專利名稱：一種生產水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及構建微生物工程菌生產重組酶。具體是應用微生物工程菌生產水解淀粉為果葡糖漿的酶系。
背景技術：
果葡糖漿是一種新型甜味 劑。果葡糖漿的甜度最高，相當于蔗糖I. 8倍，并且果葡糖漿具有類似蜜糖的風味和不易引起血糖升高的性能。當前，國內外需求量大，主要應用于食品領域的飲料、面包、奶制品、罐頭、果糖和其它食品。淀粉是制備果葡糖漿的主要是原料。用不甜的淀粉為原料轉變成具有甜味的葡萄糖，再通過異構化反應轉變葡萄糖生成果糖，生產果葡糖漿(果糖和葡萄糖的混合物)。淀粉由直鏈和支鏈組成。支鏈由a-1，6糖苷鍵連接，而直鏈的糖分子之間由a -1，4糖苷鍵連接。在天然的淀粉質原料中，支鏈淀粉的含量約占70% 95%，而直鏈淀粉的含量< 30%。異淀粉酶(Isoamylase，E. C. 3. 2. I. 68)能專一性地分解支鏈淀粉中分支點的a-1，6糖苷鍵，將支鏈淀粉轉化為直鏈淀粉，因此又稱為脫支酶。葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,E. C. 3. 2. I. 3)，簡稱糖化酶。葡萄糖淀粉酶能催化直鏈淀粉水解為葡萄糖。在異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的聯合作用下，淀粉水解生成葡萄糖。木糖異構酶具有異構葡萄糖為果糖的功能。酶法生產果葡糖漿是果葡糖漿生產的主要途徑。當前，酶法生產果葡糖漿的方法是先生產異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，通過異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用，將淀粉水解生成葡萄糖；然后，再用木糖異構酶異構葡萄糖為果糖，生產果糖與葡萄糖混合的果葡糖漿。這些酶的分別生產需要大量的人力和能耗。當前市面上只有這些酶的單種酶，尚沒有混合表達這些酶的菌種和混合酶產品。畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)都是常用于生產重組蛋白的宿主菌，但各具有特征。畢赤酵母的主要特征是分泌極少自身蛋白有利于表達產物的純化的特點，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有兼性需氧的特性，適合于固態厭氧發酵生產重組酶。

發明內容
本發明根據異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶具有聯合水解淀粉生成果葡糖漿的作用(即異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶是水解淀粉生成果葡糖漿的酶系)，市場上還沒有異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶的水解淀粉生成果葡糖漿的酶系產品；畢赤酵母、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌是常用于表達外源蛋白的宿主菌，而通過分子生物學技術構建含異淀粉酶基因表達框架(說明.表達框架啟動子-信號肽-基因-轉錄終止子)、葡萄糖淀粉酶基因表達框架和木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌。用含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架和木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產水解淀粉為果葡糖漿的酶系(異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶)。本發明所采用的技術方案是I.克隆酶基因應用分子生物學技術，從假單胞桿菌(pseudomonas)基因組中擴增異淀粉酶基因，從曲霉(Aspergillus)基因組中擴增葡萄糖淀粉酶基因，從棲熱菌(Thermus)基因組中擴增木糖異構酶基因。2.獲得構建表達載體所需的啟動子，重組序列，信號肽，轉錄終止子序列和抗性基因。3.構建如附圖I的畢赤酵母表達載體、附圖2的釀酒酵母表達載體和附圖3的枯草芽孢桿菌表達載體。4.應用電轉化方法將含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架、木 糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母；應用電轉化方法將含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架、木糖異構酶基因表達框架的釀酒酵母表達載體轉化釀酒酵母；應用電轉化方法將含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架、木糖異構酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌表達載體轉化枯草芽孢桿菌。分別篩選高表達異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶的畢赤酵母重組子、釀酒酵母重組子和枯草芽孢桿菌重組子作為含異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌。5.分別發酵含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架和木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產水解淀粉生成果葡糖漿的酶系(異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶)。本發明構建含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架和木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶的優點體現于(I)針對異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶具有協同水解淀粉生成果葡糖漿的特性，即異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶是水解淀粉生成葡萄糖的酶系，而市場上需求這種酶系產品。本發明通過構建工程菌，應用工程菌生產重組混合異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶，一方面提供混合異淀粉酶、a淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的新產品，另一方面取代分別發酵含異淀粉酶基因的菌株生產異淀粉酶，發酵含葡萄糖淀粉酶基因的菌株生產葡萄糖淀粉酶，發酵含木糖異構酶基因的菌株生產木糖異構酶。即用一個發酵工序生產整個水解淀粉生成果葡糖漿的酶系取代用多個工序分別生產水解淀粉生成果葡糖漿的三種酶。達到節省了原材料、能耗和人力資源的作用。(2)畢赤酵母、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌在生產重組蛋白方面各具特征，本發明分別構建含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架和木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌，為其重組酶生產提供多種宿主選擇。


附圖I.含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架和木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體
P.畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子；S. a因子信號肽；iso.假單胞桿菌的異淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.棲熱菌的木糖異構酶基因；T.轉錄終止子序列；G418.抗性基因(應用于篩選畢赤酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌復制起點；AMP.氨節青霉素抗性基因(應用于篩選大腸桿菌轉化子)；P. pastoris rDNA.畢赤酵母的rDNA序列。附圖2.含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架和木糖異構酶基因表達框架的釀酒酵母表達載體P.釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子；S. a因子信號肽；iso.假單胞桿菌的異淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.棲熱菌的木糖異構酶基因；T.轉錄終止子序列；G418.抗性基因(應用于篩選釀酒酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌復制起點；AMP.氨節青霉素抗性基因(應用于篩選大腸桿菌轉化子)；S. cerevisiae rDNA.釀酒酵母的rDNA序列。附圖3.含異淀粉酶基因表達框架、葡萄糖淀粉酶基因表達框架和木糖異構酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌表達載體P.巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子；S. a因子信號肽；iso.假單胞桿菌的異淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.棲熱菌的木糖異構酶基因；T.轉錄終止子序列；G418.抗性基因(應用于篩選枯草芽孢桿菌重組子)；ColEl.大腸桿菌復制起點；AMP.氨芐青霉素抗性基因(應用于篩選大腸桿菌轉化子)；B. subtilis rDNA.枯草芽孢桿菌的rDNA序列。
具體實施例方式下面用非限定性實施例對本發明作進一步說明。實施例I :I. I構建畢赤酵母表達載體I. I. I構建克隆載體由專業的DNA序列合成公司合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列、多克隆接頭和大腸桿菌復制起點的兩條堿基互補的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pPGI. I. 2猶取基因①PCR擴增假單胞桿菌(Pseudomonas)的異淀粉酶基因引物I :5，CGGATATCGCCATCAACAGCATGAGC3，[說明引物5’端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基)]
弓I 物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A jATGATGATGATGATGATG
CTTGGAGATCAACAGCAGCAGCGATTG3’ [說明5’的10個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和酶識別位點(8個堿基)，方框中的18個堿基是編碼6個組氨酸的DNA序列。]應用常規的細菌基因組DNA提取的方法提取假單胞桿菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是假單胞桿菌的異淀粉酶基因序列。
②反轉錄PCR擴增曲霉(Aspergillus)的葡萄糖淀粉酶基因(包括信號肽)引物I:
權利要求
1.一種生產水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法，其特征在于，其具體步驟如下 1)、應用分子生物學技術克隆假單胞桿菌的異淀粉酶基因、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因和棲熱菌的木糖異構酶基因； 2)、分別構建含上述基因的表達框架的畢赤酵母表達載體、釀酒酵母表達載體和枯草芽孢桿菌表達載體； 3)、將上述構建的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母獲得畢赤酵母重組子，將上述構建的釀酒酵母表達載體轉化釀酒酵母獲得釀酒酵母重組子，將上述構建的枯草芽孢桿菌表達載體轉化枯草芽孢桿菌獲得枯草芽孢桿菌重組子； 4)、篩選高表達以上所述的異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶的畢赤酵母重組子作為含假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表達框架和棲熱菌的木糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，篩選高表達以上所述的異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶的釀酒酵母重組子作為含假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表達框架和棲熱菌的木糖異構酶基因表達框架的釀酒酵母工程，篩選高表達以上所述的異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶的枯草芽孢桿菌重組子作為含假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表達框架和棲熱菌的木糖異構酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程； 5)、分別發酵以上所述的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產水解淀粉生成果葡糖漿的酶系(異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶)。
2.根據權利要求I所述一種生產水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法，其特征在于利用權利要求I所述的生產水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法制備水解淀粉生成果葡糖漿的酶系(異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶)產品。
全文摘要
本發明公開了一種生產水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法。屬生物技術領域。首先分別克隆假單胞桿菌的異淀粉酶基因、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因和棲熱菌木糖異構酶基因；構建含上述三種基因表達框架的畢赤酵母表達載體、釀酒酵母將表達載體和枯草芽孢桿菌表達載體，并將載體轉化相應的宿主菌而獲得工程菌。發酵畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產重組混合異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構酶(水解淀粉生成果葡糖漿的酶系)。本發明用一道工序同時生產水解淀粉生成果葡糖漿的酶系，解決分別生產這三種酶的成本高而制約酶法生產果葡糖漿產業發展的問題，為市場提供上述酶系新產品，有利于加速酶法生產果葡糖漿產業的發展。
文檔編號C12N9/34GK102747062SQ20121025183
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月9日 優先權日2012年7月9日
發明者尹慧祥, 張添元, 張愛聯, 符仙, 羅進賢 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所