專利名稱：一種腺苷脫氨酶檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人腺苷脫氨酶的檢測試劑盒。
背景技術：
腺苷脫氨酶(ADA)是嘌呤核苷分解代謝過程中關鍵作用的酶，它能催化腺嘌呤核苷降解為次黃嘌呤核苷，而后經核苷磷酸化酶催化成次黃嘌呤，最終氧化成代謝產物尿酸。腺苷脫氨酶有三種同エ酶，分別是腺苷脫氨酶I、腺苷脫氨酶1+cp及腺苷脫氨酶2。腺苷脫氨酶在動物體內的分布以盲腸、小腸粘膜和脾中含量最高，在纖維細胞、羊水細胞、肝、腎、肺、骨骼肌等處也有發現，血液中ADA主要存在于血細胞中，如紅細胞、淋巴細胞和粒細胞，其活性約為血清中的40 70倍，組織中的腺苷脫氨酶活性在冰凍條件下可保持一周，在組織勻漿中可低溫保存數月之久。腺苷脫氨酶活性是反映肝損傷的敏感指標。慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌患者血清腺苷脫氨酶活性顯著升高。其陽性率達85% 90%，故腺苷脫氨酶活性測定可作為慢性肝病的篩選指標。失代償期肝硬化腺苷脫氨酶活性明顯高于代償期肝硬化，因而可判斷慢性肝病的程度。另外，慢性活動性肝炎腺苷脫氨酶活性明顯高于慢性遷延性肝炎，故可用于ニ者的鑒別診斷。ADA檢測方法經過多次改進，形成了目前市場上ADA檢測試劑盒的兩種主要檢測方法，包括連續檢測法和酶偶聯法。最早的ADA檢測原理是ADA將腺苷脫氨產生次黃苷和氨。低的底物濃度達不到底物飽和要求，造成ADA活性檢測失真。因此，該法不適用于臨床應用。隨后發展的第二代ADA檢測原理為腺苷脫氨酶催化腺嘌呤核苷水解，產生次黃嘌呤核苷和氨。此方法所需試劑易配制，儀器簡単，但靈敏度低，易受外源性NH3影響，空白過高，不能直接測定紅細胞ADA活性。同樣原因，ADA偶聯谷氨酸脫氫酶反應通過測量340nm處NADPH吸光度下降的速度來測算ADA活性。該法也因血清含氨干擾，以及測試系統中過高NADPH造成非特異性氧化而無成算。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測人腺苷脫氨酶(ADA)的檢測試劑盒。該試劑盒結果準確性強、試劑穩定性好、使用方便、便于大規模推廣。本發明的另ー目的是提供上述檢測試劑盒的生產制備及使用方法。為實現上述目的，本發明提供的試劑盒組成為
I.甘氨酸緩沖液、2.顯色劑、3.嘌呤核苷磷酸化酶、4.黃嘌呤氧化酶、5.過氧化物酶、
6.腺嘌呤核苷、7. 4-氨基安替比林溶液。。本發明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下(a)按下列比例配制好試劑
甘氨酸緩沖液80mmol/L
顯色劑10mmol /I,
嘌呤核苷磷酸化酶O. 5-1KU/L
黃嘌呤氧化酶O. 8-1KU/L 過氧化物酶O. 6-1KU/L
腺嘌呤核苷30mmol/L
4-氨基安替比林溶液lOmmol/L
(b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應；
(c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值；
Cd)根據吸光度變化值計算出樣本中腺苷脫氨酶的濃度。本發明試劑盒的獨特性在于，顯色劑為含有3-甲基-N，N_ニ丙磺酸鈉苯胺的磷酸鹽緩沖液，4-氨基安替比林溶液為含有4-氨基安替比林的氯仿溶液。經過一系列反應后，可形成醌類化合物，具有顯色效果好、反應迅速、穩定的有點。
具體實施例方式下述實施例是為了更詳細的解釋本發明，但不應理解為本發明局限于此。實施例I :
本發明的試劑盒舉例可以是雙試劑，其中
試劑I:
甘氨酸緩沖液80mmol/L
顯色劑10mmol /I,
嘌呤核苷磷酸化酶O. 5KU/L
黃嘌呤氧化酶O. 8KU/L
過氧化物酶O. 6KU/L
試劑2
腺嘌呤核苷30mmol/L
4-氨基安替比林溶液lOmmol/L
其中
(1)甘氨酸緩沖液為35mM甘氨酸，O.05%吐溫-20，IOmMこニ胺四こ酸ニ鈉，O. 05%硫柳汞，O. 4M NaCl，ρΗ6· 5-10 ；
(2)顯色劑為含有20mM3-甲基-N，N-ニ丙磺酸鈉苯胺的磷酸鹽緩沖液；
(3)4-氨基安替比林溶液為含有25mM 4-氨基安替比林的氯仿溶液。實施例2 :試劑盒使用方法
I.試劑準備，試劑可為液體雙試劑，開瓶即用，其中
試劑I:
甘氨酸緩沖液80mmol/L
顯色劑10mmol /I,
嘌呤核苷磷酸化酶O. 5KU/L黃嘌呤氧化酶O. 8KU/L
過氧化物酶O. 6KU/L
試劑2
腺嘌呤核苷30mmol/L
4-氨基安替比林溶液lOmmol/L 2.全自動生化儀參數設置
(a)檢測溫度37°C
(b)檢測波長主波長為550nm;副波長為700 nm ；
(c)反應時間10分鐘，其中，溫育時間5分鐘，反應時間3分鐘，檢測時間2分鐘。3.檢測步驟(全部在全自動生化分析儀中完成)
(a)取180 μ L試劑I和5 μ L血清樣本混勻。(b)將混勻后的溶液在37°C溫育5分鐘。(c)添加60 μ L試劑2，反應3分鐘后，在550nm條件下檢測2分鐘的吸光度變化。4.通過吸光度變化的計算出腺苷脫氨酶的濃度。本發明具有的優點
該試劑盒結果準確性強、試劑穩定性好、使用方便、便于大規模推廣。所需檢測儀器(生化分析儀)在各大醫院和檢測中心普遍使用。
權利要求
1.ー種腺苷脫氨酶檢測試劑盒，其組成為 甘氨酸緩沖液、顯色劑、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶、腺嘌呤核苷、4-氨基安替比林溶液。
2.權利要求I的試劑盒，其特征在于 甘氨酸緩沖液為15-45mM甘氨酸，O. 05%吐溫-20，IOmMこニ胺四こ酸ニ鈉，O. 05%硫柳汞，O. 4M NaCl，ρΗ6· 5-10 ； 顯色劑為含有20mM 3-甲基-N，N- ニ丙磺酸鈉苯胺的磷酸鹽緩沖液； 4_氨基安替比林溶液為含有20-30mM 4-氨基安替比林的氯仿溶液。
3.上述試劑盒的制備和操作方法，主要步驟為 (a)按下列比例配制好試劑 甘氨酸緩沖液80mmol/L 顯色劑10mmol /I, 嘌呤核苷磷酸化酶O. 5-1KU/L 黃嘌呤氧化酶O. 8-1KU/L 過氧化物酶O. 6-1KU/L 腺嘌呤核苷30mmol/L 4-氨基安替比林溶液lOmmol/L (b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應； (c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值； Cd)根據吸光度變化值計算出樣本中腺苷脫氨酶的濃度。
4.權利要求3的方法，其特征在于，被測樣品與試劑比例應控制在I:45到I :60之間。
5.權利要求3的方法，其特征在于，反應溫度為37(±1)で。
6.權利要求3的方法，其特征在于，反應時間為10-15分鐘。
7.權利要求3的方法，其特征在于，用半/全自動生化分析儀檢測的主波長為550nm，副波長為700 nm。
8.權利要求3的方法，其特征在于，試劑可配置成單試劑、雙試劑或三試劑。
全文摘要
一種檢測人腺苷脫氨酶(ADA)的檢測試劑盒。試劑盒盒體內包括甘氨酸緩沖液、3-甲基-N，N-二丙磺酸鈉苯胺配制的顯色劑、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶、腺嘌呤核苷、4-氨基安替比林溶液。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列反應，再將反應物置于半/全自動生化分析儀下，檢測主波長550nm處吸光度變化的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的濃度大小。本試劑盒具有準確、穩定、方便的優點。
文檔編號C12Q1/26GK102747133SQ20121026126
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者張雷 申請人:北京恩濟和生物科技有限公司