知母皂苷aⅲ的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種知母皂苷AⅢ的制備方法。該方法將市售的中藥知母飲片或者新鮮采集的知母根莖或須根為原料，采用醇提、酶解、萃取、樹脂及硅膠柱層析、結(jié)晶組合工藝制得知母皂苷AⅢ。本發(fā)明方法制備的知母皂苷AⅢ的純度高于90%，適用于大量制備知母皂苷AⅢ。
【專利說明】知母皂苷AIII的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用酶解制備知母皂苷AIII的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)的干燥根莖，主產(chǎn)于河北、內(nèi)蒙古等地，有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效。知母的化學(xué)成分主要為皂苷、黃酮類成分，其中留體皂苷類為主要成分，其在根莖中的量約為6%，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了有40多種甾體皂苷。 [0003]知母中知母皂苷B II的含量是最高的，其結(jié)構(gòu)如圖1?！吨袊幍洹?010版規(guī)定知母藥材含知母皂苷B II不少于3.0% ;而文獻報道(不同產(chǎn)地知母藥材中芒果苷和知母皂苷B II的含量測定，中國實驗方劑學(xué)雜志，2010年第16期49-51頁)藥材中含知母皂苷B II多在5%左右，最高測得含量達10.25%。
[0004]知母皂苷AIII的結(jié)構(gòu)如圖2。與知母皂苷B II相比，二者的結(jié)構(gòu)僅在甾體皂苷C-22位不同，知母皂苷B II為呋留皂苷元，知母皂苷A III為螺留皂苷元，為知母皂苷B II脫糖后的產(chǎn)物。知母藥材含知母皂苷AIII較少，一般僅為0.3%左右，僅為知母皂苷B II的1/20(見色譜圖4)。
[0005]采用傳統(tǒng)的酸水解的方法將知母皂苷B II水解為知母皂苷AIII，化學(xué)反應(yīng)強烈，條件不容易控制，而且在酸性的條件下，知母皂苷B II極易水解為菝葜皂苷元(結(jié)構(gòu)見圖3)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對知母藥材中知母皂苷A III含量低，傳統(tǒng)酸水解提取方法不能大量制備知母皂苷A III的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效的、以酶轉(zhuǎn)化法制備知母皂苷AIII的新方法。
[0007]根據(jù)實施例，本發(fā)明提供的知母皂苷A III的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將市售的中藥知母飲片或者新鮮采集的知母根莖或須根為原料，用丙酮水溶液或體積濃度為50-90%乙醇水溶液加熱回流提取或者超聲提取，濃縮，制得知母提取物；
[0009](2)將步驟(1)制得的知母提取物通過大孔樹脂吸附法分離，使知母提取物的離心上清液或過濾液通過大孔吸附樹脂，用水洗去雜質(zhì)，用量為柱體積的3-5倍；再用10%-90%的乙醇水溶液作為洗脫劑洗脫，用量為柱體積的3-7倍；
[0010](3)收集步驟(2)的洗脫液，真空干燥制得知母總皂苷；
[0011](4)酶解:以步驟(1)制得的知母提取物或步驟(3)制得的知母總皂苷為底物，與適量β -葡萄糖苷酶混合加入pH = 3.75-4.95的醋酸緩沖溶液中，在37.5-55.(TC水浴中反應(yīng)1.0-3.0小時；
[0012](5)萃取:用正丁醇或者乙酸乙酯萃取3-6次，合并正丁醇或者乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑至干；
[0013](6)過柱:將步驟(5)的產(chǎn)物通過硅膠柱層析，分別用氯仿、甲醇和水洗脫，收集洗脫液；或?qū)⒉襟E(5)的產(chǎn)物通過AB8大孔樹脂，以不同濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液；
[0014](7)結(jié)晶:減壓回收洗脫液中有機溶劑，析晶，收集結(jié)晶，干燥，得到的酶解產(chǎn)物即為知母皂苷AIII。
[0015]根據(jù)一個實施例，本發(fā)明前述知母皂苷A III的制備方法的步驟(2)中大孔樹脂吸附法所用吸附樹脂為聚苯乙烯型大孔吸附樹脂，譬如=DlOl型大孔吸附樹脂、HPD100型大孔吸附樹脂或AB-8型大孔吸附樹脂。
[0016]根據(jù)一個實施例，本發(fā)明前述知母皂苷A III的制備方法的步驟(4)中葡萄糖苷酶采用游離酶的方式或固定化酶的方式加入。
[0017]本發(fā)明前述知母皂苷A III的制備方法中，原料和各工藝條件的考察/選取/驗證和試驗:
[0018]1、知母藥材中知母皂苷B II和知母皂苷A III的含量測定
[0019]1.1色譜條件
[0020]知母皂苷B II色譜條件:色譜柱為Alltima?C18色譜柱；乙腈一水(25:75)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。
[0021]知母皂苷AIII色譜條件:色譜柱為Alltima?C18色譜柱；以甲醇一水(85:15)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。
[0022]1.2供試品的制備
[0023]1.2.1知母藥材中知母皂苷AIII的供試品的制備。
[0024]取知母藥材粉末(過40目篩)約0.3g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲提取30分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻。濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0025]1.2.2.知母藥材中知母皂苷BII的供試品的制備。
[0026]取知母藥材粉末(過40目篩)約0.15g，精密稱定，置塞錐形瓶中，精密加入30%丙酮25ml，稱定重量，超聲提取30分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用30%丙酮補足減失的重量，搖勻。濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0027]三批藥材含量測定數(shù)據(jù)，見表1。
[0028]表1.知母藥材中B II和A III的含量測定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種知母皂苷A III的制備方法，其特征是，該方法包括以下步驟: (1)以市售的中藥知母飲片或者新鮮采集的知母根莖或須根為原料，用丙酮水溶液或體積濃度為50-90%乙醇水溶液加熱回流提取或者超聲提取，濃縮，制得知母提取物； (2)將步驟(1)制得的知母提取物通過大孔樹脂吸附法分離，使知母提取物的離心上清液或過濾液通過大孔吸附樹脂，用水洗去雜質(zhì)，用量為柱體積的3-5倍；再用10%-90%的乙醇水溶液作為洗脫劑洗脫，用量為柱體積的3-7倍； (3)收集步驟(2)的洗脫液，真空干燥制得知母總皂苷； (4)酶解:以步驟(1)制得的知母提取物或步驟(3)制得的知母總皂苷為底物，與適量β -葡萄糖苷酶混合加入pH = 3.75-4.95的醋酸緩沖溶液中，在37.5-55.(TC水浴中反應(yīng)1.0-3.0 小時； (5)萃取:用正丁醇或者乙酸乙酯萃取3-6次，合并正丁醇或者乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑至干； (6)過柱:將步驟(5)的產(chǎn)物通過硅膠柱層析，分別用氯仿、甲醇和水洗脫，收集洗脫液；或?qū)⒉襟E(5)的產(chǎn)物通過AB8大孔樹脂，以不同濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液； (7)結(jié)晶:減壓回收洗脫液中有機溶劑，析晶，收集結(jié)晶，干燥，得到的酶解產(chǎn)物即為知母皂苷A III。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷AIII的制備方法，其特征是，步驟(2)中大孔樹脂吸附法所用吸附樹脂為聚苯乙烯型大孔吸附樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的知母皂苷AIII的制備方法，其特征是，聚苯乙烯型大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂、HPD100型大孔吸附樹脂或AB-8型大孔吸附樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷AIII的制備方法，其特征是，步驟(4)中β-葡萄糖苷酶采用游離酶的方式或固定化酶的方式加入。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的知母皂苷AIII的制備方法，其特征是，步驟(4)中醋酸緩沖溶液的PH值為3.80-4.80，水浴溫度為45-53°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的知母皂苷AIII的制備方法，其特征是，步驟(4)中水浴溫度為50。。。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的知母皂苷AIII的制備方法，其特征是，步驟(4)中醋酸緩沖溶液的PH值是4.8。
【文檔編號】C12P33/20GK103540640SQ201210234803
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月9日
【發(fā)明者】張彤, 劉艷平, 楊軼舜, 丁越, 蔡貞貞, 王如峰 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)