專利名稱：甘蔗褐銹病菌pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘蔗病原菌的檢測(cè)方法，具體涉及甘蔗褐銹病菌PCR檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘鹿褐銹病(Sugarcane brown rust disease)屬真菌性病害，由屬于黑頂柄銹菌的甘鹿褐銹病菌me I anocephal a)弓\起。該病主要由夏孢子傳播,借風(fēng)力附著在蔗葉表面，經(jīng)氣孔侵入。該病在美國(guó)、澳大利亞、印度和毛里求斯等國(guó)家普遍發(fā)生并多次爆發(fā)流行，不僅造成蔗莖產(chǎn)量損失，還對(duì)蔗糖分積累造成影響，影響程度因品種抗病性不同而有差異，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可高達(dá)40 %，并導(dǎo)致蔗糖分降低，幅度在10-36 %之間。
甘蔗褐銹病主要發(fā)生在葉片上，其發(fā)生與溫度密切相關(guān)，16-22 °C為發(fā)病最適宜 溫度。初次侵染源主要來自甘蔗本身或其他中間寄主。受褐銹病菌侵染后，初期甘蔗葉片上長(zhǎng)出黃色小斑點(diǎn)，色澤呈褐色至橙褐色，周圍有黃色暈環(huán)，后期病斑因夏孢子堆呈膿皰狀，最后病斑變黑色，葉組織壞死，使甘蔗葉片失去光合能力，表現(xiàn)早衰。培育抗病品種，提高目標(biāo)甘蔗品種的抗褐銹病性，并避免栽種感病品種，是控制甘蔗褐銹病的最經(jīng)濟(jì)有效的措施。在甘蔗抗褐銹病育種過程中，如何檢測(cè)目標(biāo)甘蔗品種中是否含有甘蔗褐銹病菌以及檢測(cè)的的效率和準(zhǔn)確性直接影響甘蔗抗褐銹病育種的進(jìn)程和效果。目前，一般采取兩種方法判斷種莖是否帶菌一種是采用分離培養(yǎng)技術(shù)，在建立純培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上，根據(jù)培養(yǎng)物所產(chǎn)生孢子的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，黑頂柄銹菌夏孢子橙色或橙褐色，卵圓形至梨形，大小24. I 34. 9X18. I 25.3 ( μ m)，具3 4個(gè)芽孔。夏孢子壁四周均勻加厚。冬孢子雙細(xì)胞，壁光滑，頂壁常加厚，棍棒狀，蒼白至磚色，大小28. 9 45. 8X14. 5 21. 7 ( μ m);另一種是基于該病害表型癥狀，因?yàn)楦收崾芎咒P病菌侵染后，病害癥狀表現(xiàn)為受侵染葉片出現(xiàn)褐色條紋病斑，葉片背面表皮破裂，產(chǎn)生銹色膿包，病情嚴(yán)重的葉片枯死，因此，可以采用種莖種植后，觀察是否發(fā)生甘蔗褐銹病判斷待檢測(cè)甘蔗品種是否含有褐銹病菌。但是，上述的第一種方法由于分離培養(yǎng)以及最終建立純培養(yǎng)物需要時(shí)間長(zhǎng)，加上分離過程雜菌污染等，都會(huì)影響分離效果，檢出效率不高；第二種方法則只有當(dāng)甘蔗、環(huán)境條件和病原菌三個(gè)因素都具備，病害才能發(fā)生，換句話說，即便田間有病原、甘蔗基因型也是感病的，要發(fā)生病害，還需要合適的環(huán)境條件，三者缺一不可，因此，田間基于誘發(fā)的抗病性鑒定方法，鑒定結(jié)果難以預(yù)料。不同地點(diǎn)、不同年份間的鑒定結(jié)果有較大的差異，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性不夠，何況還需要長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月的漫長(zhǎng)時(shí)間。顯然，目前已有的技術(shù)方法，對(duì)于判斷種莖是否帶菌是不適用的，急需建立一種能夠?qū)崿F(xiàn)“快速”與“準(zhǔn)確”目標(biāo)要求的甘蔗褐銹病菌的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘蔗褐銹病菌PCR檢測(cè)方法，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測(cè)。本發(fā)明的甘蔗褐銹病菌PCR檢測(cè)方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測(cè)體系建立和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，其特征在于
1、PCR檢測(cè)體系的建立:PCR擴(kuò)增體系為總體積25μ 1，內(nèi)含2. 5 μ I IOXPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的檢測(cè)引物 PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因組 DNA，ddH20 補(bǔ)足到 25μ I ； PCR 擴(kuò)增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 58 °C 45 S，72 °C I min，35 個(gè)循環(huán)；72 °C 8 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；
所述檢測(cè)引物如下
PCR-F :5’-GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA-3’，
PCR-R :5’-GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA-3'； 2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的PCR擴(kuò)增圖譜中，在分子量為483bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，為甘蔗褐銹病菌存在的標(biāo)志。本發(fā)明的應(yīng)用效果
本發(fā)明的甘蔗褐銹病菌PCR檢測(cè)方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點(diǎn)；與常規(guī)的根據(jù)病菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定或根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定的方法相比，具有實(shí)用性好、準(zhǔn)確性高和操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)。I、實(shí)用性好直接從待檢測(cè)甘蔗品種中檢測(cè)甘蔗褐銹病菌具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，在甘蔗品種及其種質(zhì)資源交換過程中，甘蔗褐銹病菌的檢測(cè)方法是根據(jù)病菌培養(yǎng)物所產(chǎn)生孢子的形態(tài)特征鑒定或根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定，無法滿足快速檢疫的需要。為了使我們的檢疫方法具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，我們采用直接從待檢測(cè)甘蔗品種中提取DNA后直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可在5 6小時(shí)內(nèi)完成對(duì)甘蔗褐銹病菌的檢測(cè)。因此本方法大大提聞了檢測(cè)的效率。2、準(zhǔn)確性高傳統(tǒng)的甘蔗褐銹病菌檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)病原物孢子的形態(tài)特征或者根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定來確定檢疫對(duì)象，無法排除人為因素的干擾，很難區(qū)分形態(tài)相似種或容易受環(huán)境條件的影響，從而導(dǎo)致準(zhǔn)確性不高；同時(shí)，形態(tài)學(xué)檢測(cè)在近緣菌內(nèi)的不同種之間可區(qū)別的特征較少，有些甚至沒有什么差異，同時(shí)還需要判斷者具有豐富的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，方可作出準(zhǔn)確的判斷。而本發(fā)明根據(jù)甘蔗褐銹病菌的特異性序列，選擇甘蔗褐銹病菌特有的一段保守序列設(shè)計(jì)特異引物，根據(jù)變異序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增比較，為病原菌的檢測(cè)和鑒定提供準(zhǔn)確的靶標(biāo)位點(diǎn)。經(jīng)過與甘蔗褐銹病菌以及其它不同植物中近緣病原菌的比較，該引物的準(zhǔn)確率高。3、操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用本發(fā)明方法，提取待檢測(cè)植株DNA、PCR擴(kuò)增和常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳即可判定檢測(cè)結(jié)果，無須對(duì)病原菌進(jìn)行培養(yǎng)或田間種植鑒定，一般檢測(cè)過程可在5 6小時(shí)完成。本發(fā)明為甘蔗褐銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度的快速檢測(cè)體系，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測(cè)，對(duì)我國(guó)抗褐銹病甘蔗育種和抗褐銹病甘蔗種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要的意義。


圖I為使用甘蔗PCR-F和PCR-R檢測(cè)引物鑒定6個(gè)待檢測(cè)甘蔗品種是否受甘蔗褐銹病菌侵染(即是否含有甘蔗褐銹病菌)的PCR擴(kuò)增圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)；(代表以水作為模板的空白對(duì)照；P代表對(duì)應(yīng)甘蔗品種中含有甘蔗褐銹病菌；N代表對(duì)應(yīng)甘蔗品種中不含甘蔗褐銹病菌；1_6代表6個(gè)甘蔗品種。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。實(shí)施例I甘蔗褐銹病菌PCR檢測(cè)方法 甘蔗褐銹病菌PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟
I、基因組DNA的提取 (1)取5克待檢測(cè)甘蔗植株的葉片組織，置研缽，加入液氮磨碎成粉末，并在解凍前轉(zhuǎn)入50 ml的離心管中；
(2)加入15ml,65 °C預(yù)熱的SDS提取液，混勻后在65 1水浴保溫40 min ；
(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混勻后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C離心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1預(yù)冷的異丙醇；
(5)-20°C放置30 min后，鉤出漂浮在液面的DNA，置于一干凈的I. 5 ml離心管中，晾干后加入750 μ I TE溶液；加等體積的平衡飽和酚，搖勻，12000 g，4 °C離心，10 min ；
(6)轉(zhuǎn)移上清至另一干凈的I.5 ml離心管中，加等體積的氯仿，12000 g，4 °C，離心10min后移出上層水相；
(7)在水相中加2倍體積的無水乙醇，12000g，4 °C離心10 min，留沉淀，用體積濃度為70 %的乙醇清洗2次，并晾干；
(8)加滅菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、PCR檢測(cè)體系的建立
PCR擴(kuò)增體系為總體積25 μ 1，內(nèi)含2. 5 μ I 10XPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/LMgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 μ mol/L 的檢測(cè)引物 PCR-F 和 PCR-R各 I. 0 μ I, I. 25U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng待檢測(cè)甘蔗品種基因組DNA，ddH20補(bǔ)足到25 μ I。PCR擴(kuò)增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 58 °C 45 s，72 °C I min，35 個(gè)循環(huán)；72 0C 8 min。所述檢測(cè)引物PCR-F和PCR-R，是采用ITS-PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩選試驗(yàn)，獲得了甘蔗褐銹病菌的特異DNA片段，以此片段的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)甘蔗褐銹病菌檢測(cè)引物。所述檢測(cè)引物PCR-F和PCR-R具體如下
PCR-F :5’-GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA-3’，
PCR-R : 5’-GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA-3'。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
具體的檢測(cè)方法為，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μ I，加5 μ I含有溴酚藍(lán)的上樣緩沖液，混勻后點(diǎn)樣于含有0. 5 μ g/ml溴化乙錠的I. 5 %瓊脂糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，10 V/cm恒定電壓下電泳1.5 h，結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上成像并進(jìn)行凝膠分析。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果采用檢測(cè)引物PCR-F和PCR-R對(duì)待檢測(cè)甘蔗品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖I所示，受甘蔗褐銹病菌侵染(即含有甘蔗褐銹病菌)的樣品出現(xiàn)483 bp的DNA條帶，而沒有受到甘蔗褐銹病菌侵染(即不含甘蔗褐銹病菌)的樣品則不出現(xiàn)483 bp的DNA條帶。我們?nèi)?個(gè)待檢測(cè)甘蔗品種用PCR檢測(cè)和病原菌分離培養(yǎng)后的形態(tài)特征判別方法鑒定的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果是一致的。如圖I所示，出現(xiàn)分子量為483 bp的DNA條帶的樣品所代表的甘蔗品種，經(jīng)病原菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定均含甘蔗褐銹病菌；未出現(xiàn)分子量為483 bp的DNA條帶的樣品所代表的甘蔗品種，經(jīng)病原菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定結(jié)果顯示均不含甘蔗褐銹病菌。本發(fā)明采用的主要試劑如下(所有化學(xué)試劑均為分析純)
1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 I. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油50 ml,滅菌去離子I L, pH值7· 4 ;
2、TE溶液10 mmol/L Tris-HCl, I mmol/L EDTA ； 3、上樣緩沖液0.I %溴酚藍(lán)，40 %蔗糖；
4、0.5 X TBE 緩沖液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；
5、PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的儀器主要如下
1、PCR擴(kuò)增儀德國(guó)Eppendorf5331 PCR擴(kuò)增儀；
2、電泳儀北京六一儀器廠DYCZ-20ADNA序列分析電泳儀；
3、離心機(jī)德國(guó)Eppendorf5810/5810R多功能臺(tái)式離心機(jī)；
4、凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)BIO-RADGel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種甘蔗褐銹病菌的PCR檢測(cè)方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測(cè)體系建立和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，其特征在于 (1)PCR檢測(cè)體系的建立PCR擴(kuò)增體系為總體積25 μ 1，內(nèi)含2. 5 μ I IOXPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 ymol/L 的檢測(cè)引物PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因組 DNA，ddH20 補(bǔ)足到 25μ I ； PCR 擴(kuò)增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 58 °C 45 s，72 °C I min，35 個(gè)循環(huán)；72 °C 8 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2 ;所述檢測(cè)引物如下PCR-F :5’-GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA-3’，PCR-R :5’-GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA-3'； (2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的PCR擴(kuò)增圖譜中，在分子量為483bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，為甘蔗褐銹病菌存在的標(biāo)志。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甘蔗褐銹病菌的PCR檢測(cè)方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測(cè)體系建立和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。本發(fā)明的甘蔗褐銹病菌PCR檢測(cè)方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點(diǎn)；與常規(guī)的根據(jù)病菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定或根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定的方法相比，具有實(shí)用性好、準(zhǔn)確性高和操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)。為甘蔗褐銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度的快速檢測(cè)體系，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測(cè)，對(duì)我國(guó)抗褐銹病甘蔗育種和抗褐銹病甘蔗種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102876797SQ20121039694
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者闕友雄, 許莉萍, 羅俊, 黃寧, 袁照年, 郭晉隆, 徐景升, 陳如凱 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)