專利名稱：一種微流體細胞捕獲芯片及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞捕獲工具及其制備方法，尤其涉及一種分離、富集和識別循環腫瘤細胞的微流體細胞捕獲芯片及其制備方法，該微流體細胞捕獲芯片可用作為腫瘤診斷、輔助治療、及生化分析研究的有利工具。
背景技術：
目前，腫瘤診斷通常根據大量病理狀況進行診斷。這類方法，例如活檢或直腸癌指檢通常采取侵入性分析，具有一定程度的創傷性，不利于病患。
另外也有采用外周血中生物分子標志物進行檢查，例如血清學參數(PSA劑量)檢測，由于其敏感性和特異性都不是很理想，使得癌癥診斷和治療較難取得良好效果。
對許多癌癥患者而言，其死亡主要是由于轉移瘤引起的。當病人手術切除主要腫瘤后，目前檢測手段很難及時反應治療情況，鑒定轉移瘤，指導后續的放化療過程，從而導致病人錯過最佳治療時機和無法及時有效調整無效治療和用藥方案。因此不能夠成功治療所有的轉移瘤，導致病人最終死亡。從臨床角度看來，轉移瘤可以看作是癌癥自然發展過程中的結論性事件。
人們急待開發非創傷性過程從患者提取腫瘤細胞樣品的工具。
循環腫瘤細胞(CTCs)是指在血液中以極低水平存在的活實體瘤細胞。隨著對循環腫瘤細胞研究的不斷深入，富集和鑒定這些細胞已經成為輔助癌癥診斷的一種方法。監管機構(例如FDA)已經批準一些基于循環腫瘤細胞捕獲、鑒定系統的臨床應用。
為了分離和富集體液中循環腫瘤細胞和擴散腫瘤細胞，人們利用這類細胞尺寸、 表面分子表達等特點開發出一些相應的捕獲、富集方法(例如，多孔濾膜法、免疫磁珠富集法)。
傳統的多孔濾膜法存在缺點有(I)孔徑單一與實際臨床病人細胞尺寸多樣性不符，存在遺漏現象；(2)試劑消耗量大，難以進行后期鑒定工作；(3)容易出現堵塞現象，影響實驗結果；(4)專用濾膜制備工藝復雜，成本較高。
免疫識別富集法，主要有磁珠富集和芯片富集兩種。由于生物的復雜性與多樣性， 體液中腫瘤細胞可能存在細胞特征識別基團退化，從而導致免疫識別效率下降，導致假陰性或假陽性出現。無論磁珠富集和芯片富集，都存在細胞與免疫識別基團接觸幾率不高、結合不牢，影響最后檢測和診斷情況。同時此類芯片成本較高，不易于加工。為此要對現有的循環腫瘤細胞分離、富集方法進行改進。發明內容
本發明要解決的技術問題在于提出一種能夠通過從人體液體樣本中分離、富集罕見細胞的微流體細胞捕獲芯片，以解決現有技術中侵入采樣等問題。
解決本發明的技術問題所采用的技術方案是提供一種微流體細胞捕獲芯片，其包括上部硬質材料和下部硬質材料,所述上部硬質材料和下部硬質材料之間形成有一條溝道，所述溝道具有入口和出口，所述上部硬質材料和下部硬質材料至少一個是透明的材料， 所述溝道從入口到出口的高度由高向低逐漸過渡且呈楔形或者溝道部分區域呈楔形，所述溝道最低處接近或小于至少一種目標細胞尺寸。
作為本發明的進一步改進，所述溝道的寬度為O. 05 200毫米，長度為I 500毫米。
作為本發明的進一步改進，所述溝道的上下底面沉積一層納米顆粒層或納米纖維層或用于增加細胞與接觸面間摩擦阻力的微納結構。其中，所述納米顆粒層或納米纖維層為納米Ti02、SiO2或者Fe2O3O
作為本發明的進一步改進，對所述上部硬質材料或者下部硬質材料的至少一個表面進行免疫修飾，能夠至少對一種目標細胞進行分子特異性識別。
作為本發明的進一步改進，在所述溝道的入口處，在所述上部硬質材料和下部硬質材料之間塞有厚度為5(Γ200微米厚的鋼片，在所述溝道的出口處，在所述上部硬質材料和下部硬質材料之間塞有厚度為廣50微米厚的鋼片，所述溝道在所述兩塊鋼片之間形成。
作為本發明的進一步改進，所述上部硬質材料和下部硬質材料均為玻璃或者亞克力材料。
解決本發明的技術問題所采用的另一技術方案是提供一種微流體細胞捕獲芯片的制作方法，其包括如下步驟
步驟一、將上部硬質材料和下部硬質材料重疊在一起；
步驟二、在所述上部硬質材料和下部硬質材料重疊的一端塞入厚鋼片并用夾具壓緊，在所述上部硬質材料和下部硬質材料重疊的另一端塞入薄鋼片并用夾具壓緊，從而在所述上部硬質材料和下部硬質材料中間形成楔形溝道；
步驟三、在所述上部硬質材料和下部硬質材料的側邊用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，使人體液體樣本不能從所述上部硬質材料和下部硬質材料的側邊流出；
步驟四、所述楔形溝道的兩端也用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，在厚鋼片處設置通孔以形成所述楔形溝道的入口，在薄鋼片處設置通孔以形成所述楔形溝道的出口，人體液體樣本能從所述楔形溝道的入口流入，并從所述楔形溝道的出口流出。
作為本發明的制作方法的進一步改進，進一步包括步驟五、在所述楔形結構的入口和出口分別插上能使人體液體樣本通過的孔針。
作為本發明的制作方法的進一步改進，厚鋼片的厚度為5(Γ200微米，薄鋼片的厚度為f 50微米。
作為本發明的制作方法的進一步改進，所述溝道的寬度為O. 05 200毫米，長度為I 500毫米。
作為本發明的制作方法的進一步改進，在步驟一中，所述上部硬質材料和下部硬質材料的表面沉積一層納米顆粒層或納米纖維層或有利于增加細胞與接觸面摩擦力的微納結構。其中，所述納米顆粒層或納米纖維層為納米Ti02、SiO2或者Fe203。
作為本發明的制作方法的進一步改進，對所述上部硬質材料或者下部硬質材料的至少一個表面進行免疫修飾，能夠至少對一種目標細胞進行分子特異性識別。
作為本發明的制作方法的進一步改進，對所述至少一個表面進行修飾步驟為步驟一、用無水乙醇配制4%的3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液，將其注滿芯片溝道，在常溫下反應I小時后用無水乙醇沖洗5分鐘；步驟二、用二甲亞砜將蛋白質交聯劑4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯配制成I μ mol/mL的溶液，再將其注入芯片溝道，在常溫下反應 45min后用無水乙醇沖洗5分鐘；步驟三、用磷酸鹽緩沖液配制50 μ g/mL的鏈霉親和素溶液，再將其注入芯片溝道，然后置入4°C冰箱中過夜反應后用pH=7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗5分鐘；步驟四、將上皮細胞黏附因子抗體溶液注入芯片溝道，并在常溫下靜置反應 1-2小時后用PBS將溝道沖洗5分鐘。
作為本發明的制作方法的進一步改進，所述上部硬質材料和下部硬質材料均為玻璃或者亞克力材料。
本發明采用非侵入式方式從患者提取人體液體樣本，將人體液體樣本從微溝道芯片的入口注入，由于微溝道的高度呈楔形分布，目標細胞在溝道中通過時將實現自動分離和富集。本發明的微流體細胞捕獲芯片結構簡單、便于制作、成本低廉，能夠對不同尺寸和具有特異性分子表達的細胞進行快速高效分離、富集。


下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中
圖I為以本發明微流體細胞捕獲芯片的實施例的結構不意圖2為本發明微流體細胞捕獲芯片的縱截面放大示意圖3為本發明微流體細胞捕獲芯片的細胞分離的示意圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
如圖I至圖3所示，本發明的實施例提供了一種微流體細胞捕獲芯片100，用于捕獲微流體細胞200。該微流體細胞捕獲芯片100包括上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20，該上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之間形成有一條溝道30，該溝道具有入口 32和出口 34，該溝道30從入口 32到出口 34的高度由高向低逐漸過渡且呈楔形或者溝道部分區域呈楔形，該溝道最低處接近或小于至少一種目標細胞尺寸。在本實施例中，微流體細胞200為循環腫瘤細胞。在本實施例中，不限于本發明的這些透明玻璃片，這些透明玻璃片可以用透明的硬質材料替代，，例如亞克力材料，并且，上部透明玻璃片和下部透明玻璃片也可以用一個透明的硬質材料和一個不透明的硬質材料替代，也就是說，兩者之中只要其中一個是透明的硬質材料即可。
該溝道30的寬度為O. 05 200毫米，長度為I 500毫米。該上部透明玻璃片 10或者下部透明玻璃片20的至少一個表面可進行表面修飾。對該至少一個表面進行表面修飾步驟為步驟一、用無水乙醇配制4%的3-巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)溶液，將其注滿芯片溝道，在常溫下反應I小時后用無水乙醇沖洗5分鐘；步驟二、用二甲亞砜(DMSO)將蛋白質交聯劑4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯(GMBS)配制成I μ mol/mL的溶液，再將其注入芯片溝道，在常溫下反應45min后用無水乙醇沖洗5分鐘；步驟三、用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制50μ g/mL的鏈霉親和素(SA)溶液，再將其注入芯片溝道，然后置入4°C冰箱6中過夜反應后用PBS (磷酸鹽緩沖液，pH=7. 2-7. 4)溶液清洗5分鐘；步驟四、將上皮細胞黏附因子抗體(Anti-EpCAM)溶液注入芯片溝道，并在常溫下靜置反應1_2小時后用PBS將溝道沖洗5分鐘。在經過表面修飾以后可對至少一種目標細胞進行分子識別的特異性抗體。 在該溝道30的入口 32處，在該上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之間塞有厚度為 50 200微米厚的鋼片40，在該溝道30的出口 34處，在該上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之間塞有厚度為f 50微米厚的鋼片40，該溝道在該兩塊鋼片40之間形成。
本發明實施例提供的一種能夠通過從人體有機液體樣本中分離、富集細胞的微流體細胞捕獲芯片，該微流體細胞捕獲芯片100內的溝道30高度按一定規律變化，且溝道30 上下底面通過特殊處理(即在該溝道上下底面的玻璃表面沉積一層Ti02、Si02或者Fe2O3等納米薄膜或者納米纖維或有利于增加細胞與接觸面摩擦力的微納結構，其厚度為5 200納米)提高目標細胞捕獲效率。本發明的微流體細胞捕獲芯片結構簡單、便于制作、成本低廉， 能夠對不同尺寸和具有特異性分子表達的細胞進行快速高效分離、富集。
本發明的微流體細胞捕獲芯片100以非手動方式分離、富集該細胞。該細胞是基于液體流動在微流體細胞捕獲芯片里自動分離和富集。本發明的微流體細胞捕獲芯片，該細胞至少用一種類型的示蹤物標記識別。本發明采用非侵入式方式從患者提取人體液體樣本，將人體液體樣本從微流體細胞捕獲芯片100的入口 32注入，由于溝道30的高度呈楔形分布，目標細胞在溝道30中通過時將實現自動分離和富集。
本發明還提供了一種微流體細胞捕獲芯片的制作方法，其包括如下步驟
步驟一、將上下兩片透明玻璃片10、20重疊在一起；
步驟二、在兩玻璃片重疊的一端塞入厚度為5(Γ200微米厚的精密鋼片40并用夾具壓緊，在兩玻璃片重疊的另一端塞入厚度為f 50微米厚的精密鋼片并用夾具壓緊，從而在兩玻璃片中間形成楔形溝道30 ；
步驟三、兩玻璃片的側邊用聚二甲基硅氧烷(PDMS)封涂，然后在加熱臺上烘干，使人體液體樣本不能從玻璃片的側邊流出；
步驟四、該楔形溝道的兩端也用聚二甲基硅氧烷封涂烘干，并在兩端打孔，使人體液體樣本能從圖I所示的楔形溝道30的入口 32流入，并從出口 34流出；
步驟五、在圖I所示的楔形溝道30的入口 32和出口 34分別插上能使人體液體樣本通過的孔針，這樣，該微流體細胞捕獲芯片就制作完成了。
實驗原理
(I)如圖I所示，本發明采用楔形溝道結構設計，在兩玻璃片中間形成的溝道的寬度為O. 05 200毫米，溝道長度為10 500毫米的楔形溝道；
(2)本發明的楔形溝道的入口高度為5(Γ200微米，出口高度為f 50微米，當人體液體樣本通過入口流入楔形溝道時，由于流體空間的限制，隨人體液體樣本流入的目標捕獲細胞將在特定的位置卡住；
(3)此實驗的基本思路是將待檢測的患者的人體液體樣本通過本發明的楔形微流體細胞捕獲芯片，最終使不同尺寸的目標細胞在溝道中通過時實現自動分離和富集。
實驗步驟
(I)依據發明的制作方法，制作出帶有圖I所示的微流楔形循環腫瘤細胞捕獲芯片；
(2)將待檢測人體液體樣本從上述芯片的入口注入，并在芯片的出口處收集目標細胞分離后的人體液體樣本；
(3)繼續通過入口加入磷酸鹽緩沖溶液(即PBS溶液，pH=7. 2-7. 4，NaC1137mmol/ L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 I. 4mmol/L)進行清洗；
(4)繼續通過入口選擇加入示蹤物質(如染細胞核的突光染料如DAPI或者 Hoechst染料)或加入免疫試劑，對目標細胞進行識別；
(5)再次通過入口加入PBS進行清洗；
(3)將芯片放置在顯微鏡下觀察捕獲的目標細胞。
實驗效果分析
(I)、如圖2所示，分別選擇區域一、區域二、區域三、區域四中的四個觀測點，可以看到目標細胞在上述芯片中的分離和富集。
(2)、在上述四個區域的四個觀測點觀測到的目標細胞的分布可以看出，目標細胞的分離和富集是由于目標細胞的尺寸和楔形溝道的尺寸相互作用的結果，大尺寸細胞富集在離出口遠處，小尺寸細胞富集在離出口近處。
(3)、本實驗能實現不同尺寸的目標細胞的分離、捕獲，操作簡單，可重復性強。
(4)、本實驗裝置使用的楔形微流體細胞捕獲芯片結構簡單、便于制作、成本低廉， 能夠對不同尺寸和具有特異性分子表達的細胞進行快速高效分離、富集。
本發明采用非侵入式方式從患者提取人體液體樣本，將人體液體樣本從微溝道芯片的入口注入，由于微溝道的高度呈楔形分布，目標細胞在溝道中通過時將實現自動分離和富集。本發明的微流體細胞捕獲芯片結構簡單、便于制作、成本低廉，能夠對不同尺寸和具有特異性分子表達的細胞進行快速高效分離、富集。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。8
權利要求
1.一種微流體細胞捕獲芯片，其包括上部硬質材料和下部硬質材料，所述上部硬質材料和下部硬質材料之間形成有一條溝道，所述溝道具有入口和出口，所述上部硬質材料和下部硬質材料至少一個是透明的材料，其特征在于，所述溝道從入口到出口的高度由高向低逐漸過渡且呈楔形或者溝道部分區域呈楔形，所述溝道最低處接近或小于至少一種目標細胞尺寸。
2.如權利要求I所述的微流體細胞捕獲芯片，其特征在于所述溝道的寬度為O.05 200毫米，長度為I 500毫米。
3.如權利要求I所述的微流體細胞捕獲芯片，其特征在于所述溝道的上下底面沉積一層納米顆粒層或納米纖維層或用于增加細胞與接觸面間摩擦阻力的微納結構。
4.如權利要求3所述的微流體細胞捕獲芯片，其特征在于所述納米顆粒層或納米纖維層為納米Ti02、SiO2或者Fe203。
5.如權利要求I或4所述的微流體細胞捕獲芯片，其特征在于對所述上部硬質材料或者下部硬質材料的至少一個表面進行免疫修飾，能夠至少對一種目標細胞進行分子特異性識別。
6.如權利要求I所述的微流體細胞捕獲芯片，其特征在于在所述溝道的入口處，在所述上部硬質材料和下部硬質材料之間塞有厚度為5(Γ200微米厚的鋼片，在所述溝道的出口處，在所述上部硬質材料和下部硬質材料之間塞有厚度為廣50微米厚的鋼片，所述溝道在所述兩塊鋼片之間形成。
7.如權利要求I所述的微流體細胞捕獲芯片，其特征在于所述上部硬質材料和下部硬質材料均為玻璃或者亞克力材料。
8.一種微流體細胞捕獲芯片的制作方法，其特征在于，其包括如下步驟 步驟一、將上部硬質材料和下部硬質材料重疊在一起； 步驟二、在所述上部硬質材料和下部硬質材料重疊的一端塞入厚鋼片并用夾具壓緊，在所述上部硬質材料和下部硬質材料重疊的另一端塞入薄鋼片并用夾具壓緊，從而在所述上部硬質材料和下部硬質材料中間形成楔形溝道； 步驟三、在所述上部硬質材料和下部硬質材料的側邊用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，使人體液體樣本不能從所述上部硬質材料和下部硬質材料的側邊流出； 步驟四、所述楔形溝道的兩端也用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，在厚鋼片處設置通孔以形成所述楔形溝道的入口，在薄鋼片處設置通孔以形成所述楔形溝道的出口，人體液體樣本能從所述楔形溝道的入口流入，并從所述楔形溝道的出口流出。
9.如權利要求8所述的制作方法，其特征在于進一步包括步驟五、在所述楔形結構的入口和出口分別插上能使人體液體樣本通過的孔針。
10.如權利要求8所述的制作方法，其特征在于厚鋼片的厚度為5(Γ200微米，薄鋼片的厚度為廣50微米。
11.如權利要求8所述的制作方法，其特征在于所述溝道的寬度為O.05 200毫米，長度為I 500毫米。
12.如權利要求8所述的制作方法，其特征在于在步驟一中，所述上部硬質材料和下部硬質材料的表面沉積一層納米顆粒層或納米纖維層或有利于增加細胞與接觸面摩擦力的微納結構。
13.如權利要求12所述的制作方法，其特征在于所述納米顆粒層或納米纖維層為納米 Ti02、SiO2 或者 Fe2O3 =
14.如權利要求8所述的制作方法，其特征在于對所述上部硬質材料或者下部硬質材料的至少一個表面進行免疫修飾，能夠至少對一種目標細胞進行分子特異性識別。
15.如權利要求14所述的制作方法，其特征在于對所述至少一個表面進行修飾步驟為步驟一、用無水乙醇配制4%的3-巰丙基三甲氧基硅烷溶液，將其注滿芯片溝道，在常溫下反應I小時后用無水乙醇沖洗5分鐘；步驟二、用二甲亞砜將蛋白質交聯劑4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯配制成I μ mol/mL的溶液，再將其注入芯片溝道，在常溫下反應45min后用無水乙醇沖洗5分鐘；步驟三、用磷酸鹽緩沖液配制50 μ g/mL的鏈霉親和素溶液，再將其注入芯片溝道，然后置入4°C冰箱中過夜反應后用pH=7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗5分鐘；步驟四、將上皮細胞黏附因子抗體溶液注入芯片溝道，并在常溫下靜置反應1-2小時后用PBS將溝道沖洗5分鐘。
16.如權利要求8所述的制作方法，其特征在于所述上部硬質材料和下部硬質材料均為玻璃或者亞克力材料。
17.一種根據權利要求8-16任意一項制作方法制作出來的微流體細胞捕獲芯片。
全文摘要
本發明涉及一種微流體細胞捕獲芯片，其包括上部硬質材料和下部硬質材料，所述上部硬質材料和下部硬質材料之間形成有一條溝道，所述溝道具有入口和出口，所述上部硬質材料和下部硬質材料至少一個是透明的材料，所述溝道從入口到出口的高度由高向低逐漸過渡且呈楔形或者溝道部分區域呈楔形，所述溝道最低處接近或小于至少一種目標細胞尺寸。本發明還涉及一種微流體細胞捕獲芯片的制作方法。本發明的微流體細胞捕獲芯片結構簡單，便于制作，成本低廉，能夠對不同尺寸和具有特異性分子表達的細胞進行快速高效分離、富集。
文檔編號C12M1/00GK102925337SQ20121044263
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年11月8日
發明者劉侃, 汪勝祥, 張南剛, 周鵬飛 申請人:武漢友芝友生物制藥有限公司