專利名稱：使酶催化劑再生的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過在支持物上使酶脫附(detachment)/附接(attachment)來使酶催化劑再生的方法，所述酶附接至其支持物而用于催化反應中。
背景技術：
現今越來越多的工藝使用酶催化劑。大多數情況下，這些工藝需要將酶固定在顆?；腆w支持物上，以用于分批反應或者用于利用固定催化劑床的反應。然而，相比于常規催化劑，酶的壽命有限，并且包含酶的催化劑難以再生。催化劑的再生由以下組成使得用過的酶脫附以及隨后將活性酶附接到支持物上。該操作經常很復雜，特別是對于工業規模來說，在工業規模中使用大量的酶并且酶的成本直接影響所制造產品的價格。實際上，到目前為止，基于酶的催化劑的再生需要將催化劑從反應器中排空，對所述催化劑的支持物進行處理以除去使用過的酶(例如，通過化學處理和/或通過煅燒)，然后將支持物重新裝到反應器中以及最后將新鮮的活性酶附接到支持物上以恢復活性催化劑。由于極大地增加了反應器的停工期， 所以這種方法十分耗時費力且十分昂貴。發明內容
本發明的目的是通過提供一種方法來克服這些缺點，該方法不需要為了更換酶而取出催化劑，也不需要排空包含催化劑的反應器，這一方法縮短了反應器的停工期。
因此，本發明涉及一種使酶催化劑再生的方法，所述酶催化劑布置在包含有基于至少一種金屬氧化物的礦物質支持物和至少一種酶的反應器中，所述方法的特征在于其包括下述步驟至少一個通過用至少一種離子型表面活性劑清掃(scavenge)催化劑所導致的溶劑化將用過的酶脫附直至用過的酶被除去的步驟，以及至少一個通過利用至少一種活性酶溶液清掃所述經凈化的支持物來使得活性酶再附接的步驟，這兩個步驟均在反應器中原位進行。
本方法不僅相對于處理支持物的操作來說節省了時間，而且由于更好地優化了酶催化劑的利用而獲得了經濟上的收益。其還提供了另外的優點，即適于所有類型的被支持的酶以及適于在酶催化反應中使用被支持之催化劑的所有應用。
“酶”是指能夠降低反應活化能并且加快發生在介質中的化學反應而不改變已建立之平衡的分子。它們還提供可在環境溫度下使用的優點。
使酶脫附的步驟包括利用所謂的兩親性離子型表面活性劑的水溶液清掃催化劑， 所述表面活性劑選自單獨或混合使用的燒基橫酸鹽、燒基硫酸鹽、燒基橫基玻拍酸鹽、燒基磷酸酯鹽、烷基苯磺酸鹽和季銨鹽。
銨鹽一般選自式NR1R2R3R4+的鹽，其中R1' R2、R3和R4為包含I至30個碳原子的烷基、芳基、芳烷基或環烷基基團。在后者中，優選四甲基銨鹽、四乙基銨鹽、四丙基銨鹽、 四丁基銨鹽、四戊基銨鹽、四己基銨鹽、芐基三甲基銨鹽、芐基三乙基銨鹽和六烴季銨鹽 (hexamethionium)。膦鹽在結構上的所有方面對應于上述銨鹽。
在酶的脫附步驟中，通過用紫外分光光度法連續或不連續地測定所研究酶在特征性波長下的吸光度，來測量離開反應器的流出液中所帶的酶的量。通常，酶所對應的波長為 280nm(納米)至420nm不等。在所使用的酶為血紅蛋白時,特征性波長為404nm。隨著脫附步驟的進行，流出液中酶的量降低。在所述清掃的整個過程中，通過紫外分光光度法在酶特征性波長下的吸光度所測得的流出液中用過的酶的濃度降低。當反應器的流出液和流進反應器的液體之間的紫外吸光度的測量值的差異變為零時，該步驟結束。在離子型表面活性劑中，優選堿金屬和堿土金屬的烷基硫酸鹽。其選自其中每個燒基基團在線性或分支的鏈燒鏈(paraffinic chain)中包含6至20個碳原子的燒基硫酸鹽，所述鏈優選包含10至16個碳原子。
優選地，燒基硫酸鹽為十_■燒基硫酸的納鹽，也稱作十_■燒基硫酸納(SDS)。將尚子型表面活性劑與水混合地引入反應器中，濃度優選為I至50g/L，更優選I至20g/L。
本發明方法允許使隸屬于由以下六類酶所組成的組中的酶脫附水解酶、轉移酶、 氧化還原酶、異構酶、裂合酶或脫羧酶和連接酶(Iycase)。
在這些酶中，本發明方法特別適于氧化還原酶(特別是血紅素蛋白 (haemoprotein),更優選血紅蛋白)的脫附，。
根據本發明的方法，允許酶脫附和附接的支持物優選基于金屬氧化物的無定形或晶體礦物質支持物，所述金屬氧化物選自包含氧化鋁、二氧化硅、氧化鋯或二氧化鈦的晶體、無定形或復合材料，或者包含這些材料中至少一種的任何復合材料，其比表面積為200 至1000m2/g，優選比表面積為200至600m2/g的二氧化硅和/或氧化鋁。
根據本發明的方法，在上述脫附操作之后，通過用酶溶液清掃經凈化的支持物直至流出液中酶的濃度(即通過紫外分光光度法在所需酶的特征性波長下測定的吸光度)增加并達到與流入液中相同的吸光度，從而獲得酶的再附接。立即或隨后利用相同類型的酶或不同類型的酶進行再附接步驟。
當所測量的流入液與離開反應器的流出液中的酶濃度(由其吸光度表示)的測量值的差異變為零時，終止酶的再附接步驟。事實上，出口處酶溶液的濃度與進入反應器的溶液的濃度相同(即，它們具有相同的吸光度)。
如果在支持物上引入若干性質不同但是彼此相容的酶(所述酶一起或依次引入)，這落在本發明的范圍內。
在本發明的一個優選實施方案中，在使得用過的酶脫附的步驟與使得活性酶附接的步驟之間，所述方法包括用水洗滌反應器中支持物的步驟，以除去用過的酶以及尤其是殘余的表面活性劑。
在該洗滌步驟中，在SDS的波長(260_280nm)下通過紫外分光光度法測量吸光度， 這是因為在酶的再附接之前除去用于脫附的全部SDS是優選的。因為在離開所述反應器的洗滌溶液中檢測到單獨的或與用過之酶相混合的表面活性劑，所以流出液與流入液的吸光度測量值的差異將維持在很高的水平。因此，當所述兩種液流之間的吸光度測量值的差異變為零時(無論其是與SDS的紫外吸光度相關還是與脫附的酶的紫外吸光度相關)，終止洗漆步驟。
根據一個實施方案，當反應器流出液在酶的特征性波長下的吸光度變為零時，終止洗漆。
在再附接步驟后，如果希望在有機介質中使用再生的酶催化劑，那么在干燥開始與結束之間在反應器中進行水/溶劑混合物的循環以及任選地回收剩余的未附接的酶可以是有利的，所述混合物中含有濃度從0%至100%逐漸變化的水以及濃度從100%至0% 逐漸變化的有機溶劑，其中干燥對應于從支持物中完全去除水。該溶劑一般對應于選擇作為反應混合物的溶劑，例如酮、酯和醚。
本發明的第二個主題是本發明方法針對所有酶催化劑的應用，其中所述酶通過低能鍵(如范德華鍵、靜電鍵或氫鍵)附接于支持物。
本發明的第三個主題是根據上述方法再生的催化劑在酶催化中的用途。
具體實施方式
以下給出的實施例和附圖旨在描述本發明的特定實施方案，而不應當被認為是對其范圍的限制。
實施例1
在該實施例中，制備新鮮的酶催化劑。向反應器中裝入8. 4g比表面積為320m2/g ^Davicat(S)SI 1700 二氧化娃(Merck),然后裝入緩沖溶液(pH = 5)中的10g/l的未修飾血紅蛋白(購自Vapran)的溶液。將HPLC泵調節為Iml/分鐘的流速，以便向反應器中引入血紅蛋白溶液，當第一滴血紅蛋白進入反應器時啟動計時器。
定期取進入和離開反應器的液流的樣品，以便測量血紅蛋白濃度，從而通過流入液與流出液之間的測量值的差異來確定被二氧化硅吸附的血紅蛋白的量。因此，利用紫外分光光度法測定流入液和流出液的吸光度，其利用購自Socoman的UV UVIKON XS分光光度計在404nm(對應于血紅蛋白的波長)下測量。以此監測兩種液流之間的吸光度差異作為注入時間的函數。
當然，已經利用不同濃度的血紅蛋白標準水溶液預先對所述紫外分光光度計進行校準。校準曲線給出了紫外吸 光度測量值作為血紅蛋白溶液中血紅蛋白濃度的函數，其用于附接實施例(見

圖1，作為血紅蛋白溶液濃度之函數的404nm下紫外吸光度的校準曲線)。
通過計算在進口與出口的吸光度的測量值的差異變為零之前引入到反應器中的血紅蛋白的量，能夠確定附接在二氧化硅上的血紅蛋白的最大量。圖2示出了相對于引入到反應器中的二氧化硅質量，附接在二氧化硅上的血紅蛋白的量的變化。在該情形中，血紅蛋白對二氧化硅的飽和度為100mg/g 二氧化硅。
因為血紅蛋白在水中可溶(高達100g/l)，所以可以在更高濃度(例如30或50g/ I)重復該實驗，以便減少將血紅蛋白附接到二氧化硅上花費的時間。
實施例2
該實施例描述了血紅蛋白溶液的進入流速對血紅蛋白附接到二氧化硅支持物上的附接速率的影響，以評估支持物對新鮮酶催化劑的吸附性能。
如實施例1，所使用的流入液是10g/l的血紅蛋白水溶液，其流過預先裝填有 8.4g Davicat SI 1700 二氧化硅的反應器。根據實驗，將hplc泵的輸送設定為O. 2至 Iml/分鐘(圖3中，O. 2ml/分鐘、O. 5ml/分鐘、lml/分鐘)，對于其中每一個，當第一滴血紅蛋白溶液進入反應器中時計時器開始計時。
定期取反應器出口的流出液樣品，以便監測血紅蛋白濃度改變，以及由此相對于進入反應器的液體中血紅球蛋白的量，監測保持吸附在二氧化硅支持物上的血紅蛋白的量。如前，由流入液的吸光度(其始終恒定)與流出液的吸光度(其為血紅蛋白溶液注入速率的函數)之間測量值的差異得到吸附在二氧化硅上的血紅蛋白的量。
圖3示出了每克二氧化硅所附接的血紅蛋白量的變化作為血紅蛋白溶液進料泵流速的函數。可見隨著進入反應器的液體流速的增加，二氧化硅上血紅蛋白的吸附速率增加。流速的增加使得能夠減少血紅蛋白使二氧化硅飽和的時間。
實施例3
本實施例描述了在將血紅蛋白從如實施例1所制備的支持物上脫附的步驟中十二烷基硫酸鈉(SDS)的量對反應器入口和反應器出口的血紅蛋白溶液所測吸光度的影響。
為了考慮SDS的存在對血紅蛋白溶液的吸光度測量值的影響，利用紫外分光光度計測量具有不同SDS含量的血紅蛋白溶液在350-550nm的吸光度，以校準儀器。
對O. 25g/l和50g/l兩種血紅蛋白濃度重復這些測量。
圖4顯示，不論流入液中的水中血紅蛋白濃度如何，在SDS的存在下血紅蛋白在 404nm的特征性紫外吸光度均顯著降低。但是，這種變化隨著時間是穩定的。
實際上，SDS的濃度僅對血紅蛋白在404nm的吸光度有非常微弱的影響，此外，無論SDS濃度如何，線性都非常好。
實施例4
本實施例描述了，對于實施例2所制備的催化劑，使附接在二氧化硅上的血紅蛋白脫附的步驟。因此，我們有含93mg/g吸附在二氧化硅上的血紅蛋白的酶催化劑。
在脫附步驟中，利用上述HPLC泵以Iml/分鐘的流速將10g/l的SDS水溶液輸送進反應器。
通過將僅含SDS溶液的流入液與不但含有SDS還含有血紅蛋白的流出液的吸光度進行比較，來測量從二氧化硅上脫附的血紅蛋白的量。
如實施例1所述在SDS的存在下利用血紅蛋白的不同標準溶液校準紫外分光光度計。標準曲線給出了對應于標準溶液中血紅蛋白濃度的吸光度測量值(見圖4)。
在10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘、240分鐘和480分鐘取流出液樣品，以便評價其在404nm下的吸光度以及由此評價反應器出口的血紅蛋白濃度。基于這些測量值，在圖6中示出在脫附期過程中血紅蛋白解吸附的模式圖。
在脫附步驟結束時，88mg血紅蛋白/g 二氧化硅脫附并在反應器出口處被回收，即最初吸附在二氧化硅上的血紅蛋白量的95% .
實施例5
本實施例描述了，在用水洗滌或漂洗反應器直至反應器的流出液中檢測不到SDS 為止的步驟之后，將血紅蛋白再附接在剛剛根據實施例4脫附血紅蛋白的支持物上的步驟。
在該步驟結束時，如實施例2所述地，連續地重新引入10g/l的血紅蛋白溶液，直至進入反應器的液流與反應器出口的流出液的紫外吸光度相同——入口與出口的血紅蛋白內容物相同。
圖5示出了經固定之血紅蛋白的量的變化，顯示了兩個循環的附接。循環I對應于如實施例2所述的附接，循環2對應于在本實施例和實施例4中所述的在脫附和洗滌反應器的步驟之后進行的再附接。
可見，用于制備新鮮催化劑的附接第一循環與酶脫附后第二循環的對應固定模 式圖相重合。因此，對于其固定目的，用SDS處理以將血紅蛋白從二氧化硅上脫附并不導致二氧化硅上血紅蛋白吸附潛力的降低。
權利要求
1.一種使酶催化劑再生的方法，所述酶催化劑布置在包含有基于至少一種金屬氧化物的礦物質支持物和至少一種酶的反應器中，所述方法的特征在于其包括下述步驟至少一個通過用至少一種離子型表面活性劑清掃所述催化劑所導致的溶劑化將所述酶脫附的步驟，以及至少一個通過利用至少一種活性酶溶液清掃所述經凈化的支持物而使得活性酶再附接的步驟，這兩個步驟均在所述反應器中原位進行。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于所述使酶脫附的步驟包括用所謂的兩親性離子型表面活性劑的水溶液清掃所述催化劑，所述兩親性離子型表面活性劑選自烷基磺酸鹽、燒基硫酸鹽、燒基橫基玻拍酸鹽、燒基憐酸酷鹽、燒基苯橫酸鹽和季按鹽。
3.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于在所述清掃的整個過程中，流出液中用過的酶的濃度降低，所述濃度通過紫外分光光度法在所述酶的特征性波長下的吸光度來測定。
4.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于當由其吸光度表示的、所述流出液和進入所述反應器的液流之間酶濃度測量值的差異變為零時，終止所述脫附步驟。
5.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于在所述離子型表面活性劑中，堿金屬烷基硫酸鹽選自每個烷基基團在線性或分支的鏈烷鏈中包含6至20個碳原子、優選10至16個碳原子的烷基硫酸鹽。
6.根據權利要求5的方法，其特征在于所述烷基硫酸鹽是十二烷基硫酸鈉鹽。
7.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于通過所述方法脫附的酶隸屬于以下六類酶水解酶、轉移酶、氧化還原酶、異構酶、裂合酶或脫羧酶和連接酶。
8.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所脫附的酶隸屬于氧化還原酶，特別是血紅素蛋白，更特別優選地，所述酶是血紅蛋白。
9.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述酶的脫附和附接步驟在基于金屬氧化物的無定形或晶體礦物質支持物上進行，所述金屬氧化物選自比表面積為200至IOOOmVg的包含氧化鋁、二氧化硅、氧化鋯或二氧化鈦的結晶、無定形或復合材料或者包含這些材料中至少一種的任何復合材料，優選地，選自比表面積為200至600m2/g的二氧化硅和/或氧化鋁。
10.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述酶的再附接步驟通過下述方式實現用酶溶液對經凈化的支持物進行清掃直至所述流出液中酶濃度增加，即，其在特征性波長下的吸光度增加。
11.根據權利要求10的方法，其特征在于當流入液和離開所述反應器的流出液中所測得的酶濃度測量值的差異變為零時，終止所述酶的再附接步驟。
12.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于，所述方法包括在使得用過的酶脫附的步驟與使得活性酶附接的步驟之間的用水洗滌反應器中支持物的步驟，以除去用過的酶以及尤其是殘余的表面活性劑。
13.根據權利要求12的方法，其特征在于在所述反應器的流出液中酶在特征性波長下吸光度變為零時，終止洗滌。
14.根據前述權利要求中任一項所述方法的應用，其用于使所有酶催化劑再生，其中所述酶通過低能鍵如范德華鍵、靜電鍵或氫鍵附接在支持物上。
15.通過權利要求1至13中任一項的方法再生的催化劑在酶催化中的用途。
全文摘要
一種使酶催化劑再生的方法，所述酶催化劑布置在包含有基于金屬氧化物的礦物質支持物和至少一種酶的反應器中，所述方法的特征在于其包括下述步驟至少一個通過用至少一種離子型表面活性劑清掃催化劑所導致的溶劑化將用過的酶脫附的步驟，以及至少一個通過利用至少一種活性酶溶液清掃所述經凈化的支持物來使得活性酶再附接的步驟，所述兩個步驟均在反應器中原位進行。
文檔編號C12N9/00GK103013935SQ20121036073
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月21日 優先權日2011年9月22日
發明者丹尼爾·托馬斯, 西爾維亞娜·普爾溫, 洛特菲·赫德利, 塞繆爾·杰拉西 申請人:道達爾煉油與銷售部