專(zhuān)利名稱(chēng)：一種細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法和在篩選抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程及分子藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠篩選以mGluR2為靶點(diǎn)的抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法，和該細(xì)胞模型在篩選抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代社會(huì)隨著環(huán)境污染和生活壓力的日益加重，精神類(lèi)疾病和神經(jīng)性疾病，特別是神經(jīng)退行性疾病越來(lái)越多地困擾著人類(lèi)。最新公布的《世界衛(wèi)生報(bào)告》指出目前，神經(jīng)退行性疾病及其精神類(lèi)疾病已成為人類(lèi)的大敵。從全球范圍來(lái)看,神經(jīng)退行性疾病帕金森氏癥患者就約有500萬(wàn)人，僅僅是在中國(guó)，患者已超過(guò)200多萬(wàn)人。因此針對(duì)精神類(lèi)疾病以及神經(jīng)退行性疾病的新藥創(chuàng)制已經(jīng)被列入國(guó)家重點(diǎn)發(fā)展戰(zhàn)略。也成為全球各大藥物研發(fā)公 司關(guān)注的焦點(diǎn)。C族GPCR成員因?yàn)槠洫?dú)特的生理功能成為精神類(lèi)疾病以及神經(jīng)退行性疾病藥物研發(fā)焦點(diǎn)中的焦點(diǎn)。C族GPCR成員包括代謝型Y-氨基丁酸受體(GABABR)、代謝型谷氨酸受體(mGluRl-8)、鈣敏感性受體(CaSR)以及味覺(jué)受體，該家族受體在體內(nèi)參與很多重要的生理進(jìn)程，過(guò)度激活或抑制都會(huì)引起癲癇、精神分裂癥、亨庭頓癥、帕金森癥、藥物依賴性、疼痛等神經(jīng)紊亂性疾病的病理發(fā)生。功能上的重要性和結(jié)構(gòu)上的易操控性，使得該家族成員成為重要的藥物作用靶點(diǎn)，也成為各大藥物公司研發(fā)的重點(diǎn)，有著潛在的極高的科研和市場(chǎng)價(jià)值。截止到2005年，根據(jù)IMS Health做出的相應(yīng)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)在銷(xiāo)售的藥物中與GPCR有關(guān)的抗精神病藥，銷(xiāo)售額已達(dá)到476億美元，并保持強(qiáng)勁的增長(zhǎng)速度。mGluR2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一個(gè)重要受體，屬于C族GPCR，與mGluR3 —起被歸為mGluR亞族IKGroup II mGluRs)。mGluR2是位于細(xì)胞膜上的跨膜受體，是一種重要的G蛋白偶聯(lián)受體。其活化狀態(tài)失調(diào)會(huì)引起下游信號(hào)通路激活紊亂，從而引起一系列精神紊亂性疾病的發(fā)生。mGluR2是一個(gè)同源二聚體，廣泛分布于大腦皮層，嗅前核，伏隔核，下丘腦，海馬回等部位的細(xì)胞中。每個(gè)mGluR2包括兩個(gè)胞外的VFT和兩個(gè)跨膜HD結(jié)構(gòu)域。當(dāng)谷氨酸結(jié)合到正構(gòu)位點(diǎn)或變構(gòu)劑結(jié)合到變構(gòu)位點(diǎn)，mGluR2被激活并與G i/o相耦聯(lián)，被激活后會(huì)抑制腺苷酸環(huán)化酶進(jìn)而抑制cAMP產(chǎn)生。通常情況下，mGluR2主要定位在突觸前膜，抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響神經(jīng)元的興奮性和突觸的傳遞，是治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂藥物的理想靶標(biāo)。目前這方面的研究尚處于起步階段，以mGluR2為祀點(diǎn)的藥物還未被用于臨床。但是大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床前研究證明，mGluR2敲除模型及其他藥理研究方法發(fā)現(xiàn)mGluR2在認(rèn)知、藥物成癮及精神病等生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。臨床前及臨床研究表明mGluRs亞族II是治療焦慮及精神分裂癥的潛在新型藥物靶點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)在焦慮及精神分裂癥治療史上具有里程碑意義，有可能最終推動(dòng)mGluR亞族II的激動(dòng)劑或PAMs成為治療這兩種疾病的基礎(chǔ)治療方案。此外，mGluR2的激動(dòng)劑及陽(yáng)性變構(gòu)劑還可以治療其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括疼痛、成癮、抑郁及癲癇坐寸O基于細(xì)胞信號(hào)通路的高通量藥物篩選(high throughput screening, HTS)是利用細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)作為應(yīng)答元件，通過(guò)高靈敏度的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和技術(shù)手段檢測(cè)作為藥物靶點(diǎn)的受體及各種蛋白所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件，從而觀測(cè)化合物是否能作用于藥物靶點(diǎn)，進(jìn)而找到具有靶點(diǎn)選擇性的先導(dǎo)化合物。而分子與細(xì)胞水平的藥物篩選模型具有材料用量少、藥物作用機(jī)制明確等特點(diǎn)，已經(jīng)成為目前尋找和發(fā)現(xiàn)新藥物的主要藥物篩選方法(FONNUM F. A rapid radio chemical method for the determination of cholineacetyl transferase [ J ]. J Neurochem , 1975, 24 ( 2 ) : 407 - 409.)。將藥物革巴點(diǎn)導(dǎo)入工具細(xì)胞，并構(gòu)建穩(wěn)定的重組高表達(dá)目標(biāo)藥物靶點(diǎn)的細(xì)胞篩選模型，是實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。藥物篩選模型是用于證明某種物質(zhì)具有藥理活性(生物活性、治療作用)的實(shí)驗(yàn)方法，是尋找和發(fā)現(xiàn)新藥物的重要條件之一。
目前，基于GPCR下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的高通量藥物篩選方法學(xué)相對(duì)比較成熟，多家公司可提供高通量檢測(cè)儀器及方案。藥物篩選模型的發(fā)現(xiàn)和構(gòu)建則成為制約和推動(dòng)該領(lǐng)域發(fā)展的重要因素，尤其是基于受體分子機(jī)制的模型構(gòu)建更是成為發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物的核心技術(shù)和難點(diǎn)。現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有能夠高通量篩選神經(jīng)系統(tǒng)紊亂性疾病藥物的細(xì)胞模型。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明建立了一種抗神經(jīng)紊亂性疾病的篩選模型，它是一種能夠穩(wěn)定表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的GPCR-mGluR2，能夠靈敏、特效地篩選以mGluR2為靶點(diǎn)的藥物，包括激動(dòng)劑、抑制劑和變構(gòu)劑等。本發(fā)明提供的一種細(xì)胞模型，是攜帶并能表達(dá)mGluR2基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。即該細(xì)胞模型是克隆了表達(dá)編碼人源mGluR2基因序列的體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述mGluR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞或HEK293細(xì)胞。其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞也能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明，而以CHO細(xì)胞或HEK293細(xì)胞構(gòu)建效果最佳。優(yōu)選地，該細(xì)胞模型的名稱(chēng)為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0-hmGluR2(C12)，于2012年9月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: C2012100。保藏地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。本發(fā)明還提供了一種上述細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，步驟如下
(1)將mGluR2基因與表達(dá)載體連接，構(gòu)建含有mGluR2基因的重組質(zhì)粒；
(2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)成能穩(wěn)定表達(dá)mGluR2基因的細(xì)胞株，該細(xì)胞株即為所述的細(xì)胞模型。上述細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，優(yōu)選地，還包括對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行綜合評(píng)估的步驟(3):在細(xì)胞株中加入mGluR2激動(dòng)劑或抑制劑，測(cè)定下游信號(hào)應(yīng)答反應(yīng)，根據(jù)應(yīng)答反應(yīng)結(jié)果評(píng)估該細(xì)胞株是否作為細(xì)胞模型。所述測(cè)定下游信號(hào)應(yīng)答反應(yīng)包括檢測(cè)mGluR2與其配體結(jié)合程度、mGluR2下游G蛋白與[35S]GTP YS結(jié)合程度、環(huán)腺苷酸積累量、三磷酸肌醇積累量和細(xì)胞內(nèi)鈣離子流變化量中的一種或幾種。其中檢測(cè)mGluR2與其配體結(jié)合程度以及G蛋白與[35S]GTPyS結(jié)合程度可以采用放射性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
優(yōu)選地，步驟(I)所述的表達(dá)載體為pcDNA5/FRT。優(yōu)選地,步驟(2)使用的細(xì)胞為CHO細(xì)胞。例如可以使用Invitrogen商品化細(xì)胞系Flp-in CHO細(xì)胞，F(xiàn)lp-In細(xì)胞系經(jīng)設(shè)計(jì)可快速構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，以能夠采用Flp-In表達(dá)載體表達(dá)目的蛋白。這些細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)上含有一個(gè)穩(wěn)定整合的重組酶識(shí)別序列(FRT)位點(diǎn)。Flp-In表達(dá)載體的定點(diǎn)整合可確保高表達(dá)量。用Flp-In表達(dá)載體和Flp重組酶載體P0G44共轉(zhuǎn)染Flp-In細(xì)胞系，使得表達(dá)載體被定點(diǎn)整合在每個(gè)細(xì)胞的相同染色體位點(diǎn)上。上述細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，更優(yōu)選地步驟(I)還包括對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定；步驟(2)所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞是將重組質(zhì)粒與表達(dá)重組酶的質(zhì)粒P0G44共導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，再利用潮霉素(Hygromycin)進(jìn)行篩選，獲得帶有潮霉素抗性的單克隆細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)后利用Western blot、測(cè)細(xì)胞中的cAMP或Ca2+流等方法檢測(cè)能夠表達(dá)mGluR2的陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)成能穩(wěn)定表達(dá)mGluR2基因的細(xì)胞株。
本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞模型在篩選抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物為mGluR2激動(dòng)劑、mGluR2抑制劑、mGluR2正向變構(gòu)劑、mGluR2反向變構(gòu)劑或mGluR2沉默變構(gòu)劑。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的細(xì)胞模型通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)分子所產(chǎn)生的應(yīng)答信號(hào)直接監(jiān)測(cè)mGluR2的活性，能夠高通量、低成本、準(zhǔn)確地篩選神經(jīng)紊亂性疾病的藥物；本發(fā)明細(xì)胞模型的制備方法簡(jiǎn)單可控，成本低廉；本發(fā)明神經(jīng)紊亂性疾病藥物篩選方法步驟簡(jiǎn)單，成本低廉，準(zhǔn)確性高，可實(shí)現(xiàn)高通量的篩選，具有很好的穩(wěn)定性和可靠性。為抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物的篩選提供了新的思路，具有很好的市場(chǎng)前景。


圖I為本發(fā)明細(xì)胞模型的工作原理圖。圖2為對(duì)陽(yáng)性克隆的Western blot鑒定結(jié)果圖，其中，CHO表示CHO空細(xì)胞，CH0-mGluR2 C10、C11、C12、C13、C14 和 C15 分別表示不同編號(hào)的 CHO- mGluR2 細(xì)胞克隆。圖3為L(zhǎng)Y379268對(duì)CH0_mGluR2細(xì)胞內(nèi)鈣流及對(duì)細(xì)胞活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A為不同濃度LY379268對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣流的影響，縱坐標(biāo)為細(xì)胞內(nèi)鈣釋放量；B為不同濃度LY379268對(duì)細(xì)胞活力的影響，縱坐標(biāo)為光度吸收值(在波長(zhǎng)為560nm處的吸光值)，橫坐標(biāo)為L(zhǎng)Y379268的濃度。圖4為L(zhǎng)Y341495對(duì)LY379268誘導(dǎo)的CH0_mGluR2細(xì)胞內(nèi)鈣流及對(duì)細(xì)胞活力的影響結(jié)果。A為不同濃度LY341495對(duì)LY379268誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣流的影響，縱坐標(biāo)為細(xì)胞內(nèi)鈣釋放量。B為不同濃度LY341495對(duì)細(xì)胞活力的影響，縱坐標(biāo)為光度吸收值(在波長(zhǎng)為560nm處的吸光值)，橫坐標(biāo)為L(zhǎng)Y341495的濃度。圖5為CHO空細(xì)胞以及CH0-mGluR2細(xì)胞系中LY379268、DHPG對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣流的影響。A為不同濃度LY379268對(duì)CHO空細(xì)胞(CHO Mock)和CH0_mGluR2細(xì)胞系(CHO-mGluR2-Clonel2)胞內(nèi)鈣流的影響，B為不同濃度藥物(LY379268和DHPG)對(duì)CH0_mGluR2細(xì)胞系(CH0- mGluR2-Clonel2)胞內(nèi)鈣流的影響。圖6為不同細(xì)胞接種數(shù)目對(duì)應(yīng)答元件檢測(cè)的影響，縱坐標(biāo)為CH0_mGluR2細(xì)胞內(nèi)鈣釋放量，橫坐標(biāo)為每孔細(xì)胞數(shù)。圖7為細(xì)胞不同傳代數(shù)對(duì)應(yīng)答元件檢測(cè)的影響，A為第7代，B為第23代，縱坐標(biāo)為CH0-mGluR2細(xì)胞內(nèi)鈣釋放量，橫坐標(biāo)為L(zhǎng)Y379268和L-Glutamate濃度。圖8為基于該細(xì)胞模型的藥物篩選方法的評(píng)估結(jié)果，縱坐標(biāo)為細(xì)胞內(nèi)鈣釋放量，橫坐標(biāo)為樣品數(shù)。LY379268+表示加入LY379268藥物處理的實(shí)驗(yàn)組，LY379268-表示未加藥物處理的對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例中用到的材料和試劑如下· Flp-in CHO細(xì)胞(一種中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，以下實(shí)施例中簡(jiǎn)稱(chēng)CHO細(xì)胞)、表達(dá)載體pcDNA5/FRT和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin2000為Invitrogen公司的商業(yè)化產(chǎn)品；F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；其它試劑均為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；LY379268、LY341495購(gòu)自Tocris、L-Glutamate (L-谷氨酸)購(gòu)自 Sigma 公司。實(shí)施例I細(xì)胞模型的構(gòu)建
以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)為受體細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞模型的建立。將CHO細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(I)重組質(zhì)粒構(gòu)建
使用人源mGluR2 cDNA (SEQ ID NO: I)序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因mGluR2，將擴(kuò)增的mGluR2基因和pcDNA5/FRT表達(dá)載體由連接酶催化連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，抽提測(cè)序以鑒定陽(yáng)性克隆，鑒定正確的陽(yáng)性克隆即為重組質(zhì)粒，命名為pcDNA5/FRT-mGluR2。(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞
DNA和脂質(zhì)體(Lipofectin2000)混合物的配制(60mM培養(yǎng)皿)
A溶液
重組質(zhì)粒 pcDNA5/FRT-mGluR2 O. 8 μ g 表達(dá)重組酶(f Ip)的質(zhì)粒pOG447. 2 μ g
培養(yǎng)基 Opti MEM500 μ L
A溶液混合,室溫放置5min ；
B溶液
脂質(zhì)體 Lipofectamine200020 μ L
培養(yǎng)基 Opti MEM500 μ L
B溶液混合，室溫放置5min ；
將A液與B液混合，室溫放置20min，然后將混合液加入到CHO細(xì)胞中。在37°C、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6h后,換為含血清含抗生素培養(yǎng)基。(3)陽(yáng)性克隆篩選
轉(zhuǎn)染24h后的CHO細(xì)胞按I :10的密度傳代再培養(yǎng)24h，以含500 μ g/mL Hygromycin(潮霉素)的F12選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性篩選培養(yǎng)，每3天用選擇性培養(yǎng)基換液一次，持續(xù)2周可見(jiàn)陽(yáng)性克隆出現(xiàn)。采用極端稀釋法將陽(yáng)性克隆挑出，接種至96孔板再用含250 μ g/mL Hygromycin的F12選擇培養(yǎng)液擴(kuò)增傳代,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆細(xì)胞模型。(4)陽(yáng)性克隆鑒定
步驟(3)獲得的細(xì)胞模型用western blot進(jìn)行鑒定，以獲得克隆中mGluR2表達(dá)情況，CHO空細(xì)胞作為對(duì)照。利用mGluR2特異性抗體，我們發(fā)現(xiàn)挑選的10-15號(hào)克隆都有mGluR2表達(dá)(CH0- mGluR2細(xì)胞系的CIO，Cll，C12，C13，C14，C15)，而空細(xì)胞中mGluR2卻沒(méi)有表達(dá)(圖2)。我們選擇12克隆做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。12號(hào)克隆命名為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0_hmGluR2 (C12)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: C2012100。實(shí)施例2本發(fā)明細(xì)胞模型用于藥物篩選的特異性 mGluR2為Gi/o偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體，其激活后通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)進(jìn)而抑制cAMP產(chǎn)生，因而可以通過(guò)檢測(cè)cAMP的產(chǎn)生來(lái)檢測(cè)mGluR2激活情況；另外可以在該細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Gqi9嵌合型G蛋白，可以將mGluR2激活的信號(hào)偶聯(lián)到PLC信號(hào)通路來(lái)，繼而促進(jìn)胞內(nèi)鈣離子釋放，因而可以通過(guò)檢測(cè)Ca2+釋放確定mGluR2激活情況，本實(shí)施例中為了鑒定細(xì)胞系可以穩(wěn)定表達(dá)功能性的mGluR2，均采用檢測(cè)Ca2+釋放的方法。為檢測(cè)該細(xì)胞模型用于藥物篩選的特異性，確保應(yīng)答元件的響應(yīng)是由mGluR2的活性變化所調(diào)控。選用Group II mGluRs的特異性激動(dòng)劑LY379268，Group II mGluRs的特異性抑制劑LY341495，分別以不同的濃度處理細(xì)胞模型并通過(guò)檢測(cè)應(yīng)答分子的響應(yīng)確定其誘導(dǎo)激活率，通過(guò)MTT法確定細(xì)胞的活力。(I) LY379268對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放及細(xì)胞活力的量效關(guān)系
①將細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，換上I μΜ Fluo-4 AM (鈣熒光探針)和 O. 02% pluronic acid 孵育 Ih0 然后分別加入 1(Γ10，1(Γ9，1θΛ 1(Γ7，1(Γ6，1(Γ5，KT4M的LY379268進(jìn)行刺激，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。用FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀工作站測(cè)定各組誘導(dǎo)的Ca2+釋放。試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖3Α，LY379268作為Group II mGluRs特異性激動(dòng)劑，對(duì)mGluR2的激活效果明顯。在本實(shí)驗(yàn)中，LY379268對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的誘導(dǎo)釋放率與LY379268濃度呈劑量依賴關(guān)系。②將細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，換上新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng) 24h，分別加入濃度為 1(Γ9，10' 3 X 10' 10' 3 X 10' 1θΛ 1(T5，KT4M 的 LY379268 進(jìn)行刺激，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理24h后用MTT (比色法)檢測(cè)細(xì)胞活力。試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖3 B，通過(guò)MTT檢測(cè)可知，細(xì)胞活力隨LY379268濃度增加無(wú)顯著增力口(圖3)。這說(shuō)明LY379268對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的促進(jìn)與細(xì)胞增殖的活力無(wú)關(guān)。(2) LY341495對(duì)LY379268誘導(dǎo)內(nèi)鈣釋放的影響
①將細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，換上I μΜ Fluo-4 AM和0. 02%pluronic acid 孵育 lh。使用 l(Tn，1(T1CI，1(Γ9，1θΛ 1(Γ7，1(Γ6，1(T5，KT4M LY341495 預(yù)孵育30min，加入IO-5M的LY379268混合液進(jìn)行刺激，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。用FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀工作站測(cè)定誘導(dǎo)的Ca2+釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4A，LY341495作為Group II mGluRs特異性抑制劑，能夠有效抑制LY379268對(duì)mGluR2的激活。在本實(shí)驗(yàn)中，1(Γ5Μ LY341495對(duì)濃度為1(Γ5Μ的LY379268誘導(dǎo)的細(xì)胞系內(nèi)鈣釋放均能抑制，使內(nèi)鈣釋放程度接近于本底。②將細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，換上新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng) 24h,分別加入濃度為 1(Γ10，1(Γ9，1(Γ8，3 X 1(Γ8，10' 1(Γ6，3 X 1(Γ6，KT5M 的 LY341495 進(jìn)行處理，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理24h用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力。試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖4B，由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)當(dāng)LY341495濃度在10_1CI至10_5M上時(shí)，細(xì)胞活力隨LY341495濃度增加無(wú)顯著降低。這說(shuō)明LY341495對(duì)LY379268誘導(dǎo)的內(nèi)Ca2+釋放的抑制與細(xì)胞增殖的活力無(wú)關(guān)。(3) DHPG對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放及細(xì)胞活力的量效關(guān)系
①將細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，換上I μΜ Fluo-4 AM (鈣熒光探針)和 O. 02% pluronic acid 孵育 lh。然后分別加入 10—11，ΙΟ—1。，10_9，10_8，10_7，10_6，10_5，10_4，10_3M的LY379268混合液進(jìn)行刺激，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，以CHO空細(xì)胞作為對(duì)照。用FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀工作站測(cè)定各組誘導(dǎo)的Ca2+釋放。 ②將細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，換上新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24h，分別加入濃度為 10-11，10_10，10_9，10_8，10_7，10_6，10_5，10_4，1(Γ3Μ 的 DHPG 進(jìn)行刺激，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，以CHO空細(xì)胞作為對(duì)照。用FleXStation3多功能酶標(biāo)儀工作站測(cè)定誘導(dǎo)的Ca2+釋放。試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖5，由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)DHPG作為Group I mGluRs特異性激動(dòng)劑，對(duì)CH0-mGluR2的激活無(wú)明顯效果(圖5B)，而Group II mGluRs特異性激動(dòng)劑LY379268能夠顯著激活胞內(nèi)Ca2+釋放而對(duì)CHO空細(xì)胞沒(méi)有激活作用(圖5A)，這說(shuō)明其他GPCR的特異性配體對(duì)該模型不會(huì)產(chǎn)生干擾。(4) 96孔板不同細(xì)胞接種數(shù)目對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的影響
無(wú)論是自動(dòng)還是人工接種細(xì)胞于96孔板，每孔中的細(xì)胞數(shù)目都不會(huì)完全相同。為了檢驗(yàn)不同細(xì)胞數(shù)目對(duì)篩選結(jié)果的影響，尋求一個(gè)最適的細(xì)胞接種密度。分別接種數(shù)目為5，000、10，000,20, 000,40, 000/孔的細(xì)胞于96孔板，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入ΙΟμΜ的LY379268刺激，以不含LY379268的緩沖液作為空白對(duì)照。用FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀工作站測(cè)定誘導(dǎo)的Ca2+釋放。在本實(shí)例中發(fā)現(xiàn)(結(jié)果見(jiàn)圖6)，細(xì)胞密度為5，000、10，000、20，000、40，000個(gè)/孔
時(shí)，在這個(gè)范圍內(nèi)，熒光鈣流的信號(hào)隨著細(xì)胞數(shù)目的增加而增加。綜合考慮各因素，在試驗(yàn)中均采用40，000/孔的細(xì)胞密度。(5)細(xì)胞穩(wěn)定性檢測(cè)
隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，外源目的基因的表達(dá)可能丟失，因此，目的基因是否能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，即傳代穩(wěn)定性是檢測(cè)細(xì)胞系優(yōu)劣的重要指標(biāo)。為此我們?cè)贑H0-mGluR2細(xì)胞傳到第7代和第23代時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，換上新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，分別加入不同濃度的LY379268以及L-Glutamate進(jìn)行刺激，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。用FleXStation3多功能酶標(biāo)儀工作站測(cè)定誘導(dǎo)的Ca2+釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖7，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)LY379268和L-Glutamate可以明顯激活mGluR2誘導(dǎo)的Ca2+釋放。說(shuō)明該細(xì)胞模型具有良好的傳代穩(wěn)定性。實(shí)施例3基于細(xì)胞模型的藥物篩選方法的評(píng)估
建立篩選模型的目的是篩選活性物質(zhì)，反映該物質(zhì)所具有的生物活性，因此，對(duì)篩選模型能否準(zhǔn)確地反映受試物的生物活性，必須進(jìn)行客觀地評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)一個(gè)篩選模型的優(yōu)劣有很多指標(biāo)，如模型的穩(wěn)定性、靈敏性、特異性等。除此之外，為了使模型能夠達(dá)到篩選的要求，還需要對(duì)篩選模型進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，主要分析該模型能否有效地反映樣品的活性。評(píng)價(jià)藥物篩選模型的常用的定量技術(shù)參數(shù)，主要如下
(1)信號(hào)本底比(signalto background, S/B)
信號(hào)本底比反映的是藥物篩選模型獲得的數(shù)據(jù)(M Signal)與本底數(shù)據(jù)(Μ BadtgMund)之間的距離。一般來(lái)講，這種比值越大，信號(hào)與本底的距離越大，在反映樣品作用方面有越大的范圍，易于反映樣品作用。一般情況下，信號(hào)本底比的數(shù)值應(yīng)大于3，當(dāng)值小于3時(shí)，就不能有效地反映樣品的生物活性。信號(hào)本底比的計(jì)算公式如下
S/B M signal/M Background
(2)信噪比(siganlto noise, S/N)
信噪比是儀器分析中常用的方法評(píng)價(jià)參數(shù)，噪音通常是指在同樣測(cè)定條件下，本底所產(chǎn)生的記錄信號(hào)。通常情況下，信噪比要大于10才能認(rèn)為是可以應(yīng)用的方法。信噪比的計(jì)算公式如下
S/N (M SignaI M Background) /SD Background
其中SD Background 表示本底數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差。(3) Z ' 因子
Z '因子綜合考慮了信號(hào)的變化和波動(dòng)范圍，它只與實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性與可靠性有關(guān)而與實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容無(wú)關(guān)，因而在評(píng)價(jià)高通量藥物篩選模型的穩(wěn)定性和可靠性中得到廣泛的應(yīng)用，Z '因子是沒(méi)有單位的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，其值在O I之間，Z'因子〈0.5表示穩(wěn)定性差，實(shí)驗(yàn)的可靠性低，這樣的模型不能用于藥物篩選，Z '因子在0. 5 I時(shí)，模型穩(wěn)定性高，可以充分確保建立的模型用于藥物的篩選。Z '因子的計(jì)算公式如下
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞模型，其特征在于，該細(xì)胞模型是攜帶并能表達(dá)mGluR2基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞模型，其特征在于，所述mGluR2基因的核苷酸序列如SEQID NO: I 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞模型，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞或HEK293 細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞模型，其特征在于，名稱(chēng)為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0-hmGluR2(C12)，于2012年9月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: C2012100。
5.權(quán)利要求Γ4任一所述的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下 (1)將mGluR2基因與表達(dá)載體連接，構(gòu)建含有mGluR2基因的重組質(zhì)粒； (2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)成能穩(wěn)定表達(dá)mGluR2基因的細(xì)胞株，該細(xì)胞株即為所述的細(xì)胞模型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，還包括對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行綜合評(píng)估的步驟(3):在細(xì)胞株中加入mGluR2激動(dòng)劑或抑制劑，測(cè)定下游信號(hào)應(yīng)答反應(yīng)，根據(jù)應(yīng)答反應(yīng)結(jié)果評(píng)估該細(xì)胞株是否作為細(xì)胞模型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(I)所述的表達(dá)載體為 pcDNA5/FRT。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
9.權(quán)利要求f4任一所述的細(xì)胞模型在篩選抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述細(xì)胞模型在篩選抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物為mGluR2激動(dòng)劑、mGluR2抑制劑、mGluR2正向變構(gòu)劑、mGluR2反向變構(gòu)劑或mGluR2沉默變構(gòu)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法和在篩選抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物中的應(yīng)用，屬于基因工程及分子藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的細(xì)胞模型是攜帶并能表達(dá)mGluR2基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該細(xì)胞模型的構(gòu)建方法是將mGluR2基因與表達(dá)載體連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒后導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選培養(yǎng)獲得能穩(wěn)定表達(dá)mGluR2基因的細(xì)胞株。該細(xì)胞模型可用于篩選抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物，通過(guò)將待篩選物質(zhì)加入到細(xì)胞模型培養(yǎng)基中，測(cè)定應(yīng)答元件的產(chǎn)量或被激活程度來(lái)判斷該物質(zhì)是否被篩出。本發(fā)明的細(xì)胞模型能夠高通量、低成本且準(zhǔn)確地篩選抗神經(jīng)紊亂性疾病藥物，篩選方法步驟簡(jiǎn)單可控，成本低廉，通量高，具有很好的穩(wěn)定性和可靠性。
文檔編號(hào)C12R1/91GK102888382SQ201210394298
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者張文華, 皮振鈞, 胡萍, 孫兵, 孟夏, 劉劍峰 申請(qǐng)人:吉瑞泰(武漢)生物科技有限公司