專利名稱：一種香菇l9319菌種的ssr標記指紋圖譜與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于香菇菌種的檢測領域，特別涉及一種香菇L9319菌種的SSR標記指紋圖譜與應用。
背景技術：
我國香菇產量已從1983年的I. 95萬噸迅速發展到2005年的242萬噸，占全球香菇總產量的70%以上，改寫了世界食用菌產量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產量差距，有專家預測，由于中國香菇產業的迅猛發展，在近10年內其將成為世界產量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發展速度，優質的品質及低廉的成本為世界菇業人士矚目，中國香菇已風靡世界。
優質菌種在香菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產業中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產權，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑒定技術，為新品種登記奠定基礎。尤其日本2004年4月I日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構成了極大的威脅。就國內而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現象，不僅給菇農帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發展；而且，隨著大規模的エ廠化栽培方式的出現，對香菇栽培菌株質量的要求越來越高，需要發展更為簡便、快速、準確的菌株鑒定技木，以保證每批次的用種都準確無誤。面對這種局勢，就需要我們進一歩加快菌種鑒定技術的研究，在香菇的研究中引進更為有效的菌種鑒定體系。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種香菇L9319菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用，該指紋圖譜與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復性好的優點。本發明的一種香菇L9319菌種的SSR標記指紋圖譜，該指紋圖譜由7對SSR標記組成，是基于香菇基因組簡單重復序列片段開發SSR引物，擴增帶型好，重復性高的SSR引物，標記詳細信息如表I。表I SSR標記詳細信息列表
引物名稱擴增的重復序列正/反_引物Tm(°°)
LefpOOO I (CT)7ACGCGTATCCTCCCCTAAG17OU
A AGCG ATATGG ATTTGACGC

Le_fp0002(CGAQ6GGGCGAAACAATTTCAGGTA/60
—ATGCCATCGTAAGGAACTCG
Le fp0()03(CT)9ATTGTGACTCGACCACCTCC/GU
—TCATAATGCATCCCGTGAGA
I.e_fp0004(AGGT)5CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/60
~AACCGGAGTGGTCTAAGTGC
Le_fp0005(TAC' )7tatgtaga( GG AT )6C:ATCAACCAAA(.:CAAGATTC:AA/ 60
TTCCAATTTCCTCCGAGTCA
Le_fp0006(TCA )6CATGGGAGAGATTCGGAAAA/OU
—CGAGACCGACGACTTTGACTLe_fp0007(CTC)6CATTGCTCGGATCCTTCATT/60
—TACCTCGTGCGGACTTTGAT本發明的一種香菇L9319菌種的SSR標記指紋圖譜的應用，是利用香菇基因組簡單重復序列片段開發的7對SSR引物，通過對收集的25份國審香菇栽培品種的SSR引物帶型擴增，本發明確定了 7對SSR引物在香菇L9319菌種中擴增出的等位片段的數量并編號(表2)，通過不同SSR等位片段的編號組合可有效識別L9319菌種(圖2_8)。通過對照50bpDNA ladder可確定各SSR引物擴增的等位片段的相對分子量，存在L9319菌種特異SSR等位片段組合的菌種，即是香菇L9319菌種，該菌種的編號組合為11 (1+2)11 (1+2) (1+2)。表2 SSR引物擴增的等位片段信息匯總表

序P丨輪々新，て/丨輪等位片段編號及其相對于
號j I物福正Ix向j丨物き的數5卿DNA ladder的分子量
1Le_fp000l 八 CGCGTATCCTCCCCTAAGT/い600bp;
AAGCGATATGGATTTGACC.C
2Le_fp0002 GGGCGAAACAATTTCAGGTA/1^290bp
ATGCC ATCGTA AGG A ACTCG1
3Le_fp0003 ATTGTGACTCG ACCACCTCC/I—>900bp; 2^800^
TCATAATGCATCCCGTGAGA
4I.e_fp0004 CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/い400bp;
AACCGGAGTGGTGTAAGTGC
5Le_tp0005 ('ATCAAfX^AA AC(^AA(；ATTCAA/l-^720bp；
TTCCAATTTCCTCCGAGTCAI
6Le_fp0006 C^'GGGAGAGATTCGGAAAA/l-^SOObp； 2->780hp；
CGAGACCGACGACTTTGACT
7Le_ip0007 CATTGCTCGGATCCTTCATT/ 1^700bp 2—60()bp。_TACCTCGTGCGGACTTTGAT_ _有益效果本發明與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復性好的優點。檢測所需時間只需要3 4天，而常規的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間；該方法在所收集的我國25個通過國審的香菇主栽菌種中具有L9319菌種的專ー性，具有良好的應用前景。


圖I為香菇L9319菌種SSR標記指紋圖譜，其中M是50bp DNA ladder，數字代表的是所用的7對SSR引物，NC是空白對照，箭頭所指的是香菇L9319菌種的特異性SSR等位片段組合；圖2為引物Le_fp0001在所選國審香菇栽培材料中的擴增圖譜；圖3為引物Le_fp0002在所選國審香菇栽培材料中的擴增圖譜；圖4為引物Le_fp0003在所選國審香菇栽培材料中的擴增圖譜；圖5為引物Le_fp0004在所選國審香菇栽培材料中的擴增圖譜；圖6為引物Le_fp0005在所選國審香菇栽培材料中的擴增圖譜；圖7為引物Le_fp0006在所選國審香菇栽培材料中的擴增圖譜；
圖8為引物Le_fp0007在所選國審香菇栽培材料中的擴增圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I(I)菌絲培養將香菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖培養基中，23°C 25°C下避光搖瓶培養，3cT4d后收集菌絲；(2)基因組DNA的提取用CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；CTAB法提取菌絲的基因組DNAエ藝包括①將液氮冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65°C預熱的2XCTAB抽提液，于65°C保溫45 60min，間或輕搖混勻；②12000rpm、4°C離心 20min,取上清液；③在上述上清液中加入體積比為25 24 1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻lOmin，12000rpm、4°C離心lOmin，取上清液移入離心管中；④在上述離心管中加入體積比為24 1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻lOmin，12000rpm、4°C離心lOmin，取上清液移入另ー離心管中；⑤在上述離心管中加入2/3體積(相對于步驟(4)中的上清液)的_20°C預冷的異丙醇，輕輕搖動5min, 8000rpm、4°C離心lOmin,去上清；⑥將得到的沉淀用75vol%こ醇和10mmol/L醋酸鉀洗漆2 3次,每次8000rpm,室溫離心5min ；⑦加入預冷的95vol%こ醇,輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心IOmin,棄こ醇,真空抽干或自然晾干；⑧加入100 UL IOXTE (Tris/EDTA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；⑨加入I ii L 10mg/mL 的 RNaseA 于 37°C水浴 lh，去除 RNA ；⑩將得到的DNA提取物于_20°C冰箱貯藏備用；(3) SSR分子標記的檢測對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增；PCR 擴增體系為總體積 20 ii L，包括10XPCR buffer 2 u L, 25mmol/L MgCl22u L, lOmmol/LdNTP 0. 4u L,5U/u L Taq DNA 酶0. 2 y L，10 y mol/L SSR標記正向引物和反向引物總體積各I. 5 ii L，濃度20ng 30ng/ u L提取的模板DNA 2 u L, ddH20 10. 4uL ；PCR 反應條件94で 5min ；94°C 30second, 55°C 30second, 72°C 30second, 30 個循環；72°C 5min(4)電泳檢測將上述PCR擴增得到的產物與2 ii L加樣緩沖液混勻，于95°C變性5min,結束后置于冰水混合物中冷卻3min，點樣3 u L于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6%，電泳緩沖液為1XTBE，電壓lOOOv，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結果。銀染的具體エ藝為電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8秒，浙干水分后，在銀染液(I. 5克硝酸銀和1500ml水)中避光銀染8分鐘，銀染后，用去離子水水洗5-8秒,浙干水分,放入顯影液(16克氫氧化鈉、1000ml水和8ml甲酸)中，至顯影后取出水洗后即可讀數。 采用7對SSR弓I物對香菇菌株進行PCR擴增，通過對照50bp DNA ladder可確定各SSR引物擴增的等位片段的數量和相對分子量，找到符合編號組合為11 (1+2)11 (1+2)(1+2)的菌種，即可確定該菌種為香菇L9319菌種，如圖I中箭頭標注所示。為保證鑒定的準確性，建議進行三次重復實驗。
權利要求
1.一種香菇L9319菌種的SSR標記指紋圖譜，其特征在于該指紋圖譜由7對基于香菇基因組序列開發的SSR標記的特異等位片段組合而成，7對SSR標記在香菇L9319菌種上擴增的等位片段信息具體為 Le_fp0001的等位片段的數量為1，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為600bp ； Le—fp0002的等位片段的數量為1，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為290bp ； Le_fp0003的等位片段的數量為2，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為900bp，等位片段2相對于50bp DNA ladder的分子量為800bp ； Le_fp0004的等位片段的數量為1，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為400bp ； Le_fp0005的等位片段的數量為1，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為720bp ； Le_fp0006的等位片段的數量為2，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為800bp，等位片段2相對于50bp DNA ladder的分子量為780bp ； Le_fp0007的等位片段的數量為2，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為700bp，等位片段2相對于50bp DNA ladder的分子量為600bp。
2.根據權利要求I所述的ー種香菇L9319菌種的SSR標記指紋圖譜，其特征在于所述7對SSR標記等位片段的特異編號組合為11 (1+2)11 (1+2) (1+2)。
3.—種如權利要求I所述的香菇L9319菌種的SSR標記指紋圖譜的應用，其特征在于應用于鑒定香菇L9319菌種的特異等位變異組合以及鑒定香菇L9319菌種相對于其他國審香菇品種的特異性。
全文摘要
本發明涉及一種香菇L9319菌種的SSR標記指紋圖譜與應用，該指紋圖譜由7對基于香菇基因組序列開發的SSR標記的特異等位片段組合而成。應用包括對香菇菌種進行SSR標記擴增，將得到的帶型與指紋圖譜對照，與該指紋圖譜一致即為香菇L9319菌種。本發明與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短、準確性高、可重復性好的優點，在收集的我國25個國審的香菇主栽菌種中具有香菇L9319菌種的專一性。
文檔編號C12Q1/68GK102851377SQ20121033502
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者章爐軍, 譚琦, 宋春艷, 尚曉冬, 鮑大鵬, 楊慧, 張丹, 巫萍 申請人:上海市農業科學院