專利名稱：一種提高第10家族木聚糖酶最適溫度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及第10家族木聚糖酶改造及突變酶的高效表達(dá)方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人口的不斷增長(zhǎng)和資源的進(jìn)ー步消耗，可再生資源的開發(fā)利用已經(jīng)成為全世界共同關(guān)注的問(wèn)題。木聚糖是半纖維素的重要組分，在植物細(xì)胞壁中的含量?jī)H次于纖維素，約占細(xì)胞干重的三分之一左右。木聚糖是ー種雜合多聚分子，主鏈由多個(gè)吡喃木糖基通過(guò)木糖苷鍵相連。根據(jù)糖苷鍵的類型可將木聚糖可分為兩種，即β-1，4-木聚糖和β-1，3-木聚糖。前者存在于陸生植物細(xì)胞壁中，而后者主要存在于海洋藻類的細(xì)胞壁中。根據(jù)菌株來(lái)源的不同，木聚糖的側(cè)鏈可以被多種取代基取代。
木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的ー類酶的總稱。狹義上木聚糖酶特指 β-I，4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，EC 3· 2· I. 8)。β-I，4-內(nèi)切木聚糖酶可以從主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，是木聚糖降解過(guò)程中最重要的酶之一。目前所克隆的木聚糖酶大多屬于F/10和G/11家族，第10家族木聚糖酶與第11家族相比具有底物特異性低、水解速度快、水解產(chǎn)物聚合度低，具有較大大多研究和應(yīng)用價(jià)值。由于目前所克隆到的木聚糖酶大多具有熱穩(wěn)定性低的特點(diǎn)，較難滿足エ業(yè)上的應(yīng)用需求，因此尋找有效途徑和手段，提高木聚糖酶在高溫環(huán)境中的穩(wěn)定性及催化活性已成為國(guó)內(nèi)木聚糖酶エ業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種第10家族木聚糖酶Aus XynlOA熱穩(wěn)定性改造及重組突變酶的高效表達(dá)和純化方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種提高第10家族木聚糖酶最適溫度的方法，其特征在于，依據(jù)Aus XynlOA(源于Aspergillus usamii E001)與耐熱木聚糖酶(源于Thermotogamaritima)蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果,運(yùn)用基因工程的方法將耐熱酶的C末端序列融合到AusXynIOA的C末端。獲得的突變酶命名為Aus XynIOA’，其對(duì)應(yīng)的基因和蛋白質(zhì)序列分別為SEQID NO :1和SEQ IDNO :2。所述的木聚糖酶的活性測(cè)定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質(zhì)量濃度為O. 5%的樺木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C預(yù)熱IOmin,在A管中加入O. ImL適當(dāng)稀釋的酶液，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)15min;立即各加入2. 5mL 3'，5' - ニ硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補(bǔ)加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖(以木糖計(jì))含量井折算成酶活性単位。酶活性単位定義在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生I μ mo I還原糖所需的酶量定義為I個(gè)木聚糖酶活性單位(IU)。
所述突變酶的構(gòu)建和表達(dá)方法(I)突變酶的構(gòu)建依據(jù)Aus XynlOA與來(lái)源于Thermotoga maritima的耐熱木聚糖酶蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果選擇KEVLEKKIEER(SEQ ID NO 3)作為擬替換序列，并依此設(shè)計(jì)兩條突變引物XynCHRl和XynCHR2。XynCHRl 5' -TTCTTCAATCTTCTTTTCCAGAACTTCCTTGATAGCAGTGTATGCAG-3'XynCHR2 5' -GCGGCCGCCTATCTTTCTTCAATCTTCTTTTCC-3'提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynlOA)，依此為模板使用Aus XynlOA 基因的成熟肽引物 XynlOA-Fl (5' -GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3')和引物XynCHRl進(jìn)行第一輪PCR，其后依第一輪PCR產(chǎn)物為模板，使用引物XynlOA-Fl和引物XynCHR2進(jìn)行第二輪PCR。將兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T載體連接(pUCm-T-Aus xynlOA’)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生エ測(cè)序，得到突變酶的成熟肽基因序列。 (2)含編碼Aus XynlOA’成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建使用EcoR I和Not I對(duì)割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Aus xynlOA’(圖I)，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。(3)GS115/Aus xynlOA’重組子的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Sal I對(duì)pPIC9K-Aus xynlOA’進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AuS xynlOA’ ；按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測(cè)定重組木聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的目的是提供ー種第10家族木聚糖酶Aus XynlOA改造及重組突變酶的高效表達(dá)和純化方法。依據(jù)Aus XynlOA與來(lái)源于Thermotoga maritima的耐熱木聚糖酶蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果，運(yùn)用基因工程的方法將耐熱酶的C末端序列融合到Aus XynlOA的C末端。獲得的突變酶命名為Aus XynlOA’。Aus XynlOA’較原酶最適溫度有了一定幅度的調(diào)高，具有一定的エ業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖I :重組質(zhì)粒 pPIC9K_Aus xynlOA’ 不意圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I突變酶的構(gòu)建提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynlOA)，依此為模板使用AusXynlOA 基因的成熟肽引物 XynlOA-Fl (5 ' -GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3 ')和引物XynCHRl 進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 5min ;2 個(gè)循環(huán)，94°C 30s，45°C 30s，72°C 70s ；28 個(gè)循環(huán) 94°C 30s，55°C 30s，72°C 70s ；72°C IOmin ;10°C保存；其后依第一輪 PCR產(chǎn)物為模板，使用引物XynlOA-Fl和引物XynCHR2進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 5min ;2個(gè)循環(huán)，94で 30s, 450C 30s, 72°C 70s ；28 個(gè)循環(huán) 94で 30s, 55°C 30s, 72°C 70s ；72°C IOmin ；10°C保存。將兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-Τ載體連接(pUCm-T-Aus xynlOA’)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生エ測(cè)序，得到突變酶的成熟妝基因序列。實(shí)施例2含編碼Aus XynlOA’成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建使用EcoR I和Not I對(duì)割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，酶切時(shí)間為4h，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下連接過(guò)夜(> 12h)，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-AusxynlOA’(圖I),并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。實(shí)施例3GS115/Aus xynlOA’的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Sal I對(duì)pPIC9K-Aus xynlOA’進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AUS xynlOA’。該工程菌用0. 5%甲醇誘導(dǎo) 72h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達(dá)24IU/mL。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮,再經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和S印hadex G-75凝膠過(guò)濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帯，并顯示重組木聚糖酶分子量為42kDa。該重組木聚糖酶最適作用溫度50°C，較原酶提高了 5°C。
權(quán)利要求
1.ー種改造后的源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、歸屬于糖苷水解酶第10家族的木聚糖酶基因Aus xynlOA’，其對(duì)應(yīng)的基因和蛋白質(zhì)序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2o
2.突變酶的構(gòu)建方法 依據(jù)Aus XynlOA與來(lái)源于Thermotoga maritima的耐熱木聚糖酶蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果選擇KEVLEKKIEER(SEQ ID NO 3)作為擬替換序列，并依此設(shè)計(jì)兩條突變引物XynCHRl和XynCHR2 XynCHRl 5' -TTCTTCAATCTTCTTTTCCAGAACTTCCTTGATAGCAGTGTATGCAG-3'XynCHR2 5' -GCGGCCGCCTATCTTTCTTCAATCTTCTTTTCC-3' 提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynlOA)，依此為模板使用AusXynlOA 基因的成熟肽引物 XynlOA-Fl (5 ' -GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3 ')和引物XynCHRl進(jìn)行第一輪PCR，其后依第一輪PCR產(chǎn)物為模板，使用引物XynlOA-Fl和引物XynCHR2進(jìn)行第二輪PCR ;將兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T載體連接(pUCm-T-Aus xynlOA’)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生エ測(cè)序，得到突變酶的成熟肽基因序列。
3.Aus XynlOA’表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及純化 使用EcoR I和Not I對(duì)割膠回收的目的基因與PPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Aus xynlOA’，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定； 用Sal I對(duì)pPIC9K-Aus xynlOA’進(jìn)行線性化,按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)■進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AUS xynlOA’ ；按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測(cè)定重組木聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層祈，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種第10家族木聚糖酶Aus Xyn10A熱穩(wěn)定性改造及重組突變酶的高效表達(dá)和純化方法。依據(jù)Aus Xyn10A(源于Aspergillus usamii E001)與耐熱木聚糖酶(源于Thermotoga maritima)蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果，運(yùn)用基因工程的方法將耐熱酶的C末端序列融合到Aus Xyn10A的C末端。獲得的突變酶命名為Aus Xyn10A’。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變后該酶的最適溫度有了明顯的提高，作為一種耐熱型的酶制劑，該木聚糖酶具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102690832SQ20121018144
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者李劍芳, 汪俊卿, 鄔敏辰 申請(qǐng)人:江南大學(xué)