種或幾種； 所述水解反應的溫度為35 50°C，水解反應的時間為48 96h。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于 步驟B將藻油與緩沖液、脂肪酶酶粉及環糊精混合后，在惰性氣體保護條件下進行全部水解反應，其中，所述環糊精的加入量為脂肪酶酶粉質量的O. 5 2倍； 所述金屬鹽為CaCl2 ； 所述固體堿為Ca(0H)2。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟C在惰性氣體保護條件下，將游離脂肪酸與尿素和醇類溶劑共混，并進行靜置包合，包合結束后濾除尿素包合物，濾液經酸化、萃取、水洗、干燥及減壓蒸餾，制得n-3多不飽和脂肪酸濃縮物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于 所述游離脂肪酸與尿素和醇類溶劑共混，是在尿素與醇類溶劑混合形成澄清透明溶液后，再加入60°C下預熱的游離脂肪酸進行共混； 所述脂肪酸尿素醇類溶劑為I : 2 4 : 5 10(w/w/v)； 所述共混的溫度為60 80°C,共混的時間為60 90min ； 所述包合的溫度為O 4°C，包合的時間為16 20h。
全文摘要
本發明涉及一種酶法制備富含藻油n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯的方法。該方法以微生物藻油為原料，在脂肪酶催化下，通過控制水解率分別將藻油進行部分及全部水解，制得部分水解的甘油酯和游離脂肪酸；后者通過尿素包合法富集n-3多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，制得n-3多不飽和脂肪酸濃縮物；然后以n-3多不飽和脂肪酸濃縮物和部分水解的甘油酯為底物，以固定化脂肪酶為催化劑，在有機相中高效合成富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油酯。本發明采用全生物酶法富集工藝，原料清潔安全，工藝路線科學合理，酶催化活性高，催化劑可循環利用，成本低廉，反應條件溫和，能耗低，環境友好，市場前景廣闊。
文檔編號C12P7/64GK102660593SQ20121013405
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者崔彩霞, 楊曉丹, 譚天偉, 錢軼歡, 陳必強, 陶一峰 申請人:北京化工大學