專利名稱：一種豬嵴病毒rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及豬的一種病毒抗原檢測試劑盒，具體說是一種豬嵴病毒核酸RT-PCR快速診斷試劑盒。
背景技術：
豬嵴病毒(Porcine Kobuvirus)是一種無囊膜正鏈RNA病毒,屬小RNA病毒科、嵴病毒屬，嵴病毒屬包括人愛知病毒(Aichi virus)、牛嵴病毒(Bovine kobuvirus)和豬嵴病毒(Porcine kobuvirus)等。自2008年豬嵴病毒在匈牙利被報道后,在中國、泰國、朝鮮、韓國、巴西和荷蘭等國家都被檢出。根據有關資料顯示豬嵴病毒在我國豬群中的感染率也較高，且在臨床表現為腹瀉癥狀的豬中陽性率要明顯高于無腹瀉癥狀的豬[2]。目前普遍認為該病毒可能與仔豬腹瀉相關，但在其病毒結構和功能、發病機理、致病性等方面還存在許 多問題尚未得到解決。豬嵴病毒廣泛分布于豬群中，3周齡以內的小豬感染率最高，且在糞便中的檢出率遠遠高于血清。雖然豬嵴病毒的致病性尚未確定，但有報道指出，在對腹瀉豬糞便樣品進行的病原分子檢測中，主要引起豬腹瀉的豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉均為陰性，少數輪狀病毒呈陽性，而豬嵴病毒的陽性率最高，初步推測該病毒可能與仔豬腹瀉相關。因此，研發一種針對豬嵴病毒的快速準確RT-PCR檢測試劑盒，對于我國豬群中嵴病毒分子流行病學調查和其他相關研究意義重大。

發明內容
本發明的目的在于提供一種豬嵴病毒核酸RT-PCR檢測試劑盒。根據豬嵴病毒保守的3D RNA聚合酶區域，設計特異性病毒核酸引物，用RT-PCR的方法，對豬群中豬嵴病毒的感染情況進行監測。該試劑盒所用時間相對較少，靈敏度高，適用于豬嵴病毒病原的快速診斷，可為豬嵴病毒的分子流行病學調查及相關研究提供相關技術支持。為了達到以上目的，本發明采取以下技術方案試劑盒的組成及使用方法I.試劑盒的組成按照每個試劑盒檢測20個樣品計，每次檢測樣品時設陽性、陰性對照，試劑盒組成陽性對照模板豬嵴病毒陽性樣品抽提RNA，逆轉錄后獲得的cDNA，共20ul，每次Iul ；陰性對照樣品SPF豬糞便樣品和PBS按SPF豬糞便樣品的重量PBS的體積=0. 5 I. O :1加入PBS混勻，3000r/min離心15min，取上清液抽提RNA，逆轉錄后獲得的cDNA，共 20ul，每次用 Iul ；上游引物Pl和下游引物P2濃度均為lOpmol/ul，各30ul，每個樣品各用0. 5ul ；上游引物PI : 5 ’ -CGTCTCATTGGAGATGAACG-3 ’ ；
下游引物P2 :5’ -TTTGTCGTAGAACTCCTTGA-3，；
2XTaq PCR Master Mix :300ul,每個樣品用 5ul ；
ddH20 :200ul,每個樣品用 3ul ；
礦物油600ul，每個樣品加10ul。
2.使用方法
反應體系2XTaqPCR Master Mix 5ul、ddH203ul、上游引物 P1、下游引物 P2 各 O. 5ul、反轉錄模板Iul、礦物油IOul ；
PCR 反應條件95°C 5min;95°C 30s、50°C 30s、72°C 30s (反應 30 個循環)；最后 72°C延伸 IOmin0
本發明與現有技術相比有以下優點靈敏度高，最低可以檢測Ipg病毒核酸；檢測時間短。


圖I :PCR擴增電泳圖，M marker DL2000 ；1 :豬嵴病毒；2 :陰性對照；
圖2 :特異性實驗，M marker DL2000 ；1 :豬嵴病毒2 :豬藍耳病毒3 :豬偽狂犬病毒4:豬瘟病毒5 :豬傳染性胃腸炎病毒6 :豬流行性腹瀉病毒7 :豬輪狀病毒。
圖3 :敏感性實驗，M marker DL2000 ；1 H20 ；2 lpg ；3 10pg ；4 IOOpg ；5 lng ；6 10ng7 IOOng ；具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
實施例I
(I)設計病毒特異引物
上游引物Ei : 5 ’ -CGTCTCATTGGAGATGAACG-3，；
下游引物四5，-TTTGTCGTAGAACTCCTTGA-3，；
(2)病毒總RNA提取采集腹瀉仔豬糞便，取O. 5-lg糞渣加入Iml PBS混勻， 3000r/min離心15min,取上清液O. 3ml進行RNA提取。首先在上清液中加入750ul trizol 變性液，振搖直至變粘稠，室溫放置5min ；4°C，12000r/min離心5min ;取上清液加入1/5體積(約O. 2ml)氯仿,劇烈振蕩15s,室溫靜置5min ；4°C, 12000r/min離心15min ;取上層水相，加入等體積(約600ul)異丙醇,室溫靜置IOmin ;4°C, 12000r/min離心IOmin,沉淀RNA ； 小心棄盡上清，用冰冷的75%乙醇Iml洗漆沉淀,混懸后，4°C, 12000r/min離心5min。小心棄盡上清；超凈臺內風干RNA沉淀，直至沒有酒精氣味；用無Rnase的滅菌雙蒸水20ul溶解沉淀，4 °C保存備用。
(2)逆轉錄，反應體系5XBuffer 2ul、RT Enzyme Mix 0. 5ul、Oligo dT Prime (50uM) 0. 5ul> Random 6 mers (IOOuM) 0. 5ul> Total RNA 3ul、RNase Free ddH20 3. 5ul ;反應條件37°C 20min、85°C 5min。
(3) PCR 反應體系2XTap PCR Master Mix5ul、ddH20 3ul、上下游引物 P1、P2 (濃度為lOpmol/ul)各0. 5ul、反轉錄模板lul、礦物油10ul。
(4) PCR :反應條件95°C 5min，95°C 30s、50°C 30s,72°C 30s (反應 30 個循環)，最后72°C延伸IOmin。I %瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物，結果(見圖I)顯示約在285bp出現特異性擴增條帶。
(5)特異性實驗用以上方法對豬藍耳病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、豬鏈球菌、豬巴氏桿菌和大腸桿菌陽性模板進行PCR擴增，驗證本方法特異性。結果(見圖2)顯示本方法能夠特異性的擴增豬嵴病毒基因，而其陽性模板均為擴增產物出現。
(6)敏感性實驗將提取的病毒核酸用紫外分析儀測定濃度后，用雙蒸水做10倍倍比稀釋，取每個稀釋度的病毒模板按上述體系及方法進行PCR反應，驗證本方法的敏感性。結果(見圖3)顯示本方法可以有效檢測出豬嵴病毒最低核酸濃度為lpg。
實施例2試劑盒的組成
按照每個試劑盒檢測20個樣品計，每次檢測樣品時設陽性、陰性對照，試劑盒組成包括
陽性對照模板豬嵴病毒陽性樣品抽提RNA，逆轉錄后獲得的cDNA，共20ul，每次 Iul ；
陰性對照樣品SPF豬糞便樣品和PBS按SPF豬糞便樣品的重量PBS的體積= O. 5 I. O I加入PBS混勻，3000r/min離心15min，取上清液抽提RNA，逆轉錄后獲得的 cDNA，共 20ul，每次用 Iul ；
上游引物Pl和下游引物P2濃度均為lOpmol/ul，各30ul，每個樣品各用O. 5ul ；
2XTaq PCR Master Mix :300ul,每個樣品用 5ul ；
ddH20 :200ul,每個樣品用 3ul ；
礦物油600ul，每個樣品加10ul。
2.使用方法
反應體系2XTaqPCR Master Mix5ul、ddH203ul、上游引物 P1、下游引物 P2 各O.5ul、反轉錄模板lul、礦物油IOul ；
PCR 反應條件％°C 5min ；95°C 30s,50°C 30s,72°C 30s (反應 3O 個循環);最后 72°C延伸 IOmin0
應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種豬嵴病毒RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，按照每個試劑盒檢測20個樣品計，每次檢測樣品時設陽性、陰性對照，試劑盒組成陽性對照模板豬嵴病毒陽性樣品抽提RNA，逆轉錄后獲得的cDNA，共20ul，每次Iul ；陰性對照樣品=SPF豬糞便樣品和PBS按SPF豬糞便樣品的重量PBS的體積=O. 5 1.0:1加入PBS混勻，3000r/min離心15min，取上清液抽提RNA，逆轉錄后獲得的cDNA，共20ul,每次用Iul ；上游引物Pl和下游引物P2濃度均為lOpmol/ul，各30ul，每個樣品各用O. 5ul ；上游引物 Pl :5’ -CGTCTCATTGGAGATGAACG-3’ ；下游引物 P2 :5’ -TTTGTCGTAGAACTCCTTGA-3,；.2 X Taq PCR Master Mix :300ul，每個樣品用 5ul ；ddH20 :200ul,每個樣品用 3ul ；礦物油600ul，每個樣品加IOul。
全文摘要
本發明公開了一種豬嵴病毒RT-PCR檢測試劑盒，按照每個試劑盒檢測20個樣品計，每次檢測樣品時設陽性、陰性對照，試劑盒組成陽性對照模板；陰性對照樣品；上游引物P1和下游引物P2濃度均為10pmol/ul，各30ul，每個樣品各用0.5ul；2×Taq PCR Master Mix300ul，每個樣品用5ul；ddH2O200ul，每個樣品用3ul；礦物油600ul，每個樣品加10ul。本發明與現有技術相比有以下優點靈敏度高，最低可以檢測1pg病毒核酸；檢測時間短。
文檔編號C12Q1/68GK102925587SQ201210271610
公開日2013年2月13日 申請日期2012年8月2日 優先權日2012年8月2日
發明者徐志文, 趙勤, 朱玲, 李淞, 周璐, 周遠成 申請人:四川農業大學, 四川高金食品股份有限公司