一管式共用引物法檢測同一突變位點不同突變類型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明基于LAMP（環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增檢測）技術(shù)的一管式檢測同一突變位點不同突變類型的方法或理論，該方法可以在同一個核酸檢測反應(yīng)管中同時檢測同一個突變位點的不同突變堿基。LAMP設(shè)計需要4-6個引物，通過在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒探針設(shè)計，對于同一突變點的不同突變類型，只改變覆蓋突變點處的引物，覆蓋其它位點的引物不變?yōu)楣灿靡铮尤肓恳膊蛔儯@樣保證了，覆蓋突變點的引物與共用引物之間不發(fā)生交叉反應(yīng)，只需要驗證覆蓋同一突變點不同突變類型處的引物之間是否發(fā)生交叉反應(yīng)即可，那么覆蓋此處引物只有一到兩個堿基不同，也不會發(fā)生反應(yīng)，這就是本檢測方式的理論基礎(chǔ)。此方法不僅可以降低成本、提高效率，更重要的是可以極大的提高對多突變類型同時存在的檢測靈敏度。
【專利說明】一管式共用引物法檢測同一突變位點不同突變類型
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]一管式共用引物法檢測同一突變位點不同突變類型，此發(fā)明可以應(yīng)用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，結(jié)核桿菌、乙型肝炎病毒、HIV病毒、腫瘤耐藥等檢測。
【背景技術(shù)】
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(loop-mediatedisothermal amplification , LAMP)是2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63 °C左右)保溫30 - 60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。LAMP是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標(biāo)上能優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴任何專門的儀器設(shè)備實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。
[0004]目前在行業(yè)應(yīng)用最廣范的耐藥檢測是藥敏實驗和基因芯片技術(shù)，藥敏實驗耗時太長，基因芯片雖然能實現(xiàn)高通量檢測但是制備成本及檢測費用均較昂貴，靈敏度低，不宜大面積推廣。因此急需一種檢測成本低、靈敏度高切實可行的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是:提供一種同時一管式檢測同一突變位點不同突變類型的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:該方法可以在同一個核酸檢測反應(yīng)管中同時檢測同一個突變位點的不同突變堿基。LAMP設(shè)計需要4-6個引物，通過在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒探針設(shè)計，對于同一突變點的不同突變類型，只改變覆蓋突變點處的引物，覆蓋其它位點的引物不變(加入數(shù)量也不變)，這樣保證了，突變點的引物與其它點位的引物之間不發(fā)生交叉反應(yīng)，只需要驗證覆蓋同一突變點不同突變類型處的引物之間是否發(fā)生交叉反應(yīng)即可，那么覆蓋此處這引物只有一到兩個堿基不同，也不會發(fā)生反應(yīng)，這就是本檢測方式的理論基礎(chǔ)。
[0007]實施例1:
結(jié)核分支桿菌耐 利福平(RFP)藥物核苷酸526點突變有如下幾種情況:
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明基于LAMP(環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增檢測)技術(shù)的一管式檢測同一突變位點不同突變類型的方法或理論，其特征在于:通過在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測試劑盒探針設(shè)計，對于同一突變點的不同突變類型，只改變覆蓋突變點處的引物，覆蓋其它位點的引物不變(加入數(shù)量也不變)，這樣保證了，突變點的引物與其它點位的引物之間不發(fā)生交叉反應(yīng)，只需要驗證覆蓋同一突變點不同突變類型處的引物之間是否發(fā)生交叉反應(yīng)即可，那么覆蓋此處這引物只有一到兩個堿基不同，也不會發(fā)生反應(yīng)，這就是本檢測方式的理論基礎(chǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利I要求我們保護(hù)的是LAMP技術(shù)一管式檢測同一突變位點不同突變類型，是我們首次提出基于LAMP技術(shù)對不同基因類型的檢測，只要是一管式檢測不同基因突變類型都在我們的保護(hù)范圍。
3.我們同時保護(hù)也是LAMP技術(shù)一管式檢測同一突變位點不同突變類型的理論和方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述本技術(shù)也可以向檢測不同突變位點延伸，本技術(shù)是同時檢測多個突變位點的基礎(chǔ)，多個位點引物設(shè)計除覆蓋突變位點的其它引物盡量設(shè)計共用引物，避免交叉反應(yīng)。
5.此方法主要應(yīng)用于各種突變耐藥基因(如肺結(jié)核、乙肝、艾滋病等)的檢測，同時也可用于同一位點是否存在不同有 效基因形式的檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103725769SQ201210390906
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月16日
【發(fā)明者】王德國, 曲海濤, 張文超 申請人:哈爾濱德歌生物科技有限公司