Hoxa1基因及其表達產物的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種HOXA1基因及其表達產物的應用，用于制備肝癌診斷及治療的產品。本發明的HOXA1基因及其表達產物，可作為診斷肝癌的基因之一，使肝癌診斷更加準確、快速；本發明的HOXA1基因及其表達產物可作為制備治療肝癌藥物的靶基因，提供新的肝癌治療途徑。
【專利說明】H0XA1基因及其表達產物的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基因的應用，特別是涉及一種HOXAl基因及其表達產物的應用。【背景技術】
[0002]肝癌嚴重威脅著我國人民的生命健康。肝癌的診斷，尤其早期診斷是臨床診療和預后的關鍵。肝癌的治療在過去20年來已取得很大的進展，外科手術切除及肝臟移植屬于“根治性”治療，仍是肝癌治療的首要選擇。隨著肝癌早期診斷水平的提高及腫瘤治療生物學概念的改變，腫瘤局部非手術治療在肝癌治療中的地位日益提高。經導管動脈內化療栓塞(TACE)已成為不能切除肝癌治療的首選方法，是中晚期肝癌治療的重要手段。該方法可使90%以上的肝癌患者受益，但總體療效有待提高。此外，經皮肝穿刺瘤內無水乙醇治療(PEI)也是較常用的局部化療方法，對癌直徑<3cm的肝癌及門靜脈癌栓的治療有一定價值。但目前肝癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對性差，療效不佳，因此，迫切需要尋找新的作用靶點，研究和開發肝癌特異的新藥物，提高化療的特異性和有效性。近幾年來隨著對肝癌基礎研究的深入，生物治療在肝癌的綜合治療中取得了較大進展，成了繼手術、放療、化療后腫瘤治療的第四大療法，如免疫治療、基因治療，包括抗血管生成、自殺基因治療、腫瘤疫苗治療、siRNA技術等。但許多生物治療的臨床療效仍不十分滿意，且絕大多數還處在實驗研究階段，相關的關鍵理論和實驗技術仍需進一步研究和發展。
[0003]HOXAl基因在脊椎動物中，有一類同源基因編碼一組轉錄因子，則一類轉錄因子分為A，B, C，D家族，這類基因分布于四個不同的染色體上。這些蛋白的表達時間和空間隨著胚胎發育而改變。HOXAl基因位于7號染色體上的A家族的一員，編碼了一個與DNA結合的轉錄因子，從而調控基因表達，形態形成還有分化。有關HOXAl基因的研究文獻報道較少，特別是HOXAl基因與肝癌的關系研究還未見文獻報道。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題之一是提供一種HOXAl基因及其表達產物在制備診斷肝癌的產品中的應用。
[0005]本發明要解決的技術問題之二是提供一種HOXAl基因及其表達產物在制備治療肝癌的藥物中的應用。
[0006]本發明要解決的技術問題之三是提供一對特異擴增HOXAl基因的引物，該引物可用于制備用實時定量PCR診斷肝癌的產品。
[0007]本發明要解決的技術問題之四是提供HOXAl基因特定編碼DNA片段的測序引物，該測序引物可用于制備用DNA測序診斷肝癌的產品。
[0008]本發明要解決的技術問題之五是提供HOXAl基因的siRNAs，該siRNAs可用于制備治療肝癌的藥物。
[0009]外顯子組測序是針對基因組中的蛋白質編碼區，靶向富集外顯子區域測序，以發現疾病相關遺傳變異的技術。該技術近年越來越多地應用于發現人類基因組低頻變異、鑒定單基因遺傳病致病基因和腫瘤等復雜疾病易感基因研究，成為人類疾病相關變異研究的重要工具。為了鑒定肝癌發病過程中所發生體細胞突變的基因，本發明采用了外顯子組測序技術分析了 10例伴有肝內門靜脈癌栓的肝癌病人原位癌組織、門靜脈癌栓組織及對應的癌旁組織。通過對高通量數據進行嚴謹的分析，過濾篩選出475個可靠的點突變。為了鑒定重要的肝癌相關基因，通過針對91個被Sanger測序方法驗證具有突變的基因設計特異性siRNAs，在8株肝癌細胞株中篩選顯著影響細胞生存的候選基因。定量PCR檢測HOXAl基因在部分肝癌病人癌組織中表達上調。在脊椎動物中，有一類稱之為“homebox”基因，它們編碼轉錄因子，成簇分布于四條不同的染色體上。胚胎發育時這些蛋白的表達根據時間及空間變化而被調控。HOXAl基因編碼DNA結合轉錄因子，調芐基因表達、形態發生及分化。
[0010]為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現:[0011]在本發明的一方面，提供了一種HOXAl基因及其表達產物在制備診斷肝癌的產品中的應用。
[0012]所述診斷肝癌的產品包括:用實時定量PCR診斷肝癌的產品、用DNA測序診斷肝癌的產品。
[0013]所述用實時定量PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增HOXAl基因的引物。
[0014]所述用DNA測序診斷肝癌的產品包括:用于HOXAl基因特定編碼序列的測序引物。
[0015]在本發明的另一方面，提供了一種用于制備用實時定量PCR診斷肝癌的產品中的一對特異擴增HOXAl基因的引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID N0:9所示的序列或其互補序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO: 10所示的序列或其互補序列。
[0016]在本發明的另一方面，提供了一種用于制備用DNA測序診斷肝癌的產品中的HOXAl基因特定編碼序列的測序引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO:1所示的序列或其互補序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID N0:2所示的序列或其互補序列。
[0017]在本發明的另一方面，提供了一種HOXAl基因及其表達產物在制備治療肝癌的藥物中的應用。
[0018]所述治療肝癌的藥物及方式包括:通過RNA干擾抑制HOXAl基因表達的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相關病毒載體，能夠抑制HOXAl蛋白產物活性的化合物、多肽、單克隆抗體。
[0019]其中，所述治療肝癌的藥物包括:通過RNA干擾特異性抑制HOXAl基因表達的雙鏈核糖核酸及其不同修飾狀態、不同遞送方式。
[0020]所述治療肝癌的藥物包括:攜帶特異性針對HOXAl基因干擾其表達的DNA載體、病
毒載體。
[0021]在本發明的另一方面，提供用于制備治療肝癌藥物的HOXAl基因的兩對siRNAs，分別為HOXAl-sil和H0XAl-si2。其中，HOXAl-sil的正義鏈具有如SEQ ID NO:3所示序列，HOXAl-siI的反義鏈具有如SEQ ID NO:4所示序列。H0XAl_si2的正義鏈具有如SEQ IDNO:5所示序列，H0XAl-si2的反義鏈具有如SEQ ID NO:6所示序列。
[0022]本發明治療肝癌的藥物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內、靜脈內或皮下)。[0023]本發明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規方法進行制備。針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。
[0024]在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來制備針對HOXAl蛋白特異的抗體。例如，將提純的人HOXAl基因產物或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆抗體。同樣，表達人HOXAl蛋白或它的抗原的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。根據本發明制備的抗體可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤及時制備。本發明的抗體包括可以阻抑HOXAl功能的抗體，也可以是不影響人HOXAl功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人HOXAl基因產物的片段或功能域致免疫而產生，而人HOXAl基因產物及其片段可以用重組方法產生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的HOXAl基因產物結合的抗體，可以利用在原核細胞例如E.coli中產生的基因產物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化HOXAl蛋白或多肽結合的抗體，可以利用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產生的基因產物來免疫動物而得到。
[0025]本發明中，為了實現HOXAl基因及其表達產物在制備診斷肝癌的產品中的應用，即HOXAl基因及其表達產物作為肝癌診斷標志物應用的目的，本發明可通過如下技術方案實現:
[0026](I)檢測肝癌組織中HOXAl基因開放讀碼框(ORF)的核酸序列，其中，本發明中發現一例肝癌病人組織中HOXAl基因開放讀碼框(ORF)的核酸序列存在突變。
[0027](2)實時定量PCR檢測HOXAl基因mRNA在肝癌病人癌組織及對應癌旁組織中的表
達差異。
[0028]而對于HOXAl基因及其表達產物在制備治療肝癌的藥物中的應用，即HOXAl基因及其表達產物作為制備肝癌治療藥物的靶點，本發明可通過如下技術方案實現:
[0029](I)化學合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對HOXAl基因序列，利用脂質體包裹遞送至肝癌細胞內，干擾HOXAl基因的表達，CCK-8法測量肝癌細胞Huh-7、PLC/PRF/5、Focus和MHCC-97L生長活性，本發明中實驗結果證明特異性針對HOXAl基因的小核糖核酸分子能夠抑制肝癌細胞體外的生長，說明HOXAl基因可用作制備肝癌治療藥物的靶基因；
[0030](2)利用各種載體,包括DNA載體、腺病毒、腺相關病毒載體來干擾HOXAl基因的表達，達到體內干擾HOXAl基因的效果，從而實現抑制肝癌細胞體內增殖的目的；
[0031](3)獲得能夠特異性抑制HOXAl基因蛋白產物的多肽、單克隆抗體，達到抑制HOXAl蛋白活性的目的，從而實現抑制肝癌細胞體內增殖的目的；
[0032]本發明中用于特異性干擾HOXAl基因的小核糖核酸序列設計原則如下:
[0033]I).GC 含量 30%_52% ；
[0034]2).sense鏈的15-19堿基中至少含有3個A/U ;
[0035]3).不含有反向重復序列；
[0036]4).sense鏈的第19堿基為A ；
[0037]5).sense鏈的第3堿基為A ；
[0038]6).sense鏈的第10堿基為U ；
[0039]7).sense鏈的第19堿基不是G/C ；
[0040]8).sense鏈的第13堿基不是G。[0041]本發明首次公開了 HOXAl基因及其表達產物的應用，并通過本發明的實驗，首次證實HOXAl基因在肝癌病人發生錯義突變(如圖1所示)，并且通過HOXAl基因序列特異性siRNA干擾可以顯著抑制肝癌細胞的生長，因此，HOXAl基因及其表達產物可作為診斷肝癌的標志物和用于肝癌治療的藥物靶點，使肝癌診斷更加準確、快速，并提供了新肝癌治療的基因靶點。總之，本發明HOXAl基因及其表達產物為肝癌的防治提供了新的治療靶點和有效新藥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]下面結合附圖與【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明:
[0043]圖1是實施例2中HOXAl基因在一例肝癌病人癌旁組織、癌組織及門靜脈癌栓樣本中發生突變的測序峰圖，結果顯示該突變導致HOXAl蛋白第287位氨基酸的改變。
[0044]圖2是實施例3中RNAi篩選技術體系示意圖。[0045]圖3是實施例3中標準化的RNAi篩選總體情況示意圖。
[0046]圖4是實施例3中Z值與P值評估siRNA每株細胞活性的影響的統計學意義示意圖。
[0047]圖5 是實施例 5 中實時定量PCR 評價 HOXAl-sil, H0XAl_si2 在 Huh_7、PLC/PRF/5、Focus、MHCC-97L細胞中的干擾效果示意圖。
【具體實施方式】
[0048]以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0049]實施例110例肝癌病人的外顯子組捕獲測序
[0050]1.共30個組織樣本(實驗用組織來源于原發性肝癌并伴有門靜脈轉移的手術病人癌旁組織、癌組織、門靜脈癌栓組織)進行組織DNA抽提。采用德國QIAGEN公司的組織DNA抽提試劑盒，實驗步驟按照產品說明書進行。抽提所得DNA經ND-1000分光光度計及0.8%的瓊脂糖凝膠電泳質檢合格后備用。其中一例病人門靜脈癌栓組織DNA降解，其余29個組織樣本DNA質量符合要求。
[0051]2.Nimblegen外顯子捕獲，基因組DNA首先被隨機打斷成500bp左右的片段，隨后在DNA片段兩端分別連接上接頭。經過PCR庫檢合格后的DNA片段與NimbleGen2.1M HumanExome Array芯片進行雜交。去除未與芯片結合的背景DNA后,將經過富集的外顯子區域的DNA片段洗脫下來。這些DNA片段又隨機連接成長DNA片段后，再次被隨機打斷并在其兩端加上測序接頭，經過LM-PCR的線性擴增，在經qPCR質量檢測合格后即可上機測序。
[0052]3.采用Illumina Genome Analyzer II測序系統進行測序。這種測序技術通過將基因組DNA的隨機片斷附著到光學透明的表面，這些DNA片斷通過延長和橋梁擴增，形成了具有數以億計cluster的Flowcell,每個cluster具有約1000拷貝的相同DNA模板,然后用4種末端被封閉的不同熒光標記的堿基進行邊合成邊測序。這種新方法確保了高精確度和真實的一個堿基接一個堿基的測序，排除了序列方面的特殊錯誤，能夠測序同聚物和重復序列。
[0053]4.ABI SOLiD 測序。測序所用試劑米用 SOLiD Fragment Library Core Kit(Applied Biosystems, 4464412)。按照 G3360-90001_SureSelect_S0LiD對基因組DNA進行片段化、末端修復、100-250bp片段選擇、3’末端加腺苷酸、連接接頭、前擴增、雜交、雜交后洗脫、后擴增等步驟，完成測序樣本文庫構建。所建文庫使用Qubit+ 2.0Fluorometer儀器檢測濃度，FlashGel Dock系統Lonza膠電泳或Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫的大小和純度。質控標準:構建文庫濃度不低于Ing/ μ L ；電泳觀察構建的文庫大小~260bp。按照SOLiD? EZ Bead? Emulsifier(4441486B,AB),SOLiD? EZ Bead? Amplifier(4443494B,AB), SOLiD? EZ Bead? Enricher (4443496B，AB)相應程序，在自動化 EZ 系統上完成Emulsion PCR0 按照 Applied Biosystems 5500 Series Genetic Analyzers User Guide(4456991E)準備測序試劑,將鋪好beads的Flowchip上機,選用Fragment程序,進行單向lX75bp測序。測序過程由ABI提供的Instrument Control Software進行控制，并可實時觀測每個連接反應。
[0054]5.基本數據分析，包括:數據產出統計:對測序結果進行圖像識別(Basecalling),去除污染及接頭序列；統計結果包括:測定的序列(Reads)長度、Reads數量、數
據產量。
[0055]6.高級數據分析，包括:(l)Clean reads序列與參考基因組序列比對；(2)目標外顯子區域測序深度分析；(3)目標外顯子區域一致序列組裝；(4)目標外顯子區域SNP檢測及在CXDS數據庫中的注釋；(5)可變剪切、基因融合、外顯子融合分析。
[0056]實施例2在肝癌病人組織中對H0XA1基因特定編碼序列進行測序
[0057]1、肝癌組織DNA的抽提
[0058]采用QIAGEN 公司 DNA 抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit, Cat.n0.:51306)進行相關抽提操作，具體見該產品說明書，操作步驟簡述如下:
[0059](I)將組織放置于碾缽中，加入適量液氮充分碾磨至粉末狀，將組織粉末轉移到1.5ml的離心管中(約25mg)，在離心管中加入100 μ I裂解液和10 μ LRNaseA/蛋白酶K貯液，迅速充分振蕩混勻，置于55°C溫浴15分鐘，其間來回顛倒離心管數次。
[0060](2)加入 10μ L3MNaAc (ρΗ4.8)，然后加入 250 μ L DNA Binding Solution，充分振蕩混勻，使溶液呈水溶液狀，隨后將其轉移到離心吸附柱中。混勻后將上清直接加入到離心吸附柱中(切勿將沉淀雜質取到)，放置一分鐘，12000rpm離心30秒鐘。
[0061](3)倒掉收集管中的廢液，再加入600 μ L Wash Buffer，12，OOOrpm離心30秒。
[0062](4)重復步驟3—次至兩次。此步驟中，最后一次清洗應于12，OOOrpm離心3分鐘，以充分除去Wash Buffer。
[0063](5)小心取出吸附柱(勿沾上Wash Buffer，因為乙醇會影響后續的反應)，將其放入一個干凈的1.5ml離心管中，并加入50 μ L DP洗脫液或水(DP洗脫液一定要加在吸附柱的正中)。放置2分鐘后，于12，OOOrpm離心I分鐘。離心管中便是所提取的基因組DNA。取3-5 μ L電泳。如有殘余RNA，可適當加入少量RNaseA。
[0064]2、DNA 測序
[0065]DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今DNA序列分析的主流。本實驗介紹的是ABI PRISM310型DNA測序儀的測序原理和操作規程。ABI PRISM310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP (標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差I個堿基的3’末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CO) (charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉變為DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(SSCP)、微衛星序列分析、長片段PCR、RT-PCR (定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規DNA測序外，還可進行單核苷酸多態性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。 [0066]用前向引物:GAAGAGCTGGACTTCTCTGAGG(SEQ ID NO:1)，反向引物:
[0067]CACCAACTTCACTACCAAGCAG(SEQ ID NO:2)分別從待檢測的肝癌組織及相應癌旁組織DNA中擴增出DNA片段,米用高保真性DNA聚合酶Hotstar (QIAGEN, HotStar HiFidelityPolymerase Kit, Cat.n0.:202605)。
[0068]50 μ L PCR反應體系如下:DNA模板I μ L，前向引物(F)0.5yL，反向引物(F)
0.5 μ L，Hotstar DNA 聚合酶 0.1 μ L, dNTP (IOmM) 0.5 μ L, Mgcl2 (2.5mM) I μ L,補足 ddH20 至50 μ L體積ο
[0069]PCR反應條件如下:95°C熱啟動5分鐘，95 °C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，35~40循環。結果如圖1所示，在其中一例肝癌病人的癌組織中發現突變位點(G — A)，結果顯示該突變導致HOXAl蛋白第287位氨基酸的改變。
[0070]實施例3 RNAi篩選肝癌細胞生長必需突變基因
[0071]RNAi作為一種簡單快速、特異、高效、經濟、效果可預測的技術，具有明顯的優點，它比反義核酸技術優越，比基因敲除簡單，具有很好的應用前景。具體可用于以下幾個方面:基因功能分析；研究信號傳導通路的新途徑；新藥物的研究和開發；基因治療。RNAi只抑制致病基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，能減少非特異作用引起的副作用。腫瘤發生是多基因相互作用的基因網絡調控的結果，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產生多個基因同時沉默的效應，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關的基因同時沉默。
[0072]CCK-8測定細胞活性:CCK_8試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含WST-8[其化學名稱為:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2, 4- 二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲染料(Formazan dye)。細胞增殖越多越快,則顏色越深；細胞毒性越大,則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。分光光度計讀數，產生原始細胞活性數據，實驗流程如圖2所示。8個肝癌細胞株Huh-7，PLC/PRF/5, Focus, WRL68, MHCC-97L, MHCC-97H, HCC-LM3and HCC-LM6被用來進行細胞活性分析。原始數據經過標準化，數據校正、Z值評估等步驟，每株細胞系在RNAi之后的總體生長活性狀況如圖3所示:在WRL68、PLC/PRF/5、HCC-LM3、HCCLM6四株細胞系中多數基因被干擾之后對細胞活性無顯著影響(單樣本T 檢驗，WRL68, P=0.0801 ；PLC/PRF/5, P=0.3028 ；HCC-LM3, P=0.1617 ；HCC-LM6, P=0.5181)。然而，在Focus、Huh-7、MHCC-97L、MHCC-97H四株細胞中這些基因的功能缺失對細胞活性有顯著影響(單樣本 T 檢驗,Focus, P=0.0111 ；Huh-7, P=0.0001 ；MHCC-97L, P=0.0013 ；MHCC97H, P=0.0436)。接下來為了從這些篩選數據中鑒定出有效siRNAs,每條siRNA對細胞活性影響的表型由相應統計學參數Z值與P值來進行評估。結果如圖4所示，Z〈-5，P〈0.01范圍內的siRNAs促進細胞活性，Z>5，P〈0.01范圍內的siRNAs抑制細胞活性。實驗結果表明特異性干擾HOXAl基因表達的小干擾核糖核酸(siRNA)能夠抑制肝癌細胞Huh_7、PLC/PRF/5,Focus和MHCC-97L的生長，肝癌細胞的存活率明顯低于對照組的細胞，說明HOXAl基因的表達下調能在一定程度上抑制肝癌細胞生長。
[0073]實施例4 HOXAl基因的小干擾核糖核酸(siRNA)
[0074]體外化學合成小干擾核糖核酸(siRNA)具有快速、簡單和特異性強等特點，在抗腫瘤治療等方面有廣泛的應用前景。針對HOXAl基因mRNA設計合成2對條siRNAs對應靶序列，該2對siRNA序列分別如下:
[0075]HOXAl-sil 正義鏈:GACCAUAGGAUUACAACUUdTdC (SEQ ID N0:3)；
[0076]HOXAl-sil 反義鏈 :AAGUUGUAAUCCUAUGGUCdCdG (SEQ ID N0:4)；
[0077]HOXA1-si2 正義鏈:GCUAUGGCUCACAGAACUUdCdA (SEQ ID N0:5)；
[0078]HOXA1-si2 反義鏈:AAGUUCUGUGAGCCAUAGCdTdT (SEQ ID N0:6)；
[0079]另外設計無關序列作為陰性對照siRNA:
[0080]正義鏈，5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3，(SEQID NO: 7)
[0081]反義鏈，5，-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ IDN0:8)
[0082]在96 孔板中每孔接種 3 X IO3 個 Huh_7、Focus、MHCC-97H 和 HCC-LM3 細胞(無血清培養液)(均源自中國科學院細胞庫)，待細胞密度達到40%左右時，利用脂質體(Lipofectamine2000)轉染試劑分別將上述2種siRNA按終濃度50nmol/L轉染進Huh_7、PLC/PRF/5、Focus和MHCC-97L細胞中，4h后換成含10%胎牛血清的DMEM。以24h為I個檢測單位培養7d，每天檢測I次該細胞密度。每孔待測細胞液中加IOyL CCK-8，37°C孵育Ih0利用酶標儀在450nm波長下檢測其吸光度以代表細胞存活能力，繪制生長曲線。
[0083]實施例5實時定量PCR評價H0XA1基因在肝癌細胞中RNAi干擾效果
[0084]采用相對定量法檢測ELL基因在肝癌樣本中的表達差異(Thermal Cycler DiceTMReal Time System TP800, Takara; SYBR.? Premix Ex TaqTM, Takara)。突光定量 PCR(real-time PCR)反應體系如下:總體積20 μ L, SYBR Premix Ex TaqlO μ L,上下游引物(10 μ mol/L)各0.4 μ L，cDNAl μ L, ddH208.2 μ L,混勻試劑，離心后放入PCR儀中進行擴增反應。反應條件為95°C變性5秒，68°C退火延伸30秒，40循環。儀器使用按廠家的說明操作。管家基因β-actin作為內參。
[0085]H0XA1-F:5’-TCTTCTCCAGCGCAGACTTT-3’ (SEQ ID NO:9)，[0086]H0XA1-R:5’-CGTGAGCTGCTTGGTAGTGA-3’ (SEQ ID NO: 10);
[0087]e-actin-F:5’ -AATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’ (SEQ ID NO: 11)，
[0088]e-actin-R:5’ -ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT-3’ (SEQ ID NO: 12)。
[0089]實時定量PCR 檢測表明，HOXAl 基因在 Huh_7、PLC/PRF/5、Focus 和 MHCC-97L 細胞中被HOXAl-si 1，HOX A1-si2有效干擾而表達下調(實驗結果見圖5)。
【權利要求】
1.一種HOXAl基因及其表達產物的應用，其特征在于:所述HOXAl基因及其表達產物在制備診斷肝癌的產品中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于:所述診斷肝癌的產品包括:用實時定量PCR診斷肝癌的產品、用DNA測序診斷肝癌的產品。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于:所述用實時定量PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增HOXAl基因的引物。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于:所述用DNA測序診斷肝癌的產品包括:用于HOXAl基因的測序引物。
5.一種HOXAl基因及其表達產物的應用，其特征在于:所述HOXAl基因及其表達產物在制備治療肝癌的藥物中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于:所述治療肝癌的藥物包括:通過RNA干擾抑制HOXAl基因表達的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相關病毒載體，能夠抑制HOXAl蛋白激酶活性的化合物、多肽、單克隆抗體。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于:所述治療肝癌的藥物包括:通過RNA干擾特異性抑制HOXAl基因表達的雙鏈核糖核酸及其不同修飾狀態、不同遞送方式。
8.如權利要求5所述的應用，其特征在于:所述治療肝癌的藥物包括:攜帶特異性針對HOXAl基因干擾其表達的DNA載體、病毒載體。
9.用于制備用實時定量PCR診斷肝癌的產品中的一對特異擴增HOXAl基因的引物，其特征在于:所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID N0:9所示的序列或其互補序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO: 10所示的序列或其互補序列。
10.用于制備用DNA測序診斷肝癌的產品中的HOXAl基因的測序引物，其特征在于:所述測序引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO:1所示的序列或其互補序列；所述測序引物的下游引物序列具有如SEQ ID NO:2所示的序列或其互補序列。
11.用于制備治療肝癌藥物的一對HOXAl基因的siRNA，其特征在于:所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO:3所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO:4所示序列。
12.用于制備治療肝癌藥物的一對HOXAl基因的siRNA，其特征在于:所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO:5所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO:6所示序列。
【文檔編號】C12N15/113GK103540653SQ201210246001
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月16日 優先權日:2012年7月16日
【發明者】鄧慶, 韓澤廣, 王群 申請人:上海人類基因組研究中心