具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株及其建立方法
【專利摘要】本發明將E1B-19K基因和BS-BV基因分別插入到pBudCE4.1載體的EF-1α啟動子和CMV啟動子下游，構建同時、獨立組成型表達E1B-19K和BS-BirA-VP4的載體pBud-E1B-BS-BV。將p27Kip1片段連入生物素誘導表達系統BS-Biotin-On的響應載體中，構建響應于生物素的p27Kip1誘導表達載體pc-Hy-4BSOB-minp27。將上述兩載體共轉染HEK293細胞，通過有限稀釋法進行單克隆化，獲得具有改良性狀的HEK293細胞株18-HEP。
【專利說明】具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株及其建立方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于細胞工程【技術領域】，涉及一種經多基因代謝工程改造的HEK293細胞株。具體地說，它是一種通過組成型過表達腺病毒抗凋亡基因E1B-19K和誘導表達人細胞周期控制基因p27Kip1，具有改善了體外培養和重組蛋白生產特性的HEK293細胞株及其建立方法。
【背景技術】
[0002]哺乳動物細胞可進行復雜的翻譯后修飾、保持重組蛋白的生物學活性，是目前生物制藥產業最廣泛采用的表達系統。但是，哺乳動物細胞表達系統的缺點也很明顯，主要表現在:細胞生長速率較慢、最終細胞密度較低、蛋白表達水平較低以及細胞凋亡的普遍存在等，在一定程度上影響了它的廣泛應用。
[0003]近年來，隨著對細胞代謝途徑和調控機理的深入研究，越來越多的細胞工程研究者開始利用代謝工程的方法對細胞自身的遺傳特性進行有目的的修飾，對細胞的性狀進行改良，使其適應能力更強，具備在體外培養條件下的自身調節能力，從而適應生物制藥產業大規模培養的要求。目前，動物細胞的代謝工程已應用于增強細胞抗凋亡能力、控制細胞增殖速率、改變細胞的能量代謝途徑、改善重組蛋白的糖基化等方面。其中，針對細胞抗凋亡能力和增殖控制兩方面性狀的改良應用最為廣泛、成效最為顯著。
[0004]用于提高工程細胞抗凋亡特性的基因主要是bcl-2家族的成員(bcl-2和bcl-xL)及其病毒同源基因(BHRF-l、KSBcl-2和E1B-19K等)，已在雜交瘤、BHK、CHO和COS細胞等多種工程細胞系中顯示了顯著 的抗凋亡作用。其中，E1B-19K是來源于腺病毒的抗凋亡基因，其作用機制可能是通過與促凋亡蛋白Bax相互作用，以及結合Bak蛋白并抑制其加速凋亡進程的功能。在NSO、CHO和BHK細胞中過表達E1B-19K顯示了有效降低細胞凋亡、延長培養時間的作用，在某些研究中還觀察到了重組蛋白產率的提高。對于HEK293細胞的抗凋亡改造，目前只有一篇文獻報道，采用人X-連鎖的凋亡蛋白抑制因子(XIAP)、來自牛痘病毒的細胞因子響應修飾蛋白(CrmA)及二者的突變體分別轉染HEK293細胞，在不同凋亡誘導條件下的考察結果表明，四者均使細胞活力顯著提高，其保護效果對不同的誘導因素具有一定的特異性。
[0005]在生物反應器中細胞密度達到理想值時，借助分子生物學手段來控制細胞增殖，以提高重組蛋白產率和減少因細胞過度增殖所致的細胞凋亡是提高重組蛋白產量和質量的有效途徑。周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)在細胞周期進展的調控中發揮極其重要的作用，通過抑制周期蛋白依賴性激酶(CDK)的活性而誘導生長阻滯。其中的p21Cipl和p27Kipl是目前關于細胞增殖控制的代謝工程中應用最多的兩種CKI。共表達SEAP和p21Cipl的瞬時轉染CHO細胞系表現出明顯的生長阻滯和產量提高5倍，而穩定轉染細胞未觀察到產量增加。Fussenegger等通過與分化因子CAATT/增強子結合蛋白α (C/ΕΒΡα，起到誘導和穩定p21Cipl的作用)和抗凋亡蛋白bcl-xL共表達，成功構建了 p21Cipl上調的CHO細胞系，SEAP產量提高了 10-15倍，而p27Kipl與C/EBPa和Bcl-xL同時過表達使SEAP表達提高30倍。
[0006]細胞增殖控制基因的表達需要進行嚴格的調控，因此控制增殖技術的一個關鍵問題就是外源基因表達調控系統的選擇。目前已較成熟的一些基因調控系統，如四環素、IPTG、蛻皮激素等響應的調控系統已應用在增殖控制中。但是，在制藥工業中，使用具有生理活性的小分子誘導劑仍是不允許的，這就限制了增殖控制技術在中試規模的應用。本發明利用中國發明專利201110228457.4建立的一種基于枯草芽孢桿菌生物素連接酶的生物素誘導表達系統進行細胞周期控制基因的誘導表達，該系統采用的誘導劑生物素是獲批用于生物制藥工業的細胞培養基的基本組分之一，絕對無毒，價格低廉，并且未觀察到生物素的存在與否對細胞生長和產物表達具有明顯影響。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種經多基因代謝工程改造的HEK293細胞株18-HEP。具體地說是一種通過組成型過表達E1B-19K和誘導表達p27Kipl而具有抗凋亡和增殖調控特性的HEK293細胞株。
[0008]本發明的另一個目的是提供用于上述HEK293細胞株多基因代謝工程改造的E1B-19K基因和p27Kipl基因的序列，其具有序列表中SEQ N0.1和SEQ N0.2所述的序列。
[0009]本發明的再一目的是提供一種上述多基因代謝工程改造的HEK293細胞株的建立方法。
[0010]為實現上述目的，本發明的發明思路為:
[0011]將重疊PCR獲得的E1B-19K基因和生物素誘導表達系統BS-BiOtin-On的調控蛋白BS-BV基因分別插入到pBudCE4.1載體的EF-1 α啟動子和CMV啟動子下游，構建同時、獨立組成型表達Ε1Β-19Κ和BS-BirA-VP4的載體pBud-EIB-BS-BV。
[0012]將克隆自商業化載 體PCMV-SP0RT6-P27載體的p27Kipl片段，連入生物素誘導表達系統BS-Biotin-On的響應載體中，構建響應于生物素的p27Kipl誘導表達載體pc-Hy-4BS0B-minp27。
[0013]將上述兩載體共轉染HEK293細胞，通過有限稀釋法進行單克隆化，考察細胞株的抗凋亡特性和細胞增殖特性，獲得具有改良性狀的HEK293細胞株18-HEP。此后進一步利用該細胞株進行rhTNFR的生產，考察對于重組蛋白表達方面的改善。
[0014]依據上述思路，本發明采用如下技術方案:
[0015]一種具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株，所述細胞株是在HEK293細胞中組成型過表達腺病毒抗凋亡基因E1B-19K，所述腺病毒抗凋亡基因E1B-19K的序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，該細胞株18-HEP已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年5月31日，保藏編號為CGMCC N0.6176，其分類命名為HEK293細胞。
[0016]如上所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株，所述細胞株還在HEK293細胞株中誘導表達人細胞周期控制基因p27Kip1，使該細胞在誘導表達條件下發生增殖阻滯，細胞生長顯著變慢，所述人細胞周期控制基因p27Kipl的序列如序列表中SEQ ID N0.2所
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[0017]如上所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株，所述誘導表達基因p27Kip1，是采用基于枯草芽孢桿菌生物素連接酶、響應于生物素的誘導表達系統。
[0018]如上所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株的建立方法，其步驟如下:
[0019]a.E1B-19K和BS-BV組成型共表達載體的構建:
[0020]利用序列如SEQ ID N0.3-16所示的引物，通過重疊PCR獲得E1B-19K基因，其序列如SEQ ID N0.1所示；經Not I/Mlu I酶切后，連入同樣經Not I/Mlu I酶切的pBudCE4.1載體的EF-1 α啟動子下游；用Afl I I/Not I從pc-BS-BV載體上酶切獲得BS-BV基因，補平，連入經Afl II/EcoR I酶切并補平的pBud-ElB載體CMV啟動子下游，得到同時組成型獨立表達E1B-19K基因和BS-BV基因的載體，命名為pBud-EIB-BS-BV ；
[0021]b.響應于生物素的p27Kipl誘導表達載體的構建:
[0022]利用SEQ ID N0.17及SEQ ID N0.18所示引物從商業化載體pCMV_SP0RT6_p27上擴增得到p27KiplcDNA片段，Nhe I/BamH I酶切，連入同樣酶切的pc-Hy-4BS0B_minCMV載體，得到響應于生物素的p27Kipl誘導表達載體pc-Hy-4BS0B-minp27 ；
[0023]c.細胞轉染及篩選:
[0024]將上述兩載體p Bud-EIB-BS-BV 和 pc-Hy-4BS0B_minp27 共轉染 HEK293 細胞，經200 μ g/mL Zeocin和400 μ g/mL G418篩選兩周，得到陽性混合克隆細胞。將上述混合克隆通過有限稀釋法進行單克隆化，按3cells/孔接種于96孔細胞培養板中，置于37°C，5%C02培養，約兩周后，將單克隆孔消化傳代，擴大培養，用于后續實驗。
[0025]一種用于建立如上所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株的表達載體pBud-ElB-BS-BV，其序列如序列表中SEQ ID N0.19所示。
[0026]一種用于建立如上所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株的表達載體pc-Hy-4BS0B_minp27,其序列如序列表中SEQ ID N0.20所不。
[0027]一組用于建立如上所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株的重疊PCR引物，所述引物的序列分別如SEQ ID N0.3-16所示。
[0028]如上所述的一組重疊PCR引物，其中，序列如SEQ ID N0.3和N0.4所示的引物、如SEQ ID N0.5和N0.6所示的引物、如SEQ ID N0.7和N0.8所示的引物、如SEQ ID N0.9和N0.10所示的引物、如SEQ ID N0.11和N0.12所示的引物、如SEQ ID N0.13和N0.14所示的引物、如SEQ ID N0.15和N0.16所示的引物，分別構成引物對。
[0029]如上所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株在重組蛋白生產方面的應用。
[0030]本發明的優點是:
[0031](I)本發明提供的HEK293細胞株在凋亡誘導培養條件下的細胞凋亡顯著降低，同時可進行可調控的細胞增殖阻滯，通過降低凋亡和增殖控制的雙重作用達到改善細胞體外培養性狀和增加重組蛋白產量的目的。
[0032](2)在無血清懸浮培養中以該細胞株為表達系統生產重組蛋白rhTNFR，與空載體轉染的對照細胞相比，使重組蛋白產率提高I倍左右，最終蛋白累積濃度提高約1.1倍。該細胞株具有改良的體外培養和重組蛋白生產特性，在生物制藥產業大規模培養中具有應用前景。
[0033]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為本發明構建得到的E1B-19K與BS-BV組成型共表達載體示意圖。
[0035]圖2為響應于生物素的p27Kipl誘導表達載體示意圖。
[0036]圖3為重疊PCR獲得E1B-19K基因的步驟示意圖。
[0037]圖4為18-HEP及對照細胞在有無誘導劑條件下的細胞生長情況；a為對照細胞生長情況統計圖，b為18-HEP生長情況統計圖。
[0038]圖5為18-HEP及對照細胞在有無誘導劑條件下的Gl期細胞比例情況。
[0039]圖6為18-HEP及對照細胞在廢棄培養基中培養不同時間的細胞凋亡情況。
[0040]圖7為有無誘導劑條件下CT-TF和18-TF細胞的重組蛋白rhTNFR-Fc表達情況；a為rhTNFR-Fc比產率統計圖，b為rhTNFR-Fc總產量統計圖。
【具體實施方式】
[0041]本發明提供了一種具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株18-HEP，該細胞株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年5月31日，保藏編號為CGMCC N0.6176。
[0042]實施例1抗凋亡基因E1B-19K和調控蛋白基因BS-BV組成型共表達載體的構建
[0043](I)重疊 PCR 獲 得 E1B-19K 基因
[0044]本發明采用的腺病毒基因E1B-19K通過重疊PCR得到，使用的引物序列如SEQ IDN0.3-16所示。具體步驟請參見圖3，其中，第一步PCR(圖3中第一行，其中的各數字，即為該步PCR中所用引物在本發明序列表中的編號)體系由各對引物、Pyrobest聚合酶及相應緩沖液和dNTPs組成；除最后一步PCR擴增外，其余步驟均無需進行PCR產物的純化回收，也無需加入引物，只需直接將兩個PCR體系以1:1混合，再補加適量Pyrobest聚合酶和dNTPs即可；最后一步的PCR體系由經過純化的上一步PCR產物、引物SEQ 3/SEQ 16、Pyrobest聚合酶及相應緩沖液和dNTPs組成，擴增后得到5’和3’末端分別含Not I和Mlu I酶切位點的E1B-19K全長序列，其序列如SEQ ID N0.1所示。
[0045]各步PCR 反應條件均為:94°C，5min — (94°C，30s, 58°C，lmin, 72°C，lmin)重復 30個循環一72°C，lOmin。
[0046](2) E1B-19K和BS-BV組成型共表達載體的構建
[0047]將通過上述操作獲得的E1B-19K片段通過Not I/Mlu I酶切位點連入同樣經Not I/Mlu I酶切的pBudCE4.1載體(Invitrogen, USA)的EF-1 α啟動子下游,得到的載體稱為pBud-ElB。利用Afl I I/Not I酶切從pc-BS_BV載體上獲得生物素誘導表達系統的調控蛋白BS-BV基因，補平，連入經Afl II/EcoR I酶切并補平的上述pBud_ElB載體的CMV啟動子下游，得到同時組成型獨立表達E1B-19K基因和BS-BV基因的載體，命名為pBud-ElB-BS-BV，其結構如圖1所示。
[0048]實施例2響應于生物素的細胞周期控制基因P27Kipl誘導表達載體的構建
[0049]從商業化載體pCMV-SP0RT6_p27 (Open Biostystems, USA)上擴增 p27KiplcDNA 片段，所用引物為SEQ ID N0.17:
[0050]5’ -GACGCTAGCATGTCAAACGTGCGAGTGTCTAACG-3’ ；
[0051]及SEQ ID N0.18:[0052]5’ -GCTCTTAAGTTACGTTTGACGTCTTCTGAGG-3’。
[0053]PCR 反應條件為:94°C，5min — (94°C，30s, 58°C，lmin, 72°C，lmin)重復 30 個循環—72°C，10min。Nhe I/BamH I酶切上述片段，連入同樣經Nhe I/BamH I酶切的生物素誘導表達系統響應載體pc-Hy-4BS0B-minCMV的響應啟動子下游，得到響應于生物素的p27Kipl誘導表達載體pc-Hy-4BS0B-minp27,其結構如圖2所示。
[0054]實施例3 HEK293細胞的代謝工程改造
[0055]將載體pBud-EIB-BS-BV 和 pc-Hy-4BS0B_minp27 共轉染 HEK293 細胞，經 200 μ g/mL Zeocin和400 μ g/mL G418篩選兩周，得到陽性混合克隆細胞。該混合克隆細胞通過有限稀釋法進行單克隆化，按3cells/孔接種于96孔細胞培養板中，置于37°C，5%C02培養，約兩周后，將單克隆孔消化傳代，擴大培養，用于后續實驗。
[0056]實施例4單克隆細胞株18-HEP體外培養性狀的考察
[0057](I)有無誘導劑存在下細胞生長情況的考察
[0058]單克隆化得到的單克隆細胞株18-HEP與空載體轉染的對照細胞，以2X104cells/mL接種于24孔 培養板，2天后每種細胞的一半更換為含200 μ mo I/L生物素的培養基，此后每天取樣計數活細胞密度和細胞活力，統計結果如圖4所示。結果可見，在誘導劑存在時，18-HEP細胞出現了明顯的生長變慢的現象，培養過程中的細胞活力顯著高于對照組，細胞生長衰退期延遲2天出現。在培養第6天取樣，檢測各組樣品的細胞周期分布情況，統計結果請參見圖5。結果顯示，在誘導劑存在下，18-HEP細胞Gl期比例顯著升高，由47.88%提高至66.92%。以上結果表明，18-HEP細胞在誘導劑存在時，可令細胞阻滯在Gl期而使細胞增殖速度顯著降低。
[0059](2)廢棄培養基的制備
[0060]將野生型HEK293細胞用含5%NBS (無生物素)的DF (無生物素)培養基重懸，以5X104cells/mL的密度接種于25cm2的細胞培養瓶中，8mL/瓶，始終不換液，培養7天后細胞長至匯合，將培養上清吸至離心管中，5000rpm離心5min以除去懸浮的細胞及細胞碎片，將上清收集至一個容器中，用7.5%NaHC03調節pH至7.2左右，置4°C保存備用。
[0061](3)細胞凋亡情況的考察
[0062]對照細胞和18-HEP細胞分別以5X 104cellS/mL的密度接種于24孔細胞培養板，待細胞貼壁后更換為上述廢棄培養基，繼續培養24h、72h和96h分別取樣檢測細胞凋亡情況，統計結果如圖6所示。結果顯示,與對照相比，18-HEP細胞在誘導不同時間細胞凋亡均顯著減少，使凋亡細胞比例降低47-54%，表明18-HEP細胞具有比對照細胞增強的抗凋亡能力。
[0063]實施例5 18-HEP細胞株重組蛋白表達效果的考察
[0064]Nhe I/Not I酶切pc-TNFR-Fc-FRT載體獲得rhTNFR-Fc片段，連入同樣酶切的pcDNA3.1(+)載體，得到rhTNFR-Fc的組成型表達載體pc_TNFR_Fc。
[0065]pc-TNFR-Fc載體分別轉染對照細胞和18-HEP細胞，經篩選得到的混合克隆分別稱為CT-TF和18-TF，上述混合克隆細胞分別接種于IOOmL搖瓶，接種密度為2 X IO5ceIls/mL,接種體積35mL，每種4瓶。4天后向每種細胞中的2瓶添加200 μ mo I/L生物素，繼續培養。于不同時間點取樣，檢測細胞生長情況、上清中的代謝指標和TNFR-Fc蛋白含量。非誘導條件下的18-TF細胞的rhTNFR-Fc比產率與對照細胞CT-TF無顯著差異，而誘導增殖阻滯狀態下的18-TF比產率升高I倍；非誘導條件下培養的18-TF在培養8天后的rhTNFR-Fc累積產量比CT-TF對照高56.8%，誘導條件下的rhTNFR-Fc累積產量進一步提高，比非誘導條件下的18-TF細胞高36.4%，比對照細胞CT-TF高1.1倍，統計結果如圖7所示。結果表明，與對照細胞相比，18-H EP細胞重組蛋白生產效率顯著提高。
【權利要求】
1.一種具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株，其特征在于，所述細胞株是在HEK293細胞中組成型過表達腺病毒抗凋亡基因E1B-19K，所述腺病毒抗凋亡基因E1B-19K的序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，該細胞株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年5月31日，保藏編號為CGMCC N0.6176。
2.如權利要求1所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株，其特征在于，所述細胞株還在HEK293細胞株中誘導表達人細胞周期控制基因p27Kip1，使該細胞在誘導表達條件下發生增殖阻滯，細胞生長顯著變慢，所述人細胞周期控制基因P27Kipl的序列如序列表中 SEQ ID N0.2 所示。
3.如權利要求2所述的具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株，其特征在于，所述誘導表達基因p27Kip1，是采用基于枯草芽孢桿菌生物素連接酶、響應于生物素的誘導表達系統。
4.權利要求1-3中任意一項所述具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株的建立方法，其特征在于，所述方法步驟如下: a.E1B-19K和BS-BV組成型共表達載體的構建: 利用序列如SEQ ID N0.3-16所示的引物，通過重疊PCR獲得E1B-19K基因，其序列如SEQ ID N0.1所示j5Not I/Mlu I酶切后，連入同樣經Not I/Mlu I酶切的pBudCE4.1載體的EF-1a啟動子下游；用Afl I I/Not I從pc-BS-BV載體上酶切獲得BS-BV基因，補平，連入經Afl II/EcoR I酶切并補平的pBud-ElB載體CMV啟動子下游，得到同時組成型獨立表達E1B-19K基因和BS-BV基因的載體，命名為pBud-EIB-BS-BV ； b.響應于生物素的p27Kipl誘導表達載體的構建:` 利用SEQ ID N0.17及SEQ ID N0.18所示引物從商業化載體pCMV_SP0RT6_p27上擴增得到p27KiplcDNA片段，Nhe I/BamH I酶切，連入同樣酶切的pc-Hy-4BS0B_minCMV載體，得到響應于生物素的p27Kipl誘導表達載體pc-Hy-4BS0B-minp27 ； c.細胞轉染及篩選: 將上述兩載體pBud-EIB-BS-BV和pc-Hy-4BS0B_minp27共轉染HEK293細胞，經200 μ g/mL Zeocin和400μ g/mL G418篩選兩周，得到陽性混合克隆細胞。將上述混合克隆通過有限稀釋法進行單克隆化，按3cells/孔接種于96孔細胞培養板中，置于37°C，5%C02培養，約兩周后，將單克隆孔消化傳代，擴大培養，用于后續實驗。
5.一種用于建立權利要求1-3中任意一項所述具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株的表達載體pBud-ElB-BS-BV，其特征在于，其序列如序列表中SEQ ID N0.19所示。
6.一種用于建立權利要求1-3中任意一項所述具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株的表達載體pc-Hy-4BS0B-minp27,其特征在于,其序列如序列表中SEQ ID N0.20所示。
7.—組用于建立權利要求1-3中任意一項所述具有抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株的重疊PCR引物，其特征在于，所述引物的序列分別如SEQ ID N0.3-16所示。
8.如權利要求7所述的一組重疊PCR引物，其特征在于，序列如SEQID N0.3和N0.4所示的引物、如SEQ ID N0.5和N0.6所示的引物、如SEQ ID N0.7和N0.8所示的引物、如SEQ ID N0.9和N0.10所示的引物、如SEQ ID N0.11和N0.12所示的引物、如SEQ ID N0.13和N0.14所示的引物、如SEQ ID N0.15和N0.16所示的引物，分別構成引物對。
9.權利要求1-3中任意一項所述的具有 抗凋亡和細胞增殖調控特性的細胞株在重組蛋白生產方面的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103451154SQ201210182003
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優先權日:2012年6月4日
【發明者】葉玲玲, 陳昭烈, 李世崇, 劉紅, 王啟偉, 楊振西 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所