專利名稱：一種利用樹干畢赤酵母固定化細(xì)胞發(fā)酵乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用樹干畢赤酵母固定化細(xì)胞發(fā)酵乙醇的方法。
背景技術(shù)：
在化工領(lǐng)域中，乙醇(俗稱酒精)是一種重要的工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于化工、食品、飲料工業(yè)、軍工、日用化工和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域，并且乙醇作為一種優(yōu)良的燃料(其燃燒值達(dá)到26900 kj/kg)，可以提高燃油品質(zhì)口。如今，在發(fā)酵行業(yè)中，主要采用釀酒酵母生物轉(zhuǎn)化
生產(chǎn)乙醇。·固定化細(xì)胞技術(shù)根據(jù)固定化方法大致分為吸附法、包埋法、共價(jià)法和交聯(lián)法，其中以包埋法應(yīng)用最為普遍。載體是固定化細(xì)胞技術(shù)的核心部分。包埋法中的載體有多種，如聚丙烯酰胺凝膠、海藻酸鈣、角叉菜聚糖、瓊脂糖、明膠等。目前固定化細(xì)胞技術(shù)已成為國際上研究的熱點(diǎn)之一，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)及化學(xué)分析等諸多領(lǐng)域。海藻酸鈣是迄今應(yīng)用最為廣泛的一種固定化載體。它具有網(wǎng)格孔隙大、傳質(zhì)阻力小、制備方法簡單及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。但其強(qiáng)度較差，使用壽命短。這主要是由于培養(yǎng)基中的磷酸鹽逐漸使海藻酸鈣凝膠破裂和解體。延長海藻酸鈣凝膠使用壽命的處理方法較多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用樹干畢赤酵母固定化細(xì)胞發(fā)酵乙醇的方法，本發(fā)明以樹干畢赤酵母為出發(fā)菌株，利用海藻酸錳凝膠代替海藻酸鈣，固定化酵母使用壽命明顯增加。I. 一種利用樹干畢赤酵母固定化細(xì)胞發(fā)酵乙醇的方法，其特征在于發(fā)酵時，將固定化凝膠球用無菌水洗3次后，移入發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵容器為250 mL三角瓶，發(fā)酵液體積與凝膠球的堆積體積之比為3 :2，其中發(fā)酵液體積為50 mL，總體積為80 mL ;將三角瓶置于恒溫振蕩器中，在35°C、150 r/min條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。2.步驟I所述的固定化細(xì)胞的制備與增殖方法為將試管斜面菌種接入液體酵母細(xì)胞培養(yǎng)基，在30°C、150 r/min條件下活化2 d，取2 mL菌液與海藻酸鈉溶液(68 mL)于常溫下混合，注入2% CaCl2A溶液中，固化4 h，用無菌水將固化后的海藻酸鈣凝膠球(直徑2 3 mm)洗3次(每次50 mL)，移入I. 2% MnSO4溶液中，放置冰箱(4°C )固化24 h。將固定化好的凝膠球(直經(jīng)約3 mm)置于增殖培養(yǎng)基中，在30°C、150 r/min條件下增殖培養(yǎng)，12 h更換一次新鮮培養(yǎng)液，共增殖4次。3.步驟I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30. 0 g/L，木糖30. 0 g/L，CaCl2 2. 5 g/L，MgSO4 0. 25 g/L, KH2PO4 2.5 g/L，培養(yǎng)基 pH 5. 0。4.步驟2所述的固定化增殖培養(yǎng)基為葡萄糖30. 0 g/L，木糖30. 0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，酵母汁 2. 5 g/L, CaCl2 2.5 g/L，MgSO4
0.25 g/L, KH2PO4 2.5 g/L，培養(yǎng)基 pH 5.0。5.步驟2所述的酵母細(xì)胞培養(yǎng)基為木糖20. 0 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，酵母汁3. 0g/L，培養(yǎng)基 pH 5.0。6.步驟2所述的海藻酸錳、海藻酸鋁的固定化細(xì)胞耐磷酸鹽能力提高3倍。7.步驟2所述的當(dāng)MnSO4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 3%時，形成的海藻酸錳固定化酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵最佳。8.步驟2所述的當(dāng)pH為5. 5時海藻酸錳固定化細(xì)胞乙醇發(fā)酵較適宜。9.步驟2所述的海藻酸錳固定化細(xì)胞乙醇發(fā)酵要比海藻酸鋁固定化細(xì)胞乙醇發(fā)酵穩(wěn)定時間長6 d。本發(fā)明利用Mn2+對Ca2+置換法，將低濃度的樹干畢赤酵母細(xì)胞固定，通過增殖培養(yǎng)，能高效地同步發(fā)酵戊糖和己糖，形成的海藻酸錳固定化酵母細(xì)胞耐磷酸鹽能力顯著增強(qiáng)，其使用壽命顯著增加。為固定化細(xì)胞乙醇發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。


圖I MnSO4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化細(xì)胞乙醇發(fā)酵糖利用率的影響。圖2海藻酸鈣、海藻酸鋁、海藻酸錳固定化細(xì)胞的乙醇發(fā)酵。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明所用的菌株為樹干畢赤酵母，購買于CICC，編號為CICC1960。實(shí)施例I
本實(shí)施案例說明固定化凝膠顆粒耐磷酸鹽能力，試驗(yàn)通過Mn2+對Ca2+置換法，形成的海藻酸錳固定化酵母細(xì)胞耐磷酸鹽能力明顯增強(qiáng)。試驗(yàn)過程為分別稱取I g固定化凝膠顆粒，溶于50 mL濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽中性緩沖液中，于35°C條件下，間歇振蕩，確定固定化凝膠顆粒開裂及溶解的時間，以測試凝膠顆粒耐磷酸鹽能力，結(jié)果見表I。從表I可見，海藻酸鈣凝膠顆粒中添加劑不同，其耐磷酸鹽能力也不同。添加活性炭的固定化凝膠顆粒耐磷酸鹽能力沒有明顯提高，由于活性炭表面積比較大且具有多孔性，添加到海藻酸鈣凝膠顆粒里，增加了固定化細(xì)胞的通透性，但其耐磷酸鹽能力提高不多，開裂時間為30 min，比空白多l(xiāng)Omin，溶解時間均為120 min。添加SiO2比Al2O3效果要好，耐磷酸鹽能力提高2倍，而采用置換法形成海藻酸錳、海藻酸鋁的固定化細(xì)胞耐磷酸鹽能力增強(qiáng)顯著，因?yàn)镸n2+、A13+把Ca2+從海藻酸鈣凝膠顆粒中置換出來，磷酸鹽對海藻酸錳、海藻酸鋁的凝膠顆粒破壞性減少，故海藻酸錳、海藻酸鋁的固定化細(xì)胞耐磷酸鹽能力提高3倍。表I固定化細(xì)胞凝膠顆粒耐磷酸鹽能力
實(shí)驗(yàn)號I添加物I添加物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(％) I凝膠顆粒溶解時間/min I凝膠顆粒破裂時間/min
1- Al2O3 (A)TTo' 14040
2_ Al2O3 (B)~0' 14040
3"MnCl2(A)~0_300180
4_ MnCl2 (B)~0' 12030
5_ SiO2 (A)~0_24060
6~Si02 (B)~0_24070
7_ 活性炭(A)1.0T2030~
8_ 活性炭(B)1.0T2030~
9I 空白|/|l20|20
權(quán)利要求
1.一種利用樹干畢赤酵母固定化細(xì)胞發(fā)酵乙醇的方法，其特征在于發(fā)酵時，將固定化凝膠球用無菌水洗3次后，移入發(fā)酵培養(yǎng)基中；發(fā)酵容器為250 mL三角瓶，發(fā)酵液體積與凝膠球的堆積體積之比為3:2，其中發(fā)酵液體積為50 mL，總體積為80 mL ;將三角瓶置于恒溫振蕩器中，在35°C、150 r/min條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，固定化細(xì)胞的制備與增殖方法為將試管斜面菌種接入液體酵母細(xì)胞培養(yǎng)基，在30°C、150 r/min條件下活化2 d，取2 mL菌液與68mL海藻酸鈉溶液于常溫下混合，注入2% CaCl2A溶液中，固化4 h，用無菌水將固化后的直徑2 3 mm海藻酸鈣凝膠球洗3次，每次50 mL,移入I. 2% MnSO4溶液中，放置4°C冰箱固化24 h;將固定化好的直經(jīng)3 mm凝膠球置于增殖培養(yǎng)基中，在30°C、150 r/min條件下增殖培養(yǎng)，12 h更換一次新鮮培養(yǎng)液，共增殖4次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30.O 8/1，木糖30.0g/L, CaCl2 2.5 g/L, MgSO4 O. 25 g/L, KH2PO4 2.5 g/L，培養(yǎng)基 pH 5. 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，固定化增殖培養(yǎng)基為葡萄糖30.0g/L,木糖 30. O 8/1，蛋白胨3.0 8/1，酵母汁2.5 g/L, CaCl2 2. 5 g/L，MgSO4O.25 g/L, KH2PO4 2.5 g/L，培養(yǎng)基 pH 5.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，酵母細(xì)胞培養(yǎng)基為木糖20.0g/L，蛋白胨5. O 8/1，酵母汁3.0 g/L，培養(yǎng)基pH 5.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，海藻酸錳、海藻酸鋁的固定化細(xì)胞耐磷酸鹽能力提高3倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，當(dāng)MnSO4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I.3%時，形成的海藻酸錳固定化酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，當(dāng)pH為5.5時海藻酸錳固定化細(xì)胞乙醇發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用樹干畢赤酵母固定化細(xì)胞發(fā)酵乙醇的方法，本發(fā)明以樹干畢赤酵母為出發(fā)菌株，利用海藻酸錳凝膠代替海藻酸鈣，固定化酵母使用壽命明顯增加。
文檔編號C12N11/04GK102787143SQ201210311939
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者石大勇 申請人:太倉同濟(jì)化工原料廠