專利名稱：一種快速準(zhǔn)確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用分子生物學(xué)的技術(shù)(SRAP)鑒定雜交魚(yú)種的方法，更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種快速準(zhǔn)確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( )]的方法。
背景技術(shù)：
烏體(Channaargus)和斑體(Channa maculate)同屬于S盧形目(Perciformes)體科(Channidae)鱧屬。通過(guò)斑鱧和烏鱧雜交所獲得的雜交鱧系的子一代，具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、病害少、安全質(zhì)量高等優(yōu)勢(shì)，人工養(yǎng)殖過(guò)程可采用人工飼料喂養(yǎng)，大大改善原烏鱧養(yǎng)殖中因采用冰鮮投喂而造成飼料浪費(fèi)及水源污染等問(wèn)題，在珠江三角洲地區(qū)已成為鱧科魚(yú)類中最重要的養(yǎng)殖品種。其中，以斑鱧為母本和烏鱧為父本的雜交鱧，因?yàn)槊绶N 孵化率高、成活率高等優(yōu)勢(shì)，在中國(guó)鱧科魚(yú)類養(yǎng)殖中所占的比重越來(lái)越大。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子標(biāo)記系統(tǒng)，它獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)原則，上游引物可以特異性結(jié)合在基因的外顯子或啟動(dòng)子區(qū)域，下游引物可特異地與基因的內(nèi)含子配對(duì)，針對(duì)基因組的ORF進(jìn)行擴(kuò)增，由于個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。SRAP技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高共顯性、重復(fù)性高、成本低等特點(diǎn)。此技術(shù)在植物方面已經(jīng)大量應(yīng)用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、作物遺傳多樣性分析、基因定位及比較基因組學(xué)等方面。在水產(chǎn)動(dòng)物方面，SRAP在日本沼蝦、梭子蟹及草魚(yú)等方面有所報(bào)道。常規(guī)使用鑒定雜交魚(yú)類的方面，主要從形態(tài)學(xué)方面進(jìn)行鑒定。然而，形態(tài)學(xué)鑒定有時(shí)并不一定準(zhǔn)確，存在很強(qiáng)的主觀因素，并且形態(tài)學(xué)鑒定在苗種期不能鑒定烏鱧、斑鱧與雜交鱧[斑鱧(早)x烏鱧U)]。例如，烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)x烏鱧U)]在形態(tài)學(xué)上，烏鱧易區(qū)別于其它兩種魚(yú)，而斑鱧與雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U)]在形態(tài)學(xué)上很容易混淆，兩者的頭部花紋都呈現(xiàn)“一八八”。本發(fā)明在不處死魚(yú)種的基礎(chǔ)上，只需剪去少量鰭條或其它魚(yú)體組織部分，利用SRAP技術(shù)便很容易區(qū)別烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U)]的方法

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速準(zhǔn)確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧(古)]的方法，以克服現(xiàn)有從形態(tài)學(xué)上鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( )]，存在主觀性強(qiáng)且不能有效地鑒定三種魚(yú)苗種的缺陷，本發(fā)明的鑒定方法更精確，快速。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種快速準(zhǔn)確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)Χ烏鱧U )]的方法，該方法包括步驟I)引物合成步驟根據(jù)2001年由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)-相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，合成引物；2)烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)Χ烏鱧U ) ]DNA的提取步驟剪取三種魚(yú)的胸鰭，用苯酚法提取組織的DNA，把DNA濃度稀釋到20ng/ μ 1，放入-20°C以下保存；3) SRAP-PCR反應(yīng)步驟，其中SRAP-PCR反應(yīng)采用復(fù)性變溫法；具體是指擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性3min ;94°C預(yù)變性45s，35°C退火45s，72。。延伸lmin，共5個(gè)循環(huán)；94°C預(yù)變性45s，50°C退火45s，72。。延伸lmin，共35個(gè)循環(huán);72°C延伸IOmin ;4°C保存；4)電泳檢測(cè)步驟用I. 5%瓊脂糖檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，篩選能用于鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧(￠)]的引物組合，并在其它采樣的群體中驗(yàn)證；5)用Gelpix)32軟件處理?xiàng)l帶，并根據(jù)擴(kuò)增出的特異性條帶來(lái)鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧。能夠擴(kuò)增出694，268兩條帶的樣本為烏鱧，只擴(kuò)增出500 —條帶的樣本為斑鱧，而同時(shí)能夠擴(kuò)增出以上三條帶的為雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U )]。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟I)中所用引物為5個(gè)Me與6個(gè)Em組合，共30對(duì)引物。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟I)中引物的使用濃度為20μΜ。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟2)烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U )]中DNA的提取包括步驟I)取樣本的少量胸鰭，用眼科剪剪碎，放入I. 5ml離心管中；2)加入裂解液，裂解液包括 Tris-HCl 25 μ I, SDS 50 μ I, EDTA ΙΟΟμΙ，無(wú)菌水320 μ 1，蛋白酶K 6-10 μ I ;放入55°C水浴中裂解2-4小時(shí)，變澄清即可；3)加入與裂解液體積相等的飽和苯酹,搖勻lOmin, 12000rpm時(shí)，4°C離心20min ；4)提取上清液，向提取的上清液中補(bǔ)充無(wú)菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的飽和苯酹，搖勻lOmin, 12000rpm時(shí)，4°C離心20min ；5)提取上清液，向提取的上清液中補(bǔ)充無(wú)菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的苯酚、氯仿及異戊醇混合物，其中苯酚、氯仿及異戊醇的比例為25 24 :1，搖勻 lOmin, 12000rpm 時(shí)，4°C離心 20min ；6)提取上清液，向提取的上清液中補(bǔ)充無(wú)菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的氯仿與異戊醇的混合物，其中氯仿與異戊醇的比例2 4 :1，搖勻lOmin, 12000rpm 時(shí)，4°C離心 20min ；7)提取上清液，加入雙倍體積的冰凍無(wú)水酒精，有絮狀沉淀生成，如暫無(wú)絮狀沉淀時(shí)，置 _20°C 中存放 30min, 7000rpm 時(shí),4°C離心 8min ；8)緩緩倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70%冰凍酒精洗一次，7000rpm時(shí)，4°C離心8min ；9)緩緩倒掉70%冰凍酒精，自然干燥1-2小時(shí)后，用100 μ I無(wú)菌水溶解，_20°C備用。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟2)中，Tris-HCl水溶液的摩爾濃度為1M，pH值為8.0。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟2)中，SDS的濃度為10%。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟2)中，EDTA水溶液的摩爾濃度為O. 5M。本發(fā)明與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相比，提供一種快速準(zhǔn)確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧(￠)]的方法，以克服現(xiàn)有從形態(tài)學(xué)上鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( )]，存在主觀性強(qiáng)且不能有效地鑒定三種魚(yú)苗種的缺陷，本發(fā)明的鑒定方法更精確，客觀。


圖I為用Gelpro32軟件處理?xiàng)l帶擴(kuò)增出的特異性條帶圖。其中A為引物Me3_Em5的組合，B為引物Me4-Em5的組合；1_5雜交鱧，6-10斑鱧，11-15烏鱧，M-D2000。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例I.引物合成根據(jù)2001年由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)-相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，合成引物序列編號(hào)為附表I ;
附表I
權(quán)利要求
1.一種快速準(zhǔn)確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧的方法，其特征在于，包括步驟 O引物合成步驟根據(jù)2001年由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)-相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，合成引物； 2)烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( ) ]DNA的提取步驟剪取三種魚(yú)的胸鰭，用苯酚法提取組織的DNA，把DNA濃度稀釋到20ng/ μ 1，放入-20°C以下保存； 3 ) SRAP-PCR反應(yīng)步驟，其中SRAP-PCR反應(yīng)采用復(fù)性變溫法；具體是指擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性3min ;94°C預(yù)變性45s，35°C退火45s，72°C延伸lmin，共5個(gè)循環(huán)；94°C預(yù)變性45s，50° C退火45s，72。。延伸lmin，共35個(gè)循環(huán);72°C延伸IOmin ;4°C保存； 4)電泳檢測(cè)步驟用I.5%瓊脂糖檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，篩選能用于鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( )]的引物組合，并在其它采樣的群體中驗(yàn)證； 5)用Gelpro32軟件處理?xiàng)l帶，并根據(jù)擴(kuò)增出的特異性條帶來(lái)鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧。能夠擴(kuò)增出694，268兩條帶的樣本為烏鱧，只擴(kuò)增出500 —條帶的樣本為斑鱧，而同時(shí)能夠擴(kuò)增出以上三條帶的為雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U )]。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟I)中所用引物為5個(gè)Me與6個(gè)Em組合，共30對(duì)引物。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟I)中引物的使用濃度為20μΜ。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U )]中DNA的提取包括步驟 1)取樣本的少量胸鰭，用眼科剪剪碎，放入I.5ml離心管中； 2)加入裂解液，裂解液包括Tris-HCl25 μ I, SDS 50 μ I, EDTA ΙΟΟμΙ，無(wú)菌水320 μ 1，蛋白酶K 6-10 μ I ;放入55°C水浴中裂解2-4小時(shí)，變澄清即可； 3)加入與裂解液體積相等的飽和苯酹,搖勻IOmin,12000rpm時(shí)，4°C離心20min ； 4)提取上清液，向提取的上清液中補(bǔ)充無(wú)菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的飽和苯酹，搖勻IOmin, 12000rpm時(shí)，4°C離心20min ； 5)提取上清液，向提取的上清液中補(bǔ)充無(wú)菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的苯酚、氯仿及異戊醇混合物，其中苯酚、氯仿及異戊醇的比例為25 24 I，搖勻 IOmin, 12000rpm 時(shí)，4°C離心 20min ； 6)提取上清液，向提取的上清液中補(bǔ)充無(wú)菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的氯仿與異戊醇的混合物，其中氯仿與異戊醇的比例為24 :1，搖勻lOmin，12000rpm 時(shí)，4°C 離心 20min ； 7)提取上清液，加入雙倍體積的冰凍無(wú)水酒精，有絮狀沉淀生成，如暫無(wú)絮狀沉淀時(shí)，置 _20°C 中存放 30min, 7000rpm 時(shí)，4°C 離心 8min ； 8)緩緩倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70%冰凍酒精洗一次，7000rpm時(shí)，4°C離心8min； 9)緩緩倒掉70%冰凍酒精，自然干燥1-2小時(shí)后，用100μ I無(wú)菌水溶解，-20°C備用。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟2)中，Tris-HCl水溶液的摩爾濃度為1M，pH值為8. O。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，SDS的濃度為10%。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，EDTA水溶液的摩爾濃度為O.5M。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速準(zhǔn)確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧的方法，該方法包括步驟1)引物合成；2)烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(♀)╳烏鱧(♂)]DNA的提取；3)SRAP-PCR反應(yīng)采用復(fù)性變溫法；4)電泳檢測(cè)；5)對(duì)能用于鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(♀)╳烏鱧(♂)]的引物組合，用Gelpro32軟件處理?xiàng)l帶，標(biāo)出條帶的大小，并在其它采樣的群體中驗(yàn)證。本發(fā)明在不處死魚(yú)種的基礎(chǔ)上，只需剪去少量鰭條或其它魚(yú)體組織部分，利用SRAP技術(shù)便很容易區(qū)別烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(♀)╳烏鱧(♂)]的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102912017SQ20121037990
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者朱樹(shù)人, 李家樂(lè), 王群, 邢智珺, 謝楠, 王宇希, 潘彬斌 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué), 上海海洋大學(xué), 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院