專利名稱：一種一步法獲取豬opn4基因的完整cds區序列的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，尤其涉及的是一種一步法獲取豬0PN4基因的完整⑶S區序列的方法。
背景技術：
0PN4(黑素視蛋白，Melanopsin),近年發現的一種視網膜神經節細胞表達的感光視蛋白。是一個慢反應的綜合性的光色素，并充當晝夜變化的傳導分子?，F已證實Melanopsin陽性的神經節細胞是哺乳動物中繼視錐、視桿細胞之外的第三種感光細胞，它可能與非脊椎動物體內的彈狀細胞源于一種共同的感光細胞，而Melanopsin的功能則是參與瞳孔對光反射、生物晝夜節律調節等非視覺成像系統，研究該基因的作用和功能將對動物感光機制以及生物節律的調控機制的進一步研究奠定基礎。RT-PCR克隆是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)以及分子克隆相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的基因片段，將合成的目的基因片段克隆到載體細胞基因中，然后用質粒PCR產物測序。此技術利用PCR技術能在體外進行有效的基因擴增，而不需要內切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術很快獲得其他依靠限制性內切酶消化的方法難于得到的PCR產物；克隆載體PCR測序能克服PCR產物測序引物近端的十幾個堿基無法測序獲得的缺點。與RACE (cNDA末端快速擴增)技術相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本低，工作量小。該技術成功的關鍵是PCR引物的設計，在起始密碼子的上游設計上游引物，在終止密碼子的下游設計下游引物，使得PCR產物包含完整的基因編碼區全序列。分段PCR克隆法將目的基因分成幾段來分別克隆，然后做亞克隆測序拼接。成本高，工作量大耗時，一個基因分成幾段就需要做幾次克隆，然后再做序列接拼。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種一步法獲取豬0PN4基因的完整⑶S區序列的方法。本發明的技術方案如下一種克隆豬0PN4基因編碼區全序列的方法，包括以下步驟Al、提取豬視網膜組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA ；A2、引物的設計及PCR反應以哺乳動物該基因的保守區作為模板在起始密碼子上游和終止密碼子的下游設計保守引物；設計的引物為上游引物Pl :5' -atgaaccctccttcacggcc-3!下游引物P2 :5' -ctacatcctggggtccaggctg-3!用cDNA為模板進行梯度PCR操作確定普通PCR的擴增條件，溫度為范圍在50°C到65°C之間的8個溫度點 PCR反應體系為IOul體系(5 ii L的2 XMaster Mix Tap,上下游引物各0. 5 ii L，2 ii L的cDNA，2 y L的ddH20.)，反應條件為95°C預變性5min，38個循環(94°C，30s ；50°C, 30s ；72°C，60s)，最后 72°C IOmin ；A3、PCR產物的回收和純化；A4、克隆。所述步驟Al包括以下步驟用液氮將視網膜磨成粉末裝入I. 5mE管，放入-80°C的超低溫冰箱中備用；取新的I. 5ml的EP管,加入Iml的Trizol液,然后加入約80mg的視網膜組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘；加入0. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，4°C下13000rpm離心8分鐘，取上層水相于一新的離心管，加入等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入Iml的75%乙醇混勻，4°C下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，加入30ul到IOOul的DEPC水；瓊脂糖凝膠檢測RNA的質量，將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。所述的方法，所述步驟A3包括以下步驟
a.將60iU PCR產物于I %的瓊脂糖凝膠中電泳。用干凈的手術刀割下所要回收的DNA的瓊脂塊，放入I. 5ml離心管稱取重量。b.按每0. I克膠塊加入300 U I溶膠液；于50°C水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉EP管，以確定膠塊充分溶解；c.溶解后的凝膠溶液加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12000r/min離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；d.向吸附柱加入700 ill漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱
重新放入收集管中；e.向吸附柱加入500 ill漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液；將吸附柱徹底晾干，以防止殘留漂洗液影響下一步的試驗；f.將吸附柱置于另一個干凈的EP管中，向吸附膜中間位置懸空加入30uL洗脫液，室溫放置2min, 12000r/min離心Imin收集DNA溶液；g.取2uL回收產物于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測回收效率和純度；所述的方法，所述步驟A4包括以下步驟(I)目的片段與載體連接將回收、檢測后的目的片段與PMD-18T載體連接，根據TaKaRa的pMD_18T載體試
劑盒使用說明書，操作連接體系為
PMD-18T Vector0.5 U L
純化回后的PCR片段5uL
Solution I4.5 P L
Total10.0 u L以上操作在冰上進行，稍離心混勻，16°C在PCR儀中連接12h，_20°C保存備用；(2)大腸桿菌感受態細胞的制備a.從無抗生素平板上挑取新鮮的E. coli JM109單菌落結種于10ml LB液體培養基中，37°C，250r/min搖菌培養過夜；
b.取2ml活化過夜的菌液接種于含50ml LB液體培養基的錐形瓶中，37°C，250r/min搖菌培養至0D_ = 0. 3 ；c.將細菌培養物無菌操作下轉移至50ml EP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min離心IOmin,棄上清,收集菌體沉淀；d.加入20ml冰預冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次4°C 4000r/min離心lOmin，棄上清，收集菌體沉淀；e.加入2ml冰預冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置過夜；f.按200ul/份加入15%冰預冷甘油，混勻分裝，_70°C凍存備用；(3)連接產物的轉化
a.吸取IOul連接物介入冰預冷的I. 5mlEP管中，再取出_70°C凍存的E. coli感受態細胞置于冰上融化，輕彈管壁使細胞混勻；b.小心吸取IOOiU細胞懸液加入到含有連接產物的EP管中，輕彈管壁，混勻后冰浴 30min ；c. 42°C水浴熱激90sec,立即冰浴3min ；d.加入500 u I預熱至37°C的LB液體培養基，37°C，250r/min搖菌培養45min ；e.吸取200 ii I菌液,用滅菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固體培養基平板上,室溫溫浴至完全吸收，37°C培養箱中倒置過夜培養；(4)陽性菌落的篩選隨機挑選菌落接種于LB氨節培養液中，培養至中等濃度后以菌液為模板，用于相應基因PCR擴增相同的引物及反應條件進行擴增。擴增產物用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定為所克隆基因后，取20 Ul交送北京六合華大生物工程技術有限公司完成測序。該技術相比較分段克隆和RACE技術而言，目的PCR片段的長短大致明確，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的優勢。


圖I為0PN4基因PCR產物檢測結果
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。I. 0pn4基因克隆、序列分析I. I組織樣采集選取健康的良種豬，采集視網膜組織樣品液氮中冷凍后，置于-80°C冰箱保存備用。L 2引物的設計 在NCBI上下載10哺乳動物0PN4序列，通過DNAman比對確認其保守區位置，以哺乳動物該基因的保守區作為模板在起始密碼子上游和終止密碼子的下游設計保守引物；設計的引物為上游引物Pl # -atgaaccctccttcacggcc-3!
下游引物P2 :5' -ctacatcctggggtccaggctg-3'I. 3 總 RNA 提取I).用Trizol法提取總RNA，本實驗所用離心管、槍頭和水均經0. I %焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)過夜處理,高壓滅菌后烘干處理。用DEPC處理水配置溶液。研缽用5% NaOH浸泡30 60min，清水沖凈，無水乙醇洗三次，晾干，高壓，烤干。2).液氮研磨將組織樣品從-80°C超低溫冰箱中取出，置于液氮預冷的研缽中，加入少量液氮迅速研磨，直至組織被研成細小粉末狀時，將其轉入經0. I %的DEPC水處理過并且經高壓蒸汽滅菌的Eppendorf管中。3).勻衆立即加入Trizol (按50 IOOmg組織樣品/mL Trizol加入)，進行顛倒混合后，室溫放置5min，使組織樣品充分裂解。另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果不好。4). 4°C, 12, OOOg 離心 5min,棄沉淀。5).按200 V- L氯仿/mLTrizol加入氯仿,振蕩混勻后室溫放置15min。6) 4°C，12，OOOg 離心 15min。I).吸取上層水相，至另一支Eppendorf管中。注不要吸取中間界面。8).按0. 5mL異丙醇/mLTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5 lOmin。9) 4°C, 12，OOOg 離心 lOmin,棄上清，RNA 沉于管底。10).按ImL 75%乙醇/mL Trizol的比例加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。11). 4°C，8, OOOg 離心 5min,棄上清。12).室溫晾干或真空干燥5 lOmin。13).用30 ii L DEPC處理過的去離子水溶解RNA樣品，55 60°C水浴，5 lOmin。14).取6 ii L RNA樣品用于OD值和I %的瓊脂糖/EtBr凝膠電泳檢測其質量，其余樣品置于_80°C冰箱中保存備用。I. 4反轉錄使用寶生物公司反轉錄試劑盒PrimeScript RTreagent Kit Perfect Real TimeI) 反應體系
權利要求
1.一種克隆豬0PN4基因編碼區全序列的方法，其特征在于，包括以下步驟A1、提取豬視網膜組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA ;A2、引物的設計及PCR反應以哺乳動物該基因的保守區作為模板在起始密碼子上游和終止密碼子的下游設計保守引物上游引物 Pl:5' -atgaaccctccttcacggcc-3'下游引物 P2 :5' -ctacatcctggggtccaggctg-3'；A3、PCR產物的回收和純化；A4、克隆。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟Al包括以下步驟用液氮將視網膜磨成粉末裝入I. 5mE管，放入_80°C的超低溫冰箱中備用；取新的I. 5ml的EP管，加入Iml的Trizol液，然后加入約SOmg的視網膜組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘；加入0. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，4°C下13000rpm離心8分鐘，取上層水相于一新的離心管，加入等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入Iml的75%乙醇混勻，4°C下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，加入30ul到IOOul的DEPC水；瓊脂糖凝膠檢測RNA的質量，將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟A3包括以下步驟 a.將60iUPCR產物于I %的瓊脂糖凝膠中電泳。用干凈的手術刀割下所要回收的DNA的瓊脂塊，放入I. 5ml離心管稱取重量； b.按每0.I克膠塊加入300 Ul溶膠液；于50°C水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉EP管，以確定膠塊充分溶解； c.溶解后的凝膠溶液加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12000r/min離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中； d.向吸附柱加入700u I漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中； e.向吸附柱加入500ill漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液；將吸附柱徹底晾干，以防止殘留漂洗液影響下一步的試驗； f.將吸附柱置于另一個干凈的EP管中，向吸附膜中間位置懸空加入30uL洗脫液，室溫放置2min，12000r/min離心Imin收集DNA溶液； g.取2uL回收產物于I.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測回收效率和純度；
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟A4包括以下步驟 (I)目的片段與載體連接 將回收、檢測后的目的片段與PMD-18T載體連接，根據TaKaRa的pMD_18T載體試劑盒使用說明書，操作連接體系為 PMD-18T Vector0.5 P L 純化回后的PCR片段5uLSolution I4.5 U L Total10.0 u L 以上操作在冰上進行，稍離心混勻，16°C在PCR儀中連接12h，_20°C保存備用；(2)大腸桿菌感受態細胞的制備 a.從無抗生素平板上挑取新鮮的E.coli JM109單菌落結種于IOml LB液體培養基中，370C，250r/min搖菌培養過夜； b.取2ml活化過夜的菌液接種于含50mlLB液體培養基的錐形瓶中，37°C，250r/min搖菌培養至OD600 = 0 . 3 ； c.將細菌培養物無菌操作下轉移至50mlEP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min離心IOmin,棄上清,收集菌體沉淀； d.加入20ml冰預冷的0.lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次40C 4000r/min離心IOmin,棄上清,收集菌體沉淀； e.加入2ml冰預冷的0.lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置過夜； f.按200ul/份加入15%冰預冷甘油，混勻分裝，_70°C凍存備用； (3)連接產物的轉化 a.吸取IOul連接物介入冰預冷的I.5ml EP管中，再取出-70°C凍存的E. coli感受態細胞置于冰上融化，輕彈管壁使細胞混勻； b.小心吸取100u I細胞懸液加入到含有連接產物的EP管中，輕彈管壁，混勻后冰浴30min ； c.42°C水浴熱激90sec,立即冰浴3min ； d.加入500u I預熱至37°C的LB液體培養基，37°C，250r/min搖菌培養45min ； e.吸取200iiI菌液,用滅菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固體培養基平板上,室溫溫浴至完全吸收，37°C培養箱中倒置過夜培養； (4)陽性菌落的篩選 隨機 挑選菌落接種于LB氨節培養液中，培養至中等濃度后以菌液為模板，用于相應基因PCR擴增相同的引物及反應條件進行擴增。擴增產物用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定為所克隆基因后，取20 Ul交送北京六合華大生物工程技術有限公司完成測序。
全文摘要
本發明公開了一種克隆豬OPN4基因編碼區全序列的方法，包括以下步驟A1、提取豬視網膜組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA；A2、引物的設計及PCR反應以哺乳動物該基因的保守區作為模板在起始密碼子上游和終止密碼子的下游設計保守引物上游引物P15′-atgaaccctccttcacggcc-3′下游引物P25′-ctacatcctggggtccaggctg-3′；A3、PCR產物的回收和純化；A4、克隆。該技術相比較分段克隆和RACE技術而言，目的PCR片段的長短大致明確，工作量小，只需克隆一次，具有成本低，效率高的優勢。
文檔編號C12N15/70GK102796742SQ201210249708
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者鄒明峰, 白林, 康波, 李學偉, 帥素容, 姜冬梅, 朱礪, 劉益平 申請人:四川農業大學