專利名稱：一種蚓激酶干粉的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種蚓激酶干粉的制備方法，是一種利用生物酶解技術規模化生產蚓激酶干粉的方法，屬于生物制藥領域。
背景技術：
蚓激酶粉是一種以鮮蚯蚓為原料的生物提取藥品，其為淡黃色至黃褐色粉末。本藥品為一組蛋白水解酶，包含纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原激活劑成分，使過高的纖維蛋白原和血小板凝集率降低，改善癥狀并防止病情發展的作用，適用于缺血性腦血管病的治療及預防。臨床試驗證明，本藥的膠囊劑對缺血性腦血管病、中風癱瘓肢體及語言障礙的恢復效果顯著，是一種安全的口服纖溶藥物。治療后病人血漿中的纖維蛋白原濃度降低，優球蛋白溶解時間明顯好轉，同時全血粘度、血漿粘度降低，并且能夠緩解病人的血小板聚集 功能的增強。藥理作用明顯，副作用少，如百奧蚓激酶腸溶膠囊(國藥準字H11021129)。抗血栓藥物市場的集中度很高，蚓激酶在最新的抗血栓藥物主要品種醫院市場份額的排名中位列第五。目前國內的蚓激酶生產具有簡單粗放、自動化程度低、環保壓力大、蚓激酶質量標準比較低等特點。這些特點限制了蚓激酶的規模化生產，不利于蚓激酶產品質量的提高，不能很好的滿足我國重大疾病防治和醫藥產業發展的需求。如專利(ZL03146692. 3)公開了采用包括陰離子交換層析、超濾、凝膠過濾脫鹽等分離方法獲得達電泳級的蛋白酶，生產成本較高，質量控制復雜。專利(ZL200410039186.8)公開了提高蚓激酶有效組分含量的方法，但是總活性不高，收率變化大。以上方法由于缺少有效的前處理方法，層析前中間體純度低，層析載量低，介質污染嚴重，再生頻繁，并且生產規模小，成本高，產品總活性收率低。

發明內容
本發明的目的是提供一種蚓激酶粉的制備方法，適合自動化大生產，用于生產降纖藥物的原料。本發明采用生物酶解方法降低反應體系黏度，快速高效地進行固液分離，通過調節PH值選擇目標蛋白，層析前除去可溶性雜質；提高層析介質的交換容量，延長其使用壽命，降低成本，擴大自動化生產規模，實現自動化的現代生物生產。本發明的進一步目的是提供生物酶類自動化、高收率的生產線。本發明的目的是通過如下的技術方案實現的一種蚓激酶干粉的制備方法，包括如下步驟I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的O. 5 2倍的水，將經步驟I)化凍后的蚯蚓粉碎，制成勻漿；3)生物酶處理將步驟2)得到的勻漿在30 40°C，優選35 40°C保溫，同時加入中性蛋白酶，按蚯蚓重量的O. 1% O. 3%加入勻漿液中，保溫靜置2 6小時，優選保溫靜置2 4小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2 3. 5倍，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，得到一次
澄清液；6)超濾步驟5)得到的澄清液采用中空纖維柱超濾，得到超濾液；7)澄清經步驟6)超濾后的溶液經泵再次打入膜過濾系統，加水洗滌，加水I 2次，得到二次澄清液；8)調節PH :配制O. 5 IM的氫氧化鈉溶液，調整步驟7)得到的澄清液至pH6. 5 8. 5，用PH計監測；9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃色為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水，且溶液電導率g O. 2 X IO3 μ s/cm合格；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除步驟10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一30 一40°C下冷凍10小時，繼續升溫至40 45°C干燥得到蚓激酶干粉。其中，所述步驟2)至步驟8)是完整的預處理過程。在一個優選的實施方式中，所述步驟3)中的中性蛋白酶，為，但不限于，選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶中的一種或者多種。更優選，所述中性蛋白酶為沙雷肽酶和端肽酶中的一種或多種。在一個優選的實施方式中，所述步驟3)采用的生物酶是中性蛋白酶，按蚯蚓重量的O. 1% O. 3%加入，生物酶處理溫度30 40°C，保溫靜置2. O 6. O小時。在一個優選的實施方式中，所述步驟5)中的膜過濾系統操作條件為操作壓力為O. 12MPa、洗脫液流速小于I. 6M3/hr。在一個優選的實施方式中，所述步驟6)超濾是采用標準截流分子量為5K 10K，優選8K的立式膜中空纖維柱進行的。在一個優選的實施方式中，所述步驟8)調整pH6. 5 8. 5預取代磷酸鹽洗脫來獲取目標蛋白。在一個優選的實施方式中，所述步驟12)是將步驟11)的澄清液用冷凍干燥法得到蚓激酶干粉。在一個優選的實施方式中，所述步驟8)調節澄清液至pH7. O 8. 5。本發明提供的方法與已有的技術相比，通過有效的前處理，提高了中間體的純度收率，直接提高層析介質的工作能力，擴大了生產規模。同時，在生產規模擴大的情況下，保證了生產周期沒有明顯變化。其優點在于本發明采用生物酶解及調節PH值的技術，可以有效的降低勻漿液的粘度，同時獲得目標蛋白物，通過反復超濾除去懸浮顆粒物及小分子蛋白、核酸等雜質，不同階段的收集目標蛋白，獲得總活性較高、純度較高的蚓激酶干粉，減少了其它方法生產的蚓激酶粉引起的環保處理、在線監控存在死角等問題；而且本發明提供放大生產可能性。


圖I.蚓激酶現有生產工藝路線流程2.改進后的本發明的生產工藝路線流程圖
具體實施例方式原料和來源本申請所用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶購自安琪酵母股份有限 公司。實施例II)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 1%的量加入沙雷肽酶，控制在35°C，保溫靜置6小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾是采用標準截流分子量為8K的立式膜中空纖維柱進行的；7)澄清步驟6)得到的超濾液經泵再次打入膜過濾系統，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調整pH值采用pH計監測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調節步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃色為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水、小分子物質，且溶液電導率=O. 2Χ103μ s/cm合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除步驟10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時，繼續升溫至42°C干燥得到4. 8Kg蚓激酶凍干粉，收率6. OKg/T,其含水量為5. 6%，酶活力21000IU/mg。實施例2
I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 1%的量加入菠蘿蛋白酶，控制在35°C，保溫靜置6小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；
6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實施例I相同的立式膜中空纖維柱進行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經泵再次打入膜過濾系統，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調整pH值采用pH計監測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調節步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水、小分子物質，且溶液電導率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一38°C下冷凍10小時，繼續升溫至42°C干燥得到4. 8Kg蚓激酶凍干粉，收率6. OKg/T,其含水量為5. 5%，酶活力15200IU/mg。實施例3I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 1%的量加入木瓜蛋白酶，控制在35°C，保溫靜置6小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實施例I相同的立式膜中空纖維柱進行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經泵再次打入膜過濾系統，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調整pH值采用pH計監測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調節步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水、小分子物質，且溶液電導率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時，繼續升溫至 42°C干燥得到4. 8Kg蚓激酶凍干粉，收率6. OKg/T,其含水量為5. 6%，酶活力15000IU/mg。實施例4I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 1%的量加入端肽酶，控制在35°C，保溫靜置6小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實施例I相同的立式膜中空纖維柱進行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經泵再次打入膜過濾系統，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調整pH值采用pH計監測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調節步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水、小分子物質，且溶液電導率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一38°C下冷凍10小時，繼續升溫至42°C干燥得到4. 8Kg蚓激酶凍干粉，收率6. OKg/T,其含水量為5. 6%，酶活力20000IU/mg。實施例5
I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 3%的量加入端肽酶，控制在40°C，保溫靜置3小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3 次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實施例I相同的立式膜中空纖維柱進行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經泵再次打入膜過濾系統，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調整pH值采用pH計監測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調節步驟7)的澄清液的pH至8. 5 ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水、小分子物質，且溶液電導率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一38°C下冷凍10小時，繼續升溫至42°C干燥得到5. 2Kg蚓激酶凍干粉，收率6. 5Kg/T，其含水量為5. 5%，酶活力20000IU/mg。實施例6I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 3%的量加入菠蘿蛋白酶，控制在40°C，保溫靜置3小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實施例I相同的立式膜中空纖維柱進行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經泵再次打入膜過濾系統，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調整pH值采用pH計監測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調節步驟7)的澄清液的pH至8. 5 ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水、小分子物質，且溶液電導率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時，繼續升溫至42°C干燥得到5. 2Kg蚓激酶凍干粉，收率6. 5Kg/T，其含水量為5. 3%，酶活力14300IU/mg。實施例7I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 3%的量加入木瓜蛋白酶，控制在40°C，保溫靜置3小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液；6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實施例I相同的立式膜中空纖維柱進行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經泵再次打入膜過濾系統，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調整pH值采用pH計監測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調節步驟7)的澄清液的pH至8. 5 ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水、小分子物質，且溶液電導率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時，繼續升溫至42°C干燥得到5. 2Kg蚓激酶凍干粉，收率6. 5Kg/T，其含水量為5. 5%，酶活力14000IU/mg。實施例8
I)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將800kg凍蚓室溫放置自然化凍；2)制漿加入蚯蚓體積的I. O倍的水于勻漿罐內，倒入完全解凍的蚯蚓，用勻漿機將蚯蚓粉碎，勻漿2. O小時，形成勻漿液；3)生物酶處理于步驟2)的勻漿液中，按蚯蚓重量的O. 3%的量加入沙雷肽酶，控制在40°C，保溫靜置3小時；4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2. 5噸，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣；5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，每次加水500L洗滌，加水3次，得到一次澄清液； 6)超濾采用中空纖維柱超濾處理步驟5)的一次澄清液，每次加水500L，加水3次，超濾2次，得到超濾液；其中超濾采用與實施例I相同的立式膜中空纖維柱進行；7)澄清步驟6)得到的超濾液經泵再次打入膜過濾系統，每次加水300L，分2次加水洗滌過濾，得到二次澄清液；8)調整pH值采用pH計監測，用O. 5M的氫氧化鈉溶液13L調節步驟7)的澄清液的pH至7. O ;9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O. 3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃為止；10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水、小分子物質，且溶液電導率合格，得到濃縮液；11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除步驟10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到三次澄清液；12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一 38°C下冷凍10小時，繼續升溫至42°C干燥得到5. 2g蚓激酶凍干粉，收率6. 5Kg/T，其含水量為5. 6%，酶活力20000IU/mg。表I使用各生物蛋白酶的酶活力比較
權利要求
1.一種蚓激酶干粉的制備方法，包括如下步驟 1)蚯蚓清洗和解凍將鮮蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后貯存在冷庫中備用；將凍蚓室溫放置自然化凍； 2)制漿加入蚯蚓體積的O.5 2倍的水，將經步驟I)化凍后的蚯蚓粉碎，制成勻漿； 3)生物酶處理將步驟2)得到的勻漿在30 40°C，優選35 40°C保溫，同時加入中性蛋白酶，按蚯蚓重量的O. 1% O. 3%加入勻漿液中，保溫靜置2 6小時，優選保溫靜置2 4小時； 4)離心將步驟3)的勻漿液定量的加水稀釋，最終定容體積至2 3.5倍，通過蝶片式離心機除去其中的粗渣； 5)澄清經步驟4)除渣后的的離心液，輸入到膜過濾系統內，加水洗滌，得到一次澄清液； 6)超濾步驟5)得到的澄清液采用中空纖維柱超濾，得到超濾液； 7)澄清經步驟6)超濾后的溶液經泵再次打入膜過濾系統，加水洗滌，得到二次澄清液； 8)調節PH:配制O. 5 IM的氫氧化鈉溶液，調整步驟7)得到的澄清液至pH6. 5 8. 5，用PH計監測； 9)層析分離采用陰離子交換層析柱分離步驟8)調整PH值后的澄清液，用O.3 O. 9M的磷酸鹽溶液梯度洗脫，洗脫液顏色變成酒紅色時開始收集，洗脫至料液變清澈，顏色呈檸檬黃色或桔黃色為止； 10)超濾濃縮將步驟9)得到的洗脫液經中空纖維柱或自動化層析超濾系統超濾，除鹽脫水，且溶液電導率蘭O. 2 X IO3 μ s/cm合格； 11)澄清過濾采用紙漿板板框過濾裝置，濾除步驟10)得到的濃縮液中的懸浮物質，得到澄清液； 12)凍干在潔凈區將步驟11)的澄清液于一30 一 40°C下冷凍10小時，繼續升溫至40 45°C干燥得到蚓激酶干粉。
2.前述任一項權利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，步驟3)中的所述生物酶為選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶中的一種或者多種。
3.前述任一項權利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，步驟3)中的所述生物酶為選自沙雷肽酶和端肽酶中的一種或者多種。
4.前述任一項權利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟3)于35 40°C保溫靜置2 6小時。
5.前述任一項權利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟3)于35 40°C保溫靜置2 4小時。
6.前述任一項權利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟5)中的膜過濾系統操作條件為操作壓力為O. 12MPa、洗脫液流速小于I. 6M3/hr。
7.前述任一項權利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟6)超濾是采用標準截流分子量為5K IOK的立式膜中空纖維柱進行的。
8.前述任一項權利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟6)超濾是采用標準截流分子量為8K的立式膜中空纖維柱進行的。
9.前述任一項權利要求所述的蚓激酶干粉的制備方法，其特征在于，所述步驟8)調節澄清液至pH7. O 8. 5。
全文摘要
本發明涉及一種蚓激酶干粉的制備方法，該方法包括如下步驟將冷凍后的鮮蚓室溫化凍，制漿，生物酶處理，離心經過濾膜澄清，超濾去除小分子雜蛋白，再經過濾膜二次澄清，調節pH值，經陰離子交換層析，得澄清液濃縮超濾，澄清過濾，凍干，得到蚓激酶干粉。本發明提供的蚓激酶干粉制備方法，具有制備方法質量可控性和穩定性高，分階段、可控的收集目標物，提高蚓激酶的總活性收率，收率穩定，降低制備成本，減少層析介質污染，且易于大規模工業化生產等特點。
文檔編號C12N9/64GK102876652SQ20121037227
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者閆曉玲, 郭燕青, 張波, 呂學富, 王雪, 侯全民 申請人:北京百奧未來生物科技有限公司