專利名稱：一種生物反應器大規模培養的方法
技術領域：
本發明屬于獸醫生物技術領域，更具體涉及ー種重組H5N1禽流感病毒5代以內快速適應MDCK細胞培養的方法，適應病毒株在生物反應器大規模培養。
背景技術：
H5N1 高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HP-AIV)在世界范圍內廣泛存在，不僅可以感染禽類，而且可以跨越種間屏障感染多種哺乳動物，尤其是可以直接感染人，并導致死亡，嚴重的危害了養禽業和人類的健康，因此禽流感的防制是非常重要的。全群撲殺和生物安全防護是及時撲滅和控制高致病性禽流感(HPAI)的主要措施，而疫苗接種是防控禽流感最有效和最經濟的方法。過去50年來，一直通過雞胚培養生產流感疫苗。由于流感疫苗的生產需要使用大量雞胚，且生產周期長，易污染，不易于控制，生產效率較低。自從1996年以來，哺乳動物細胞已經發展到能夠自由擴大培養并且用于エ業化生產，而禽流感疫苗也可以通過動物細胞大規模培養制備。生物反應器能夠有效地增加單位體積細胞培養的密度，從而為病毒性疫苗大規模生產奠定堅實的基礎。目前我國禽流感H5N1商品疫苗主要是通過流感病毒反向遺傳學操作技術構建的重組疫苗株。但是以MDCK細胞增殖重組H5N1禽流感疫苗株存在很多困難1、病毒從雞胚到細胞兩種不同的培養基質轉換需要適應過程；2、因轉瓶培養細胞量的限制，H5N1禽流感病毒HA效價不會高于29，不能滿足疫苗制備的要求；3、重組H5N1禽流感病毒HA自切割位點一般被去除，在病毒的吸附過程中必須更換添加TPCK-胰酶的無血清培養基，其エ藝復雜。因此，研發新的生產エ藝，使H5亞型禽流感病毒快速在MDCK細胞上適應，從方瓶、轉瓶快速放大到操作簡單的固定床籃式攪拌系統生物反應器，大規模生產重組H5亞型禽流感病毒是非常必要的。中國專利號02112013. 7的發明專利說明書公開了ー種利用Fibra-CeTMDisks為載體大規模連續生產病毒疫苗的方法，雖然該エ藝適合于狂犬疫苗、出血熱、こ腦、小兒脊髓灰質炎病毒，但是卻不適合需要傳代適應的流感病毒。中國專利號201010596058. 9的發明專利說明書公開了利用Cytodexl為載體在生物反應器培養MDCK細胞增殖H9N2型禽流感病毒。中國專利號201010159741.6的發明專利說明書公開了生物反應器培養MDCK細胞全懸浮培養エ藝，以及增殖H9N2病毒制備疫苗的エ藝。中國專利號201010282155. O的發明專利說明書公開了利用Cytodexl為載體在生物反應器培養MDCK或者細胞增殖エ業化生產動物流感病毒。以上文獻資料都有不同程度的涉及禽流感病毒的生產エ藝方法。但是，對重組H5N1禽流病毒在MDCK細胞的快速適應以及利用聚酯片為載體在固定床籃式攪拌系統反應器的生產エ藝并未涉及
發明內容
本發明目的是在于提供了ー種生物反應器大規模培養的方法，方法易行，操作簡便，適應后病毒HA效價>27;該病毒從方瓶、轉瓶培養エ藝快速轉換到操作簡單的固定床籃式攪拌系統反應器的大規模培養，其HA效價可以達到211，解決了目前重組H5N1禽流感病毒在MDCK細胞上培養病毒滴度不能滿足疫苗生產的難題。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術方案ー種生物反應器大規模培養的方法(一種重組H5N1型禽流感病毒在MDCK細胞上的快速適應方法和該適應病毒的生物反應器大規模培養エ藝)，其步驟是(I)重組H5N1禽流感病毒在MDCK細胞(見遺傳資源表)上的快速適應，所述的步驟(I)病毒36. 5-37. 5°C吸附I 一 2小時，去除病毒液，病毒稀釋液清洗MDCK細胞2 — 4次后更換細胞維持液，取血凝效價>24且病毒稀釋倍數最高的病毒液或者致細胞最晚產生病變的最高稀釋倍數病毒作為種子病毒繼續適應；病毒在5代以內適應MDCK細胞，且病毒血凝效價>27。
(2)經過步驟(I)適應MDCK細胞內増殖的重組H5亞型禽流感病毒作為反應器大規模培養的種子病毒，所述的步驟(2)種子病毒代次> F6 ;血凝效價> 28 ；EID50 ^ 107 5。所述病毒稀釋液為含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液為含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml 高糖 DMEM。(3)以聚酯片為載體培養MDCK細胞，所述的步驟(3)以聚酯片為載體，反應器為籃式固定床，30-50g/L載體投放量，每克載體投放O. 5-4. 5*107個細胞；完全培養基為含8-10% (體積比)新生牛血清DMEM ;細胞20分鐘內貼壁，此階段攪拌轉速45r/min，DO為60%,溫度為36 — 38°C，pH為7. 0-7. 3，通氣量為O. ISLPM ;細胞培養階段依據細胞耗氧，攪拌轉速控制50-120r/ml，通氣量O. 1-0. 5SLPM，pH7. 2，反應器中糖濃度I. 8-2. 2g/L，調整灌流速度為5-40ml/min;細胞培養50-70小時生長至平臺期，此時平均每200g載體上的細胞糖耗為I. 7-2. 5g/h (具體見附圖I)。(4)上述步驟(3)培養的MDCK細胞接種病毒，所述的步驟(4)反應器培養MDCK細胞接種病毒吋，PBS清洗細胞2 — 4次，病毒稀釋液清洗細胞I 一 2次，病毒接種MOI為O. 01-0. 00001 ;病毒吸附過程中TPCK-胰酶濃度I. 0-1. 5ug/ml，溫度36. 5-37. 5°C，攪拌轉速40-60r/min，D0為60%，pH為7. 6，病毒吸附2小時；病毒培養階段細胞維持和病毒培養溫度為33-35°C，攪拌轉速60-120r/min，通氣量為O. 2-0. 6SLPM, 4-6小時后更換細胞維持液。(5) MDCK細胞維持和病毒増殖，所述的步驟(5)病毒培養階段細胞維持和病毒培養溫度為33-35 °C，攪拌轉速60-120r/min，通氣量為O. 2-0. 6SLPM, 4-6小時后更換細胞維持液；灌流培養速度為10-50ml/min，糖濃度保持2. 0-2. 8g/L。所述病毒稀釋液為含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液為含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM。(6)監測血凝效價收獲病毒，所述的步驟(6)病毒血凝效價最高為211，可以收獲7. 5-9個反應器培養體積病毒液,其中4. 5-5個反應器培養體積病毒液血凝效價大于29 ;另外3-4個反應器培養體積病毒液血凝效價27Λ本發明提供最系統的重組Η5Ν1禽流感病毒的生物反應器大規模培養，該方法從重組Η5Ν1禽流感病毒在細胞適應到反應器規模培養具有以下優點和效果①與傳統的Η5Ν1流感病毒在MDCK細胞上方法相比較，本發明提供以六孔板梯度適應方法操作簡單，工作量??；病毒在5代以內能夠適應MDCK細胞并且穩定的増殖，其HA效價大于27 ;該方法易于標準化，適用于所有的H5亞型流感病毒。②本發明提供的聚酯片為載體，運用固定床生物反應器大規模培養MDCK細胞，增殖H5亞型流感病毒，只需要每克載體投放O. 5-4. 5*107個細胞，細胞增殖增殖快速，接毒エ藝簡單，易于エ業化大規模 操作。③本發明提供的方法病毒效價高、產量大，可以提供4. 5-5個反應器培養體積的病毒液，其血凝效價大于29 ;該病毒免疫原性好，抗體水平維持時間長，在該病毒液制備疫苗免疫SPF雞后14天HI效價即可達到25 5，28天可以達到28 5。第11周時抗體仍在27以上。


圖I為ー種反應器中MDCK細胞耗糖曲線示意圖。為200克片狀載體投放時，MDCK細胞每小時的糖耗曲線表。24_32小時，MDCK細胞糖耗低，并且增長緩慢，表明此階段為細胞生長的延遲期；35 — 58細胞糖耗值劇增，代表細胞進入指數增長期，60-70小時細胞糖耗進入相對穩定，表明細胞生長進入平臺期。圖2為ー種反應器生產重組流感病毒液HA效價變化曲線示意圖。200克片狀載體投放，細胞進入平臺期以O. 001-0. 0001接種重組H5亞型禽流感病毒后，以I %雞紅細胞檢測病毒HA血凝效價變化表明病毒在28小時檢測到HA效價，48小時效價達到最聞211。
具體實施例方式實施例I :重組H5N1禽流感病毒毒株rC4/Wl株快速適應MDCK細胞rC4/Wl株(見遺傳資源表)該病毒是全禽源性H5亞型禽流感病毒，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為=CCTCC NO :V201029，其快速適應MDCK細胞步驟如下I)取I個MDCK細胞長成致密單層的T75細胞瓶，細胞消化后平均鋪入3個6孔細胞培養板。2)將雞胚尿囊液毒液以10倍倍比稀釋至10_6。3)取10-3、10-4、10-5、10-6各稀釋度毒液200111，并用細胞維持液補充至31111，分別加入長滿MDCK細胞單層的6孔板中，每個稀釋濃度做ー個重復，取200ul稀釋液用細胞維持液補充至3ml，加入長滿MDCK細胞單層的作為陰性對照。4)在37°C條件下，病毒吸附I. 5小時后去除病毒液，以病毒稀釋液清洗MDCK細胞3次后，每孔加入細胞維持液3ml，24小時后每6個小時觀測細胞病變，測HA效價，48小時后每3個小時觀測細胞病變，測HA效價，接毒84小時后6孔板于一 80°C凍融一次，均未檢測到HA效價，但是10_3、10_4分別在36-48小時和55 — 65小時出現了典型流感病毒導致脫落型的細胞病變。5)以65小時收獲的Kr4稀釋度病毒為H)代繼續在MDCK細胞上適應培養。6)取FO代病毒重復步驟1、2，取10'10'10'10'按照步驟3、4操作，在48小時10_2接種孔MDCK細胞出現病變，在60小時10_3、10_4稀釋度接種孔出現明顯的病變，測HA效價發現10_3稀釋度效價最高可以達到27_8，其他的稀釋度液均達到26左右(見表I )，以60小時收獲的10_4病毒為Fl代病毒，按照步驟3、4操作繼續在MDCK細胞上適應培養。7)按照上述方法連續傳至F4代，接種10_4、10_5稀釋度病毒的MDCK細胞在36 —52小時出現典型病變，HA效價>27。表I :rC4/Wl株R)_F4代在MDCK細胞適應增殖表
權利要求
1.ー種生物反應器大規模培養的方法，其步驟是 (1)重組H5N1禽流感病毒在MDCK細胞上適應，所述的病毒36.5-37. 5°C吸附I 一 2小吋，去除病毒液，病毒稀釋液清洗MDCK細胞2 — 4次后更換細胞維持液，取血凝效價>24病毒稀釋倍數的病毒液或者致細胞產生病變的稀釋倍數病毒作為種子病毒繼續適應；病毒在5代以內適應MDCK細胞，病毒血凝效價>27 ； (2)步驟I適應病毒株作為反應器大規模培養病毒種子批制備，所述的種子批病毒代次≥F6 ;血凝效價≥28 ；EID50≥107 5，所述病毒稀釋液為含TPCK-胰酶L 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液為含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM ； (3)以聚酯片為載體培養MDCK細胞，所述的以聚酯片為載體，反應器為籃式固定床，30-50g /L載體投放量，每克載體投放O. 5-4. 5*107個細胞；培養基為含8-10%新生牛血清DMEM ;細胞20分鐘內貼壁，階段攪拌轉速45r/min，DO為60%，溫度為36 — 38°C，Ph為.7. 0-7. 3，通氣量為O. ISLPM ;細胞培養階段依據細胞耗氧，攪拌轉速控制50_120r/ml，通氣量O. 1-0. 5 SLPM，Ph7. 2，反應器中糖濃度I. 8-2. 2g/L，調整灌流速度為5_40ml/min ;細胞培養50-70小時生長至平臺期，平均每200g載體上的細胞糖耗為I. 7-2. 5g/h ； (4)步驟3培養的MDCK細胞接種病毒，所述的反應器培養MDCK細胞接種病毒吋，PBS清洗細胞2 — 4次，病毒稀釋液清洗細胞I 一 2次，病毒接種MOI為O. 01-0. 00001 ;病毒吸附過程中TPCK-胰酶濃度I. 0-1. 5ug/ml，溫度36. 5-37. 5°C，攪拌轉速40_60r/min，DO為60%，Ph為7. 6，病毒吸附2小時；病毒培養階段細胞維持和病毒培養溫度為33-35°C，攪拌轉速60-120r/min，通氣量為O. 2-0. 6SLPM, 4-6小時后更換細胞維持液； (5)MDCK細胞維持和病毒増殖，所述的步驟5病毒培養階段細胞維持和病毒培養溫度為33-35°C，攪拌轉速60-120r/min，通氣量為O. 2-0. 6SLPM, 4-6小時后更換細胞維持液；灌流培養速度為10-50ml/min，糖濃度保持2. 0-2. 8g/L，所述病毒稀釋液為含TPCK-胰酶I. 0-1. 5ug/ml的高糖DMEM ;病毒維持液為含TPCK-胰酶O. 5-lug/ml高糖DMEM ； (6)監測血凝效價收獲病毒，所述的病毒血凝效價最高為211，收獲7.5-9個反應器培養體積病毒液，其中4. 5-5個反應器培養體積病毒液血凝效價大于29 ;另外3-4個反應器培養體積病毒液血凝效價27_8。
全文摘要
本發明一種生物反應器大規模培養的方法,其步驟:(1)重組H5N1禽流感病毒在MDCK細胞上適應；(2)病毒株作為反應器大規模培養病毒種子批制備，種子批病毒代次≥F6；血凝效價≥28；EID50≥107.5；(3)以聚酯片為載體培養MDCK細胞，以聚酯片為載體，反應器為籃式固定床，每克載體投放細胞；培養基為新生牛血清DMEM；(4)培養的MDCK細胞接種病毒，病毒稀釋液清洗細胞，病毒接種；吸附后更換細胞維持液；(5)MDCK細胞維持和病毒增殖，攪拌，更換細胞維持液；(6)監測血凝效價收獲病毒，收獲反應器培養體積病毒液。方法易行，操作簡便，適應后病毒HA效價>27，解決了目前重組H5亞型禽流感病毒在MDCK細胞上培養病毒滴度不能滿足疫苗生產的難題。
文檔編號C12R1/93GK102732487SQ20121019336
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月13日 優先權日2012年6月13日
發明者周明光, 左靜, 徐玲莉, 徐高原, 李俊平, 李國紅, 洪燈, 涂加剛, 蔣桃珍, 邸海波, 金梅林, 陳煥春, 韋大坤 申請人:中國獸醫藥品監察所, 華中農業大學, 武漢科前動物生物制品有限責任公司