專利名稱：一種胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及林木育種中胚性材料的保存方法，具體涉及一種胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法。
背景技術(shù)：
在林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生體系中，培養(yǎng)材料中的胚性細(xì)胞是否能較長時間保持旺盛的分和植株再生能力也是林木體胚產(chǎn)業(yè)化的重要瓶頸。目前，還沒有較好的用于保存胚性材料的方法，常用的就是低溫保藏，這種方法雖然簡單，但是保存時間短，而且細(xì)胞恢復(fù)困難，增殖能力低，根本不能長期保存。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，以實現(xiàn)胚性材料長期保存并能使其保持高頻增殖能力。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，包括以下步驟
(1)取待保存的胚性材料，按10%的接種量接入高滲液體培養(yǎng)基，25°C，培養(yǎng)3 10d;其中，高滲液體培養(yǎng)基為添加有0. ro. 8mg/L山梨醇的M13基本培養(yǎng)基；
(2)過濾步驟(I)預(yù)培養(yǎng)的胚性材料，裝入冷凍管，向冷凍管中加入復(fù)合玻璃化保護(hù)劑，(TC，放置脫水0 70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存；復(fù)合玻璃化保護(hù)劑為添加30%甘油和30%乙二醇的M13基本培養(yǎng)基；
(3)從液氮中取出冷凍盒，迅速將冷凍管置于35 43°C水浴中，快速化凍2min;吸去復(fù)合玻璃化保護(hù)劑，向冷凍管加入ImL的高滲愈傷增殖培養(yǎng)基，停留2min，數(shù)次重復(fù)洗滌；高滲愈傷增殖培養(yǎng)基為添加0. ro. 5M蔗糖的M13基本培養(yǎng)基；
(4)把洗滌后的胚性材料迅速轉(zhuǎn)移到墊有濾紙的高滲愈傷增殖培養(yǎng)基，25°C，培養(yǎng)I 6d ；
(5)轉(zhuǎn)胚性材料至低滲愈傷增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)f6d，長出新的愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到愈傷增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；低滲愈傷增殖培養(yǎng)基為添加0. ro. 4M蔗糖的M13基本培養(yǎng)基；
(6)轉(zhuǎn)移長有新的愈傷組織的胚性材料至體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至高頻體細(xì)胞胚胎發(fā)生即可。步驟(I)中，培養(yǎng)6 8d。步驟(I)中，在所述的高滲液體培養(yǎng)基中還加有f 5mg/L ABA和5(T200mg/L脯氨酸。步驟(2)中，所述的放置脫水，為先用60% PVS2保護(hù)胚性材料過渡脫水(TlOmin，然后轉(zhuǎn)到100% PVS脫水(T60min，然后再投入液氮保存。步驟(3 )中，37 °C水浴。步驟(3)中，高滲愈傷增殖培養(yǎng)基為添加0. 6mol/L山梨醇的M13基本培養(yǎng)基。
步驟(4)中，蔗糖濃度為0.4M，培養(yǎng)2d。步驟(5)中，蔗糖濃度為0.3M，培養(yǎng)5d。步驟(6)中，培養(yǎng)3個月，就可以實現(xiàn)高頻體細(xì)胞胚胎發(fā)生。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，操作簡單，方便可行，解決了林木體胚產(chǎn)業(yè)化的重要瓶頸問題，可實現(xiàn)胚性材料長期保存到2年以上，并能使其保持高頻增殖能力，具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效應(yīng)。



圖I是預(yù)培養(yǎng)滲透劑濃度試驗結(jié)果 圖2是預(yù)培養(yǎng)時間試驗結(jié)果 圖3是不同溫度進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇結(jié)果 圖4是胚性懸浮細(xì)胞復(fù)蘇結(jié)果 圖5是可溶性淀粉在恢復(fù)培養(yǎng)中的作用結(jié)果圖；圖中，A、B為恢復(fù)5d時的狀態(tài)，C、D為恢復(fù)25d時的狀態(tài)；
圖6是ABA對細(xì)胞存活的影響結(jié)果 圖7是山梨醇處理后內(nèi)源脯氨酸的變化結(jié)果 圖8是外源脯氨酸對細(xì)胞的保護(hù)作用結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。以下實施例的胚性材料為雜種馬褂木胚性懸浮細(xì)胞，其培養(yǎng)方法同中國專利申請02112948. 7 或 201010298850. 6。M13 基本培養(yǎng)基的配方為MS+2，4_D 2. 0mg/L+6，BA0. 2mg/L+LH 500mg/L + 蔗糖 30g/L, pH 值為 5. 8。實施例I
為了提高冷凍細(xì)胞的存活率，需要將胚性細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，采取的措施是將需要冷凍保存的胚性細(xì)胞接種在含有山梨醇等滲透調(diào)節(jié)劑滲透劑的培養(yǎng)基上，通過滲透調(diào)節(jié)使細(xì)胞部分脫水，減少細(xì)胞內(nèi)的水分，降低冷凍過程中冰晶的形成對細(xì)胞造成的傷害。通過TTC法檢測細(xì)胞活力，從而確定合適的預(yù)處理條件。TTC法是細(xì)胞活力測定的常用方法，該方法用于檢測細(xì)胞內(nèi)脫氫酶的活性。脫氫酶使氯化三苯四氮哇(TTC)還原生成一種紅色復(fù)合物，此有色物質(zhì)不溶于水，但溶于酒精。因此，用酒精抽提，然后用分光光度計測定485nm時的吸光度，吸光度高的細(xì)胞活性強(qiáng)，從而可以確定細(xì)胞的生理狀態(tài)。將胚性懸浮細(xì)胞繼代到高滲液體培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)不同的天數(shù)。高滲液體培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中加入2. Omg/L 2，4-D、0. 2mg/L 6，BA、500mg/L LH和30g/L蔗糖，以及濃度分別為 0. Img/L、0. 2mg/L、0. 3mg/L、0. 4mg/L、0. 5mg/L、0. 6mg/L、0. 7mg/L 和 0. 8mg/L的山梨醇。結(jié)果如圖I所示，表明在不同預(yù)培養(yǎng)濃度下細(xì)胞存活率不同，以山梨醇濃度0. 2mol/L 0. 5mol/L時進(jìn)行的預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞存活率隨山梨醇濃度上升而逐漸上升，到0.6mol/L時活力達(dá)到最高。當(dāng)山梨醇濃度超過0.6mol/L時，細(xì)胞存活率呈下降趨勢。在0. 6mol/L山梨醇濃度下冷凍細(xì)胞存活率最高的結(jié)果說明，該濃度下細(xì)胞脫水最充分，同時沒有高滲脅迫存在。通過不同預(yù)培養(yǎng)時間比較，結(jié)果如圖2所示，表明隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞冷凍后的活力明顯上升，在第4d和第7d處理情況下細(xì)胞活力達(dá)到一個小高峰，隨后細(xì)胞活力開始下降，預(yù)培養(yǎng)時間短于3d時細(xì)胞活力明顯偏低，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞活力不斷升高并趨于穩(wěn)定，說明胚性懸浮細(xì)胞對高滲環(huán)境的一個逐步適應(yīng)的過程。預(yù)培養(yǎng)7d時，細(xì)胞在每個處理情況下都達(dá)到了最高值。因此，認(rèn)為預(yù)培養(yǎng)7d是合適的時間。在進(jìn)行懸浮培養(yǎng)中，在I :9體積比的細(xì)胞和培養(yǎng)基的比例下，細(xì)胞在第7d處于細(xì)胞生長的對數(shù)生長期，細(xì)胞分裂旺盛，形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對冷凍，化凍造成的損傷有較強(qiáng)的抵抗力。實施例2
將實施例I預(yù)培養(yǎng)的胚性懸浮細(xì)胞過濾，取適量體積(約ImL)的細(xì)胞加入冷凍管(5mL)中，向管中加入ImL復(fù)合玻璃化保護(hù)劑(含30%體積甘油、30%體積乙二醇的M13基本培養(yǎng) 基)，在0°C下，放置脫水0 70min，然后將冷凍管裝入冷凍盒直接投入液氮，長期保存。預(yù)培養(yǎng)時間對冷凍保存的成功有著極其重要的作用，通過調(diào)節(jié)滲透壓，可以提高細(xì)胞的抗逆性同時降低細(xì)胞內(nèi)的含水量，從而降低冰晶產(chǎn)生的程度，減少對細(xì)胞的傷害。通過確定以含有0. 6mol/L山梨醇的M13號培養(yǎng)基為預(yù)處理培養(yǎng)基，細(xì)胞與培養(yǎng)基體積比為
I:9，以含30%乙二醇和30%甘油的M13基本培養(yǎng)基作為復(fù)合玻璃化保護(hù)劑，先放入60%體積(用水稀釋)的復(fù)合玻璃化保護(hù)劑過渡脫水0或lOmin，然后放入100%復(fù)合玻璃化保護(hù)劑脫水時間(TeOmin為試驗條件，對預(yù)培養(yǎng)時間進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，在預(yù)培養(yǎng)初期，隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞活力迅速上升，在培養(yǎng)3天時達(dá)到最高值，隨后開始下降，在第5天開始細(xì)胞活力維持在一個相對穩(wěn)定的階段，在13天時明顯下降。隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞冷凍后的活力明顯上升；在第4天和第7天，各處理細(xì)胞活力達(dá)到一個小高峰，隨后細(xì)胞活力開始下降，預(yù)培養(yǎng)時間短于3天時細(xì)胞活力明顯偏低，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞活力不斷升高并趨于穩(wěn)定，體現(xiàn)了雜交鵝掌楸胚性懸浮細(xì)胞對高滲環(huán)境的一個逐步適應(yīng)的過程。在不同的過渡脫水和脫水時間情況下，在未經(jīng)過復(fù)合玻璃化保護(hù)劑處理，直接把預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞放入液氮中，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞的抗性增強(qiáng)，呈上升趨勢，在第8天達(dá)到高值，但與經(jīng)過復(fù)合玻璃化保護(hù)劑處理后的相比，其活力低于經(jīng)過處理的細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)在過渡脫水IOminJAA 30min在各個預(yù)培養(yǎng)時間情況下都能活得一個較高的細(xì)胞活力，說明處理對細(xì)胞能起到最大限度地保護(hù)作用。實施例3
將實施例2儲存胚性懸浮細(xì)胞的冷凍盒從液氮中取出，迅速將冷凍管置于不同溫度梯度水浴中，快速化凍2min。吸去冷凍保護(hù)劑，向冷凍管加入ImL的清洗培養(yǎng)基(即預(yù)培養(yǎng)基，為0. 6mol/L山梨醇的愈傷增殖培養(yǎng)基)，停留2min，重復(fù)3次洗滌。在本實施例設(shè)置了五個水浴溫度梯度，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇溫度在37°C時，復(fù)蘇細(xì)胞的活力達(dá)到最高點。對于雜種馬褂木來說，該溫度條件下，細(xì)胞的活力要高于40°C的化凍溫度。通過恢復(fù)培養(yǎng)讓細(xì)胞迅速地從逆境條件恢復(fù)到正常培養(yǎng)的環(huán)境中。由于冷凍保護(hù)劑是高滲條件(0. 4M蔗糖)，如果滲透壓降低過快將導(dǎo)致細(xì)胞過快膨脹，從而對細(xì)胞膜產(chǎn)生傷害。因此緩慢地降低滲透壓可以最大限度地提高細(xì)胞存活率，該試驗步驟過程如下
第一步高滲恢復(fù)培養(yǎng)把洗滌后的細(xì)胞團(tuán)物質(zhì)迅速轉(zhuǎn)移到墊有濾紙的高滲恢復(fù)培養(yǎng)基。
a.培養(yǎng)時間梯度為l、2、3、4、5、6d，25°C培養(yǎng)。根據(jù)試驗結(jié)果表明，在含0.4M蔗糖
的高滲愈傷增殖 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d較為合適。b.加入0、0. 1、0. 2、0. 3、0.4、0. 5M濃度的蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓。根據(jù)試驗結(jié)果以蔗糖
滲透壓濃度為0. 4M時，恢復(fù)培養(yǎng)的細(xì)胞可以迅速達(dá)到良好狀態(tài)，在轉(zhuǎn)到愈傷增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后就可以看到新的愈傷長出。第二步低滲的恢復(fù)培養(yǎng)
a.培養(yǎng)天數(shù)為l、2、3、4、5、6d，含0. 3M蔗糖的低滲愈傷增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d較為合適。b.加入0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5M濃度的蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓，根據(jù)試驗測定在滲透
壓濃度0. 3M時，細(xì)胞的恢復(fù)時間最短，在轉(zhuǎn)到愈傷增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)第5d就長出新的愈傷組織，最后轉(zhuǎn)移到愈傷增殖培養(yǎng)基(即為M13基本培養(yǎng)基)上進(jìn)行培養(yǎng)。復(fù)蘇后重新誘導(dǎo)成的體細(xì)胞胚胎，經(jīng)過超低溫凍存與復(fù)蘇處理后的胚性材料，在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(常規(guī))上培養(yǎng)，經(jīng)過3個月的體胚發(fā)育過程，如圖4所示，能夠?qū)崿F(xiàn)高頻體細(xì)胞胚胎發(fā)生，與沒有凍存的材料發(fā)育過程相一致。實施例4
將實施例2凍后的胚性懸浮細(xì)胞分別接種在添加有l(wèi)mg/L、2mg/L、5mg/L、I Omg/L、20mg/L可溶性淀粉的0. 4M蔗糖愈傷增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)到0. 3M蔗糖的愈傷增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)到正常生長培養(yǎng)基上。觀察結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)接種在淀粉培養(yǎng)基上效果最好，細(xì)胞恢復(fù)生長的延滯較短，為2 4d，細(xì)胞生長迅速。其它兩個處理，許多細(xì)胞團(tuán)要先變成黃褐色，經(jīng)過9 14d的延滯后才開始生長。直接轉(zhuǎn)接在未加可溶性淀粉的培養(yǎng)基上，許多團(tuán)塊變成白色或者褐色，不能生長。通過試驗加入不同濃度的可溶性淀粉，可以有效地消除濕潤現(xiàn)象，使細(xì)胞在進(jìn)行滲透平衡過程時損傷最小，試驗結(jié)果表明10mg/L體細(xì)胞胚胎的發(fā)生頻率高。實施例5
在實施例I的預(yù)培養(yǎng)基中加入不同濃度的ABA，通過ABA提高細(xì)胞的抗逆性，從而提高細(xì)胞的存活率，在本試驗中，在預(yù)培養(yǎng)階段加入不同濃度lmg/L、2 mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的ABA，結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)在4mg/L時能顯著地提高細(xì)胞的抗凍性，細(xì)胞存活率達(dá)到了80%。實施例6
在植物的組織、器官和全株實驗中，發(fā)現(xiàn)脯氨酸的積累與抗?jié)B透脅迫之間有顯著的正相關(guān)，可以作為衡量細(xì)胞對逆境適應(yīng)能力的指標(biāo)。經(jīng)過不同濃度的山梨醇預(yù)培養(yǎng)后，細(xì)胞的抗凍活力有所差異，結(jié)果如圖7所示，在超低溫保存后，0. ro. 6mol/L山梨醇培養(yǎng)后的細(xì)胞其脯氨酸含量呈直線上升；山梨醇濃度在0. 5,0. 7mol/L處的脯氨酸含量與冷凍前幾乎持平，在0. 6mol/L時脯氨酸含量超過冷凍前并達(dá)到最大值。說明超低溫條件下，盡管細(xì)胞會部分死亡，但是其體內(nèi)的脯氨酸含量還是會相對的增加用來保護(hù)細(xì)胞，這也與在0. 6mol/L山梨醇預(yù)培養(yǎng)下超低溫保存后細(xì)胞活力最高相一致。在實施例I的預(yù)培養(yǎng)基中，加入脯氨酸后，細(xì)胞的存活率隨著濃度增加而提高。如圖8所示，在150mg/L時細(xì)胞存活率達(dá)到最高值，但脯氨酸含量繼續(xù)增加后，細(xì)胞存活率開始下降，說明高濃度脯氨酸可能對細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞在外加高濃度脯氨酸情況下，細(xì)胞活力快速下降 。
權(quán)利要求
1.一種胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取待保存的胚性材料，按10%的接種量接入高滲液體培養(yǎng)基，25°C，培養(yǎng)3 10d;其中，高滲液體培養(yǎng)基為添加有0. ro. 8mg/L山梨醇的M13基本培養(yǎng)基； (2)過濾步驟(I)預(yù)培養(yǎng)的胚性材料，裝入冷凍管，向冷凍管中加入復(fù)合玻璃化保護(hù)劑，(TC，放置脫水0 70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存；復(fù)合玻璃化保護(hù)劑為添加30%甘油和30%乙二醇的M13基本培養(yǎng)基； (3)從液氮中取出冷凍盒，迅速將冷凍管置于35 43°C水浴中，快速化凍2min;吸去復(fù)合玻璃化保護(hù)劑，向冷凍管加入ImL的高滲愈傷增殖培養(yǎng)基，停留2min，數(shù)次重復(fù)洗滌；高滲愈傷增殖培養(yǎng)基為添加0. ro. 5M蔗糖的M13基本培養(yǎng)基； (4)把洗滌后的胚性材料迅速轉(zhuǎn)移到墊有濾紙的高滲愈傷增殖培養(yǎng)基，25°C，培養(yǎng)I 6d ； (5)轉(zhuǎn)胚性材料至低滲愈傷增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)f6d，長出新的愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到愈傷增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；低滲愈傷增殖培養(yǎng)基為添加0. ro. 4M蔗糖的M13基本培養(yǎng)基； (6)轉(zhuǎn)移長有新的愈傷組織的胚性材料至體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至高頻體細(xì)胞胚胎發(fā)生即可。
2.據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于步驟(I)中，培養(yǎng)6 8d。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于步驟(I)中，在所述的高滲液體培養(yǎng)基中還加有f5mg/L ABA和5(T200mg/L脯氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于步驟(2)中，所述的放置脫水，為先用60% PVS2保護(hù)胚性材料過渡脫水(TlOmin，然后轉(zhuǎn)到100% PVS脫水(TeOmin，然后再投入液氮保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于步驟(3)中，37 °C水浴。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于步驟(3)中，高滲愈傷增殖培養(yǎng)基為添加0. 6mol/L山梨醇的M13基本培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于步驟(4)中，蔗糖濃度為0. 4M，培養(yǎng)2d。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于步驟(5)中，蔗糖濃度為0. 3M，培養(yǎng)5d。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，其特征在于步驟(6)中，培養(yǎng)3個月，就可以實現(xiàn)高頻體細(xì)胞胚胎發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胚性材料的超低溫冷凍保存復(fù)蘇方法，包括取待保存的胚性材料接種入高滲液體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3~10d；過濾胚性材料裝入冷凍管，加入復(fù)合玻璃化保護(hù)劑，0℃脫水0～70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存；取保存的材料依次經(jīng)過洗滌、高滲培養(yǎng)、低滲培養(yǎng)、常規(guī)培養(yǎng)即可復(fù)蘇。本發(fā)明的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，操作簡單，方便可行，解決了林木體胚產(chǎn)業(yè)化的重要瓶頸問題，可實現(xiàn)胚性材料長期保存到1年以上，并能使其保持高頻增殖能力，具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效應(yīng)。
文檔編號C12N5/04GK102640745SQ20121013512
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者施季森, 陳金慧, 龍偉 申請人:南京林業(yè)大學(xué)