專利名稱：Isg15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及羊的分子標記輔助選擇技術領域，尤其是一種ISG15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記及其應用。
背景技術：
疾病是影響畜禽生產效益的重要因素之一。現代化工業化的飼養方式不僅損害動物福利，使動物對疾病的易感性增加；同時也因人類與家畜的密切接觸，增加了人畜共患病互感的可能性；而畜禽及產品的全球貿易流通以及交通的快速暢達，更增大了人畜共患傳染病的流行頻率，擴大了傳染范圍。雖然生物制品和抗生素的應用能在一定程度上緩解動物疫情，但疫苗和藥物的使用只能預防、控制疾病而不能根除疾病，解決這一問題的根本途徑是培育高抗病力的畜禽品種。 干擾素刺激基因15 (IFN-stimulated gene 15，ISG15)是目前首個發現的類泛素蛋白，干擾素刺激及病毒感染均可以強烈誘導其表達。干擾素結合細胞膜受體，借助JAK-STAT信號通路激活ISG15的表達，進而編碼抗病毒蛋白，達到抗病毒特性。ISG15及其對蛋白質的共價修飾可有效刺激細胞增殖和NK細胞成熟，產生IFN- Y蛋白，激活嗜中性粒細胞，促進樹狀細胞成熟，增強細胞抗病毒作用，因而在干擾素調控的過程中發揮著重要作用。研究發現ISG15具有廣譜抗病毒作用，其對I型人體免疫缺陷病毒、A/rffSN型流感病毒、B/Lee型流感病毒、I-型單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒、日本腦炎病毒、呼吸道合胞病毒、痘苗病毒、重組Sindbis病毒、丙型肝炎病毒、Ebola VP40病毒、牛病毒性腹灣病毒都具有抗病毒作用。同時，ISG15在細菌感染、獲得性免疫方面也具有重要的作用。作為我國特有的寶貴綿羊品種資源，湖羊集性成熟早，早期生長快、繁殖力強、四季發情、泌乳性能好，及終年舍詞、抗病力強等多種優異特性于一體。此外，湖羊具有的極強環境適應能力，在炎熱潮濕的江南和干寒沙漠的西北，都能保持生長速度快、繁殖率高、抗病能力強等優良特性，因此，申請人開展了羊ISG15基因序列的克隆、SNP篩查與檢測及其與羊疾病抗性的關聯分析。

發明內容
本發明的目的正是要解決上述技術存在的不足，而提供一種ISG15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記及其應用，作為羊標記輔助選擇的、與羊疾病抗性相關的分子標記的克隆及應用，本發明的分子標記與ISG15基因有關。本發明目的在于克隆與羊疾病抗性相關的分子標記，利用該分子標記作為羊標記輔助育種的應用。本發明解決其技術問題采用的技術方案這種ISG15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : I所不,在序列表SEQ ID N0:1的第235bp處有一個A235-C235的堿基顛換。
更進一步的，克隆羊ISG15基因的引物對的DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ IDNO 3所示。所述的分子標記在羊分子標記輔助育種中的應用。所述的引物對在羊分子標記輔助育種中的應用。本發明所述的一種制備上述分子標記和檢測上述分子標記的方法，該方法的步驟如下用羊ISG15基因設計引物，擴增得到目的片段；從羊外周血中提取基因組DNA，以羊ISG15基因DNA序列為模板設計引物，PCR擴增，PCR產物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，應用PCR-SSCP方法檢測羊ISG15基因的多態性，并初步進行了其基因型與羊疾病抗性之間的關聯分析的應用，為羊的分子標記輔助選擇提供了一個新的分子標記。 本發明有益的效果是在湖羊群體中發現野生純合型AA、突變雜合型AC和突變純合型CC這3種基因型。本發明還公開了擴增ISG15基因部分內含子區所用的引物以及用于分子標記的檢測方法。本發明為羊的標記輔助選擇提供了 I個新的分子標記。克隆與羊疾病抗性相關的分子標記，利用該分子標記作為羊標記輔助育種的應用。


圖I :是本發明的技術流程圖。圖2 :是本發明中羊ISG15基因擴增序列的電泳圖譜，片段大小為313bp (瓊脂糖膠濃度為I. 5%)。圖中M為DNA分子量標記(DL2000plus)。圖3 :湖羊ISG15基因突變純合型BB基因型個體序列的與牛全基因組數據庫BLAST比對結果。圖4:是本發明中羊ISG15基因突變純合型個體測序發現在序列表SEQ ID NO 1的235bp處有一個A235-C235的堿基顛換。圖5 :是本發明中羊ISG15基因PCR-SSCP的3種帶型(AA、AB和BB對應序列表SEQID NO: I的235bp處AA、AC和CC這3種基因型。)
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明序列表SEQ ID NO: I是本發明克隆及用于PCR-SSCP檢測的羊疾病抗性相關基因I SG 15基因的DNA序列。序列表SEQ ID NO: 2是本發明中用于克隆及PCR-SSCP檢測羊疾病抗性相關基因ISG15基因DNA突變的PCR-SSCP上游引物。序列表SEQ ID NO: 3是本發明中用于克隆及PCR-SSCP檢測羊疾病抗性相關基因ISG15基因DNA突變的PCR-SSCP下游引物。圖 3 的說明Bos taurus breed Hereford chromosome 16genomicscaffold, Bos_taurus_UMD_3. I,whole genome shotgun sequenceLength=1662458權利要求
1.一種ISG15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記，其特征在于其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在序列表SEQ ID NO 1的第235bp處有一個A235-C235的堿基顛換。
2.根據權利要求I所述的ISG15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記，其特征在于擴增所述分子標記的引物對，其DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
3.根據權利要求I所述的ISG15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記，其特征在于所述的分子標記在羊分子標記輔助育種中的應用。
4.根據權利要求2所述的ISG15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記，其特征在于所述的引物對在羊分子標記輔助育種中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種ISG15基因作為羊疾病抗性相關的分子標記及其應用，從羊ISG15基因中克隆獲得一種作為分子標記應用的與羊疾病抗性相關的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，該基因在SEQ ID NO1的處有一個A235-C235的堿基顛換。本發明有益的效果在湖羊群體中發現野生純合型AA、突變雜合型AC和突變純合型CC這3種基因型。本發明還公開了擴增ISG15基因部分內含子區所用的引物以及用于分子標記的檢測方法。本發明為羊的標記輔助選擇提供了1個新的分子標記。
文檔編號C12N15/11GK102776180SQ20121017681
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者吳建良, 周衛東, 姜俊芳, 宋雪梅, 蔣永清, 鄭會超, 黃新 申請人:浙江省農業科學院