專利名稱：稻瘟菌MoLON1基因的功能及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物工程技術領域，具體涉及植物病害防治領域中影響稻瘟菌分生孢子產生與致病力的基因及其編碼蛋白在植物病害防治中的應用，以及作為稻瘟菌防治藥物靶標的應用。
背景技術：
由稻痕菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻痕病是影響世界水稻產量的重要病害，在我國已成為三大水稻病害之一。每年由稻瘟菌侵染造成的水稻產量損失在10%到30%左右，重病地塊甚至會絕收。從2001到2005年，我國有570萬公頃的水稻被稻瘟菌破壞(Wilson and Talbot，2009)。由于稻瘟病在經濟方面的重要性，以及稻瘟菌在培養和遺傳方面的易操作性，稻瘟菌致病系統已經成為研究植物病原真菌與寄主互作的理想模式系統。稻瘟菌與水稻相互作用的研究有助于理解稻瘟菌的致病機理，為建立稻瘟病防治的新方法和新途徑提供科學依據。稻瘟菌能夠侵 染處于各個生育期的水稻，并可侵染水稻的葉、莖、節和花序等組織。除了水稻外，該菌也能夠侵染多種禾本科植物，如小麥、大麥，狗尾草等。稻瘟菌的侵染過程在細胞水平上的研究始于上世紀60年代(Suzuki，1965)。在其侵染的初期，分生孢子附著于葉片的表面(Tucker and Talbot, 2001) (Talbot, 2003) (Xu et al.,2007) 孢子萌發后，新生芽管可以識別水稻堅硬、疏水的表面，并在3小時內形成附著孢，附著孢通過兼容性溶質(如甘油)的積累可以形成高達SMPa的膨脹壓。稻瘟菌借助于形成于附著孢的底部的侵染釘，和其他因子一起破壞寄主的表皮和細胞壁(Dean et al.，2005)，引導其進入第一個被侵染的表皮細胞。研究表明(Kankanala et al.，2007)，一旦真菌侵入植物組織，稻瘟菌首先形成未分支的侵染菌絲，然后分化形成球狀侵染菌絲(Xu et al.，1998)，這些菌絲會迅速充滿第一個被侵染的表皮細胞。這些侵染菌絲會尋找胞間連絲，沿著胞間連絲擴展去破壞其他的細胞。在侵染的早期階段，稻瘟菌處于生物營養型階段，在此過程中稻瘟菌被內陷的寄主細胞膜包被，球狀、分支的稻瘟菌細胞可從活體植物細胞中吸收營養。隨著侵染的擴展，當損傷變的明顯時，稻瘟菌逐漸進入死體營養型階段(Ebbole，2007 ；Talbot,2003)。在過去的數十年中，科學家們對稻瘟菌早期侵染過程的分子生物學機制已經有了比較明確的認識(Ding et al., 2010 ；ffilson and Talbot, 2009 ；Zhao et al., 2007) 比如，附著胞的發育和和細胞周期的調節緊密相關，一個編碼在有絲分裂中必需的蛋白激酶基因(MgNIMA)基因的突變阻止了附著胞的發育(Veneault-Fourrey et al.，2006)。而附著胞中脂肪酸的分解代謝對侵染釘的形成至關重要，編碼脂肪酸β氧化多功能酶MFPl基因的缺失會明顯降低稻痕菌的致病性(Ramos-Pamplona and Naqvi, 2006 ；ffang et al.,
2007)。侵染釘的形成還需要MAPK信號途徑的參與。MIGl基因編碼的轉錄因子在MpslMAPK的下游起作用，Amigl突變體不能形成侵染性菌絲，故不能侵染植物(Mehrabi et al.,
2008)。
與稻瘟菌早期侵染過程的研究相比，由于侵染后涉及直接的互作過程，目前對侵染性菌絲在寄主體內的發育和生長機制研究較少，對稻瘟菌逃避或者抑制寄主的防御反應機制的研究也不夠完善。雖然已經找到一些基因在菌絲侵染性生長中起作用，比如PMKl和PDElATPase，但是這些基因也同時參與了其他的發育和侵染過程(Ding et al.，2010)。對稻瘟菌的生長和侵入沒有明顯影響，而僅對稻瘟菌在植物體內侵染特異的基因和突變體報道不多。Urban等報道的ABC轉運蛋白基因(Urban et al.，1999)，Chi等報道的DESl基因(Chi et al.,2009)和Ding等報道的組蛋白脫乙酰酶復合體(Ding et al.，2010)。2009年，Chi等報道了一個編碼未知蛋白的DESl基因的敲除對稻瘟菌的發育和侵染沒有明顯影響，但是ADESl突變體侵染水稻后，不能再寄主體內進行侵染性生長。2010年，Ding等報道了組蛋白脫乙酰酶復合體也可以調節稻瘟菌在侵入植物后的侵染性的生長，從而揭示了染色質的修飾在在調節稻瘟菌致病中的重要性。因此，對稻瘟菌侵入植物后和植物的相互作用的研究不僅可以進一步的揭示兩 種生物的作用機制，為防治稻瘟病提供理論依據，也已成為水稻-稻瘟菌互做研究的熱點和難點問題。稻瘟菌與水稻互作猶如雙方進行的一場分子戰爭。在這場戰爭中，ROS(reactionoxygenspecies,活性氧)是雙方共用的武器。稻痕菌中NOXl和N0X2 (NADPH oxidaseIandNADPH oxidase 2)產生的ROS可以促進蛋白質交聯到細胞壁上從而加速附著胞的成熟，增加其致病性(Egan et al.，2007)。而植物在受到侵染后也可以通過NOX產生的ROS來促進氧化交聯從而增強細胞壁的防御能力(Bradley et al., 1992) ;R0S也可以促進植物中木質素和氧化酹類等抗微生物物質的合成(Chen and Schopfer, 1999);最直接的是,ROS可以直接殺死病原物(Levine et al.，1994)。而ROS對病原物的破壞的目標之一便是線粒體(Bulteau et al.,2006)。ROS通過對線粒體內蛋白的氧化修飾從而使其失活,對這些氧化修飾蛋白的修復和降解是維持線粒體穩態的重要因素，否則會弓I起線粒體結構的改變和細胞的死亡(Tsilibaris et al.，2006)。蛋白酶Lon可以識別這些被修飾蛋白所曝露出的疏水區域并將其降解從而維持線粒體內的平衡。通過對稻瘟菌內MoLONl基因的分析，鑒定闡明編碼這些蛋白的基因對稻瘟菌致病性的影響，建立起ROS-Lon-線粒體-致病性的直接關系，并為尋找抗稻瘟菌的新型藥物提供靶標。

發明內容
本發明的目的在于提供一種來自稻痕菌(Magnaporthe oryzae)氣生菌絲生長、分生孢子形成、逆境應對和致病性必須的MoLONl基因及其編碼的蛋白質；本發明的另一個目的是提供MoLONl基因在稻瘟病菌防治和在作為稻瘟菌藥物防治的靶標作用的應用。本發明提供了一種來自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌絲擴展的MoLONl基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。一種來自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌絲擴展的MoLONl基因核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。一種用于蛋白質表達的載體pET-MoLonl，含有由MoLONl基因所編碼的氨基酸序列。一種敲除載體，按來自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌絲擴展的MoLONl基因構建。
一種通過對MoLONl基因的敲除或修飾表達在稻瘟菌產孢量和侵染性菌絲擴展發生缺陷中的應用。MoLONl基因在植物病害防治藥物的研究中作為靶標應用。MoLONl基因在植物抗逆境基因工程領域中的應用。MoLONl基因在防治由稻瘟菌引起的稻瘟病中的應用。MoLONl基因在植物病害防治藥物的研究中作為靶標應用。由MoLONl基因核苷酸序列所編碼的氨基酸序列作為靶標在設計和篩選抗稻瘟菌藥物中的應用。以MoLONl基因中任一區域的核苷酸序列設計引物，并通過PCR用于MoLONl基因在不同藥物處理后的表達檢測。本發明證明了 MoLONl基因的突變或缺失導致稻瘟菌氣生菌絲量減少、分生孢子產量降低、對多種逆境條件表現出敏感性增強和致病性明顯降低，說明MoLONl基因是稻瘟菌致病所必須基因。本發明的有益效果在于，篩選能夠阻斷或抑制MoLONl基因表達的藥劑，也就可以有效地控制稻瘟菌分生孢子的形成，從而減少病害循環次數，同時也可以有效減弱稻瘟病的發生，MoLONl基因以及蛋白質可以作為一個靶標用于新型殺菌劑的研究。


圖1為MoLONl基因結構示意圖
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其中:黑色線為內含子，黑色矩形為外顯子。圖2為不同生物Lonl蛋白質基酸序列同源對比示意圖其中:MoLon為稻痕菌Lonl蛋白質序列，ScLon為酵母Lonl蛋白質序列,HsLon為人類Lonl蛋白質序列，EcLon為大腸桿菌Lonl蛋白質序列。圖3為pXMoLONl稻瘟菌MoLONl基因敲除載體構建示意4為野生型菌株MoJJ88與突變體Λ 1nl氣生菌絲生長狀況對比照片其中:Α為野生型菌株氣生菌絲狀況，B為突變體Λ 1nl氣生菌絲生長狀況。圖5為野生型菌株MoJJ88與突變體Λ 1nl分生孢子產量對比照片其中:Α為突變體Λ 1nl分生孢子產生量，B為野生型分生孢子產生量。圖6為野生型菌株野生型菌株MoJJ88與突變體Λ 1nl對山梨醇敏感性對比照片其中:上幅照片是以含2%山梨醇的CM培養基接種，下幅照片是以含5%山梨醇的CM培養基接種。MoJJ88為野生型菌株，Molonl為基因缺失菌株。圖7為野生型菌株MoJJ88與突變體Λ 1nl對剛果紅敏感性對比照片其中:上幅照片是以含5%剛果紅GR(Congc) red)的CM培養基接種，下幅照片是以含10%剛果紅GR(Congo red)的CM培養基接種；Molonl/L0Nl為互補后菌株M0JJ88為野生型菌株；T-22為插入突變體菌株;Molonl為基因缺失菌株。圖8為菌株MoJJ88與突變體Λ 1nl致病力對比照片其中:A為突變體Λ 1nl發病后病斑狀況；Β為菌株MoJJ88發病后病斑狀況。圖9為MoJJ88與突變體Λ 1nl在水稻葉鞘細胞內擴展情況對比照片其中:Α為基因缺失菌株菌絲擴展情況，B為野生型菌株菌絲擴展情況，IH為侵染性菌絲，AP附著孢，IS為侵入位點。圖10為MoLONl基因在細胞內的定位情況照片其中:A為綠色熒光顯微觀察；B為Mito-red染色后顯微觀察；C為原始菌絲形態顯微觀察；D為A和B兩圖合并分析生成。圖11為MoLONl基因蛋白質表達、純化后SDS-PAGE分析電泳圖其中:I表示為表達純化后MoLonl蛋白，M表示蛋白質Marker
具體實施例方式為了更好地描述本發明，下面通過具體的實施例予以進一步的說明，下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1、MoLONl基因的相關性分析MoLONl基因位于稻瘟菌I號染色體上，全長3434bp，含有I個內含子，2個外顯子(見圖1)。取MoLONl基因的氨基酸序列進行比對分析(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/)，發現MoLONl基因在多種生物內普遍存在，并且具有較高的同源性(見圖2)。實施例2、MoLONl基因的敲除分析I)敲除載體的構建基因敲除采用同源重組的方法，用潮霉素磷酸轉移酶基因替換野生型菌株MoJJ88中的MoLONl基因的部分編碼區，具體構建策略見圖3。以野生型菌株MoJJ88基因組DNA為模板，用引物 pX-upl (5，GCTCTAGAATGTACCTAGGATGG 3’，5’ 端含 Xba I 酶切位點)和 pX_up
2(5’ CGGGATCCTTGATGGTTATTGCT 3’，5’端含BamH I酶切位點)擴增出的片段作為左臂，用引物 pX-downl (5，GGGGTACCACGATGCCATTGAGGAGC 3’，其中 5’ 端含 Kpn I 酶切位點)和 pX-down2 (5’ GGAATTCGGAAAGACGAGCCCGAAG 3’，5’ 端含 EcoR I 酶切位點)擴增出的片段作為右臂。酶切后，分別按照上下游順序分別連接到載體PXEH中潮霉素磷酸轉移酶基因的兩側得到MoLONl基因的敲除載體pMoLONl (見圖3)。2)稻瘟菌的轉化與敲除突變體的獲得a.稻瘟菌的遺傳轉化轉化采用CaC12/PEG介導的真菌原生質體轉化方法,用引物pX-upl和pX_down2組合PCR克隆含有潮霉素磷酸轉移酶基因和左右臂序列的DNA片段，將該片段轉化到野生型稻瘟菌菌株基因組中。具體操作(無菌操作)步驟如下:用野生型菌株MoJJ88產孢、收集孢子接種到500毫升三角瓶中的200毫升液體CM培養基內(酵母提取物0.1 %，酶水解干酪素0.05%，酸水解干酪素0.05%，，葡萄糖1%，硝酸鈣0.1%，磷酸二氫鉀0.02%，硫酸鎂0.025 %，氯化鈉0.015 % )，在26 °C、150轉/分條件下搖培48小時。三層滅菌擦鏡紙過濾并收集菌絲體，菌絲體用0.7M氯化鈉溶液洗滌兩次后轉移至50毫升滅菌離心管中，每I克菌絲加入I毫升的酶滲透液(含20毫克/毫升崩潰酶，用0.7M氯化鈉配制)，28°C、150轉/分條件下酶解3 — 4時后，用0.7M氯化鈉洗滌菌絲體，經三層滅菌擦鏡紙過濾，收集原生質體，4，000轉/分離心15分鐘，先用25毫升STC(12M山梨醇，IOm MTris-cl, ρΗ7.5，50mM氯化鈣)洗滌原生質體一次，然后分別用10毫升STC洗2次，離心沉淀后用ST C將原生質體濃度調至I又IO8個/毫升。將制備的原生質體分裝于50毫升離心管中，每管150微升，加入等體積PCR片段和STC混合液，冰上放置20分鐘，然后逐滴緩慢加入I毫升/管PTC溶液(60%聚已二醇3350，IOmMTris-HClPH7.5，50mM氯化鈣)，冰上靜止20分鐘，加入25毫升/管冰冷的STC，緩慢混勻，4，000轉/分、4°C離心15分鐘，去上清，然后每管加入3毫升的LR培養基(0.1 %酵母提取物，0.1%酶水解干酪素，頂蔗糖)，室溫靜置培養12小時后，轉入培養皿，加入約12升冷卻至50°C左右的SR(LR+1.6%瓊脂)，混勻，待其凝固吹干后，上面鋪一層12毫升的0.7%瓊脂(冷卻至50°C左右，含250微克/毫升的潮霉素)。26°C培養4一6天，將出現的轉化體轉至含300微克/毫升潮霉素的CM固體培養基上，二次篩選后將單個菌落轉入燕麥片-番茄培養基上培養，并進行單抱分離、保存菌種。b.轉化子的PCR檢測挑取部分轉化子菌塊接種于液體CM培養基內，18O轉/分，2 5 °C下搖培3天，雙層紗布過濾收集菌絲。CTAB法提取稻瘟菌基因組DNA，以稻瘟菌基因組DNA為模板，分別進行三次PCR擴增，I)引物MoLONl-1 (5，CAGCAAGAATACGAGCCG 3’)和MoL0Nl-2(5’ TGGTCCGACAAAGCAGAG3’ )擴增(擴增序列位于MoLONl基因敲除部分內部)。2)引物 HYG-1 (5，GTCGGCATCTACTCTATTCC 3’)和 HYG-2 (5，CCTATTCTACCCAAGCATCC 3’)擴增(擴增序列位于潮霉素磷酸轉移酶基因內部)。3)引物HYG-1和pX-Rdown擴增(HYG-1位于潮霉素基因內，pX-Rdownl位于MoLONl基因右臂序列下游)。經過3次PCR驗證(即引物組成I不能夠擴增出目的條帶，而引物組合2和3能夠擴增出目的條帶)，篩選出敲除突變體，并命名為Λ 1nl。實施例3、營養生長狀況分析采用固體CM平板培養法。將菌塊接種在固體CM培養基平板中，25 °C黑暗培養8天后照相觀察。與野生型相比，突變體菌落生長速率減慢，氣生菌絲數量明顯減少(見圖4)。實施例4、突變體分生孢子產生量分析

采用涂菌產孢法對野生型以及突變體的產孢情況進行比較分析。分別接種野生型稻瘟菌MoJJ88和突變體Λ 1nl在燕麥片-番茄培養基(燕麥片30克，番茄汁150ml，加水煮沸30分鐘，20克瓊脂，定容至I升，121°C高壓滅菌30分鐘)上，待菌落快長滿平板后，采用滅菌棉簽涂掉表面氣生菌絲，蓋上單層紗布，280C，持續光照培養3-5天，用滅菌的蒸餾水分別洗脫其分生孢子，并同血球計數板顯微計數。此試驗獨立重復6次。與野生型相比，突變體分生孢子產生量明顯下降(見圖5)。實施例5、MoLONl基因在稻瘟菌應對各種逆境條件中的作用I)山梨醇敏感性研究將突變體與野生型菌株分別接種于含有2%和5%山梨醇的CM培養基上，25°C黑暗培養7天，照相并記錄菌落生長狀況。與野生型相比，突變體對山梨醇敏感性增強，表明相對于野生型來說，外環境滲透壓的變化對突變體影響更大(見圖6)。2)細胞壁完整性研究將突變體與野生型菌株分別接種于含有剛果紅GR的CM培養基上，25°C黑暗培養7天，照相并記錄菌落生長狀況。與野生型相比，突變體對剛果紅GR敏感性增強(見圖7)。以上實驗說明，在一些逆境條件下，與野生型相比，突變體細胞壁的完整性更難保持。實施例6、MoLONl基因在稻瘟菌致病性中的作用I)孢子液滴接種離體水稻葉片
將15微升野生型菌株MoJJ88與突變體Λ 1nl的分生孢子懸浮液(濃度為IXlO5個孢子每毫升)，分別接種于4-5葉期的吉粳88水稻葉片上。28°C黑暗保濕培養36小時后，繼續光照保濕培養5天，觀察發病情況。接種結果表明，野生型出現典型的稻瘟菌病斑，而突變體△ 1nl病斑不能擴展，致病力顯著降低(見圖8)。2)侵染性菌絲擴展情況分析采用水稻葉鞘接菌法。將15微升野生型菌株MoJJ88與突變體Λ 1nl的分生孢子懸浮液(濃度為I X IO5個孢子每毫升)，分別接種于4-5葉期的吉粳88水稻葉鞘細胞上。28°C黑暗保濕培養72小時后顯微觀察發病情況。接種結果表明，與野生型在葉鞘細胞內的大量擴展相比，突變體Λ 1nl侵染性菌絲擴展緩慢(見圖9，其中AP:附著孢；IS:侵入位點；ΙΗ:侵染性菌絲)。實施例7、MoLonl的亞細胞定位I)互補以及亞細胞定位載體的構建以稻瘟菌基因組DNA為模板PCR擴增含有MoLONl基因啟動子(ATG上游1.5Kb序列)和完整編碼框的片段，并以PCB1532為骨架載體，構建完成用于互補以及亞細胞定位的載體pMoLonl-GFP，并通過上述原生質體轉化方法進行轉化與獲得轉化子。

2)熒光顯微鏡下觀察互補菌株MoLonl::gfp中綠色熒光蛋白在氣生菌絲內的定位分布，結合Mito-red染色結果，分析表明該融合蛋白定位在線粒體內(見圖10，其中A為綠色熒光觀察為Mito-red染色后顯微觀察；C為原始菌絲形態顯微觀察；D為A和B兩圖合并分析生成。)。實施例8、MoLonl蛋白的表達與純化以pET28a為骨架載體，以稻瘟菌cDNA為模板PCR擴增含MoLONl基因完整閱讀框的片段，構建完成蛋白質表達載體pET-MoLonl。并對該蛋白純化后SDS-PAGE分析(見圖11)。
權利要求
1.一種來自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌絲擴展的MoLONl基因，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
2.按權利要求I所述的來自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌絲擴展的MoLONl基因，其特征在于由MoLONl基因核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.一種用于蛋白質表達的載體pET-MoLonl,其特征在于含有權利要求2所述的氨基酸序列。
4.一種敲除載體，其特征在于按權利要求I所述的MoLONl基因構建。
5.一種通過對權利要求I中所述MoLONl基因的敲除或修飾表達在稻瘟菌產孢量和侵染性菌絲擴展發生缺陷中的應用。
6.權利要求I所述的MoLONl基因在植物抗逆境基因工程領域中的應用。
7.權利要求I所述的MoLONl基因在防治由稻瘟菌引起的稻瘟病中的應用。
8.權利要求I所述的MoLONl基因在植物病害防治藥物的研究中作為靶標應用。
9.權利要求2所述的由MoLONl基因核苷酸序列所編碼的氨基酸序列作為靶標在設計和篩選抗稻瘟菌藥物中的應用。
全文摘要
稻瘟菌MoLON1基因的功能及其應用屬生物工程技術領域，本發明涉及稻瘟菌MoLON1基因在致病過程中的功能以及其編碼蛋白的純化和用途，該基因與酵母、大腸桿菌等生物的ATP-依賴型蛋白酶Lon1具有較高的同源性，編碼1119個氨基酸，含有1個內含子，2個外顯子；MoLON1基因的敲除導致稻瘟菌氣生菌絲數量減少，分生孢子產量降低，侵染性菌絲基本喪失在水稻葉片細胞內的擴展能力，對多種逆境條件表現出敏感性增強；本發明還涉及MoLON1基因所編碼蛋白的表達與純化，可作為候選靶標，用于設計和篩選抗稻瘟病菌的新型藥劑。
文檔編號C12N15/63GK103255150SQ20121022762
公開日2013年8月21日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者賈保磊, 李健, 王煜涵, 劉金亮, 張世宏, 潘洪玉 申請人:吉林大學